趙澤豐，亢愷雯，年 夢，王 強(qiáng)，喬海法*，錢明成

1.陜西省針?biāo)幗Y(jié)合重點實驗室，咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，咸陽 712046；4.常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，常州 213164

肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，進(jìn)而使得肌肉萎縮[1]。ALS的常見發(fā)病原因之一是超氧化物歧化酶-1(superoxide dismutase 1，SOD1)基因的突變，導(dǎo)致SOD1的錯誤折疊和聚集。錯誤折疊的SOD1與金屬輔因子結(jié)合的能力降低，形成一個功能同源二聚體或激活它的銅伴侶，從而使得患者抗氧化能力減弱而聚集大量活性氧從而造成對神經(jīng)元的氧化損傷[2]。有研究表明，包括依布硒啉等的活性化合物能夠通過與SOD1結(jié)合而穩(wěn)定SOD1的突變體進(jìn)而起到潛在的抗ALS的作用[3]，通過對活性化合物藥效團(tuán)及其與SOD1相互作用位點的研究從而對抗ALS化合物進(jìn)行虛擬篩選有一定的可行性。中醫(yī)認(rèn)為，ALS根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于“痿證”論治，其病機(jī)主要包括肝腎虧虛與髓枯筋痿等，針對這一主證，杜仲作為具有補(bǔ)益脾腎及強(qiáng)筋骨功效的藥味在治療ALS的方劑中被廣泛使用。明代龔?fù)①t用包含杜仲的方劑起痿丹治療腎氣虛腰膝酸痛，行步無力，謝正文的健歩虎潛丸及馬佩涑的類補(bǔ)陽還五湯均用到杜仲，以杜仲為代表的補(bǔ)虛藥歷代治療痿證的使用頻率居于高位[4]。2015年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)收載杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮為正品，現(xiàn)代藥理研究表明，杜仲具有降血壓、降血脂、保肝及保護(hù)神經(jīng)等多種生物活性[5]。

本文運用虛擬篩選的手段，基于藥效團(tuán)分子對接及分子動力學(xué)模擬手段，預(yù)測杜仲中具有潛在SOD1抑制作用的成分及其與該靶標(biāo)的結(jié)合模式，為進(jìn)一步開展針對該藥的實驗研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 杜仲化學(xué)成分收集

通過對在線數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)的檢索，對杜仲中的化學(xué)成分進(jìn)行收集。檢索的在線數(shù)據(jù)庫主要包括：TCMID數(shù)據(jù)庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)[6]以及PubChem數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。收集的化合物信息主要包括化合物的結(jié)構(gòu)名稱及CAS編號，在MM2力場下對所有小分子的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化，建立包含杜仲中所含成分3D結(jié)構(gòu)的化合物庫。

1.2 藥效團(tuán)的構(gòu)建

參照劉廣欣等[7]構(gòu)建藥效團(tuán)的方法，本研究使用Discovery Studio軟件中的Common Feature Pharmacophore Generation 模塊來構(gòu)建基于小分子配體的HipHop藥效團(tuán)模型。從文獻(xiàn)報道中選取與成藥依布硒啉相近的6個具有SOD1抑制活性的小分子化合物作為訓(xùn)練集[2-3,8-10]。見圖1。基于訓(xùn)練集中小分子的共同特征結(jié)構(gòu)比對、疊合、自動生成藥效團(tuán)模型。采用Discovery Studio中的Ligand Profiler模塊，對生成的10個藥效團(tuán)進(jìn)行評價，選取訓(xùn)練集中的化合物以及ZINC數(shù)據(jù)庫中經(jīng)FDA批準(zhǔn)的未見SOD1活性報道的500個非活性化合物作為測試集，對生成的藥效團(tuán)進(jìn)行評估，要求最終所選取的藥效團(tuán)在評分值盡可能高的情況下具有與活性化合物匹配度較高而與非活性化合物匹配度較低的特性。

圖1 訓(xùn)練集化合物的結(jié)構(gòu)

1.3 分子模擬對接研究

采用Discovery Studio中的Flexible Docking模塊，對經(jīng)優(yōu)選藥效團(tuán)匹配得到的化合物進(jìn)行分子模擬對接研究。在PDB(http://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫中，選取RAMU MANJULA等[9]解析的SOD1與活性配體Lig9的復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)(PDB ID：6A9O)作為靶點進(jìn)行后續(xù)研究。隨后將復(fù)合物中的小分子配體抽離，刪去水分子，添加極性氫并修復(fù)不完整殘基后結(jié)合原配體在6A9O中的作用位點生成半徑為10 ?的結(jié)合口袋。將經(jīng)藥效團(tuán)篩選得到的杜仲成分庫中的化合物對接到設(shè)定的活性口袋中，結(jié)合原配體的作用情況，將受體中的Active Site AD4區(qū)域，即F鏈上的殘基LYS 30、TRP 32、SER 98、ILE 99、GLU 100及I鏈上的GLY 33與ASP 96定義為構(gòu)象可旋轉(zhuǎn)的柔性殘基進(jìn)行柔性對接，以CDOCKER interaction energy作為指標(biāo)初步評價小分子配體與受體的結(jié)合情況，并結(jié)合氫鍵及非鍵相互作用分析對接結(jié)果的合理性。

本研究還采用Autodock Vina的柔性對接模塊輔助驗證對接結(jié)果，將處理好的SOD1蛋白以原配體為中心(x=22.543 588,y=223.175 774,z=51.239 740)生成大小為20 ?×20 ?×20 ?的Grid盒子，定義柔性殘基后進(jìn)行對接，以Binding Affinity為評價指標(biāo)評估小分子配體與受體的結(jié)合情況，并與Discovery Studio得到的結(jié)果進(jìn)行比對。

1.4 分子動力學(xué)模擬

參照文獻(xiàn)報道的方法[11]，分子動力學(xué)模擬的操作采用Linux系統(tǒng)GROMACS軟件，在32核心CPU，GTX-1660 GPU加速的服務(wù)器上進(jìn)行運算。采用等溫等壓(NPT)系統(tǒng)以及周期性邊界條件進(jìn)行。將靶點蛋白SOD1、對接評分最高的配體vladinol D(100)及hedyotol C(102)、水及抗衡離子均賦予AMBER力場。采用靜電吸引Particle-Mesh Ewald(PME)算法，截斷距離為1.4 nm，在此體系內(nèi)對蛋白配體復(fù)合物進(jìn)行50 ns的分子動力學(xué)模擬。

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲化合物庫的構(gòu)建

通過對文獻(xiàn)的收集與整理，共得到杜仲中的成分118種，見表1，其中包含以兒茶酸(2)及咖啡酸(8)為代表的酚類成分28種(1～28)；以杜仲醇(29)及杜仲苷Ⅰ(32)為代表的杜仲中的特征性成分環(huán)烯醚萜苷類27種(29～55)；以山柰酚及槲皮素為代表的黃酮類成分23種(56～78)；以《中國藥典》中規(guī)定的杜仲內(nèi)標(biāo)物松脂醇二葡萄糖苷(87)為代表的木脂素類成分27種(79～103)；以白樺脂酸(110)為代表的萜類成分8種(104～111)及其他化合物8種(112～118)。

表1 杜仲成分庫中收錄的化合物信息

表1(續(xù)) 杜仲成分庫中收錄的化合物信息

2.2 藥效團(tuán)的構(gòu)建與評價

用HipHop方法共產(chǎn)生了10個藥效團(tuán)模型，其結(jié)果參數(shù)見表2。評分值參考了訓(xùn)練集分子與藥效團(tuán)模型的匹配度，可以看出生成的10個藥效團(tuán)評分都超過了50分，表明測試集所選的分子共同特征較為明顯。藥效團(tuán)熱圖見圖2。圖2中暖色調(diào)表示藥效團(tuán)對配體響應(yīng)度較高，而冷色調(diào)則表示對配體的響應(yīng)度較低。由表2和圖2可知，由2個氫鍵配體、1個疏水中心及1個芳環(huán)中心構(gòu)成的四點藥效團(tuán)02對于測試集中活性化合物的響應(yīng)度較高，而對于非活性化合物的響應(yīng)值較低，符合本研究對于藥效團(tuán)的要求，故選擇藥效團(tuán)02作為對象進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 10個基于分子共同特征的藥效團(tuán)的結(jié)果參數(shù)

圖2 10個生成的藥效團(tuán)對測試集分子的驗證熱圖

2.3 優(yōu)選藥效團(tuán)對杜仲中抗ALS活性成分的虛擬篩選

將優(yōu)選藥效團(tuán)02與杜仲成分庫匹配后，在FAST模式的構(gòu)象約束條件下，可以匹配到41種成分，將其按照匹配度(Fit value)由高到低排列，選取匹配度最高，即最符合SOD1抑制劑結(jié)構(gòu)特征的6種小分子進(jìn)行進(jìn)一步研究(Fit value>3.4)。初步篩選出的具有潛在研究價值的化合物包括vladinol D(100)、hedyotol C(102)、(+)-pinoresinol(松脂醇，82)、threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether(95)、(-)-olivil(橄欖樹脂素，96)和lariciresinol(落葉松脂醇，98)。其對于藥效團(tuán)的Fit value分別從3.63依次降低至3.41。見圖3?？梢钥闯鼋?jīng)藥效團(tuán)篩選到的潛在SOD1抑制劑的骨架類型均為木脂素類，其中化合物(+)-pinoresinol為雙環(huán)氧木酯素類化合物；threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether屬于新木脂素類化合物；(-)-olivil，lariciresinol及vladinol D均屬于單環(huán)氧型木脂素類化合物；而hedyotol C及hedyotol D屬于倍半木脂素類化合物。表明相較于酚類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類及皂苷類化合物，杜仲中的木脂素化合物可能具有更強(qiáng)的潛在SOD1抑制活性從而起到抗ALS作用。從藥效團(tuán)的匹配結(jié)果可以看出木脂素一側(cè)結(jié)構(gòu)單元中的苯環(huán)能夠滿足藥效團(tuán)中芳香中心的要求，而其側(cè)鏈上的甲氧基等結(jié)構(gòu)能夠提供一定的疏水性，與芳環(huán)的距離能滿足藥效團(tuán)中芳環(huán)中心到疏水中心的距離要求，其中的氧原子也能夠較好地滿足氫鍵受體的要求，能與SOD1結(jié)合口袋中的殘基產(chǎn)生潛在的相互作用。

圖3 最優(yōu)藥效團(tuán)02與6種匹配到的杜仲中潛在活性化合物結(jié)合模式圖

2.4 分子模擬對接結(jié)果

在藥效團(tuán)篩選得到潛在活性化合物后，采用分子模擬對接技術(shù)對篩選得到的化合物與ALS潛在靶點SOD1的相互作用進(jìn)行評估，結(jié)果見圖4。由圖4可見，篩選得到的化合物均與靶點蛋白產(chǎn)生了較好的相互作用。篩選化合物與6A9O關(guān)鍵殘基的相互作用見表3。綜上，分子模擬對接得出的結(jié)果與藥效團(tuán)匹配數(shù)值相近，6種小分子配體與靶點的結(jié)合評分均高于40，表明兩者具有較高的結(jié)合能。而化合物作用的關(guān)鍵殘基也與原配體相近，由PDB數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)可知，原配體與6A9O作用口袋結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵殘基為F鏈上的SER 98、LYS 30、TRP 32以及Ⅰ鏈上的GLY 33等，而杜仲中的6種化合物也不同程度地與上述殘基發(fā)生了相互作用。

圖4 杜仲中6種潛在活性化合物與SOD1靶點的分子對接相互作用模式圖

從對接的結(jié)果可知，由于木脂素類結(jié)構(gòu)含有多個富電子的氧原子，易與SOD1靶點殘基中的供電子基團(tuán)形成氫鍵，其中關(guān)鍵殘基SER 98與化合物100及82產(chǎn)生了潛在的相互作用，而根據(jù)其他藥物蛋白共晶結(jié)果，此殘基為抗癌藥物5-氟尿嘧啶核苷(5?偉cfuorouridine，5-FU)與SOD1的作用位點之一[25]，同樣也是本研究所采用的原配體與SOD1的作用位點；此外關(guān)鍵殘基LYS 30同樣為5-氟尿嘧啶核苷的作用位點，該位點還是中藥活性成分槲皮素及黃岑素與SOD1的關(guān)鍵作用位點，通過突變體驗證及動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，這2種黃酮可以通過與該位點產(chǎn)生相互作用降低原纖維的聚集，從而起到抗ALS作用[26]，該位點與除96外的其余5種化合物均產(chǎn)生了潛在的相互作用；與化合物96作用的關(guān)鍵殘基LYS 3及與化合物100作用的殘基TRP 32也被證明在SOD1中起著重要作用，通過高通量虛擬篩選方法從包含30 000個化合物的庫中得到的活性先導(dǎo)物通過下拉實驗被證明，能夠通過與上述2種殘基發(fā)生相互作用，從而在體外影響SOD1突變體與微管蛋白的蛋白-蛋白相互作用，從而發(fā)揮抗ALS活性[27]，值得一提的是，該研究提出TRP 32中色氨酸與芳香性化合物的π-π電子-電子堆積對于SOD1突變體與微管蛋白的作用有著重要影響，而本研究篩選到的杜仲中的單體化合物102與100也與該殘基存在π-π堆積作用，為這2種化合物的潛在抗ALS活性提供了證據(jù)；多種關(guān)鍵殘基的潛在相互作用證明木脂素類結(jié)構(gòu)作為抗SOD1活性化合物的骨架是合理的。

在杜仲活性化合物中，氫鍵往往在木脂素骨架苯環(huán)4位上羥基(100、102、82、95、96)及2個芳環(huán)之間的呋喃環(huán)(82、96、98)上產(chǎn)生，可見上述位置的取代基對于化合物的活性存在重要的影響。6種化合物的得分由高到低的次序為：100>102>96>95>82>98，總體與藥效團(tuán)匹配順序相符，部分化合物對接結(jié)果與藥效團(tuán)匹配度略有差異，而Autodock Vina給出的結(jié)果的趨勢與Discovery Studio大致相近，得分由高到低的次序為：100>102>95>82>98>96，總體而言，該類化合物與靶標(biāo)具有較好的潛在結(jié)合效果。以評分高低表示活性強(qiáng)弱，大致可以得出初步的構(gòu)效關(guān)系：①木脂素芳環(huán)上多甲氧基取代有利于其與SOD1的潛在相互作用；②呋喃或雙呋喃環(huán)的存在對于其與SOD1的潛在相互作用有著重要作用。而在實際的活性測定過程中，目前尚無篩選得到的6種活性化合物針對ALS或SOD1靶點的報道。針對6種匹配到的潛在活性化合物，更加系統(tǒng)且具有重復(fù)性的實驗有待進(jìn)一步進(jìn)行。

目前關(guān)于木脂素類化合物的SOD1抑制作用尚不明確，有研究表明，木脂素類化合物具有潛在的抗神經(jīng)退行性病變的作用[28]，可為本研究的結(jié)果提供參考，CLAUDIO GIULIANO等[29]從挪威云杉Piceaabies中分離得到木脂素7-hydroxymatairesinol在帕金森模型大鼠中能夠抑制多巴胺能紋狀體的末端變性從而起到抗帕金森病的作用。自五味子中分離得到的木脂素類化合物能夠有效地抑制β淀粉樣蛋白的聚集，通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低乳酸脫氫酶、丙二醛和活性氧的水平，減弱Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷從而具有抗阿爾茨海默病的潛在活性[30]。此外，自細(xì)辛根中分離得到的木脂素類化合物芝麻素被證實具有抗6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的顯著作用[31]，進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，該單體具有調(diào)節(jié)胞外信號、調(diào)節(jié)激酶1/2的瞬時磷酸化以及抑制p38促分裂原活化蛋白和c-Jun持續(xù)磷酸化的作用。

表3 杜仲中6種潛在活性化合物與SOD1靶點的分子對接評價

2.5 分子動力學(xué)模擬結(jié)果

將化合物100、102的對接結(jié)構(gòu)作為初始構(gòu)象，分別進(jìn)行了50 ns的分子動力學(xué)模擬，并繪制均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)變化及均方根波動(root mean square fluctuation，RMSF)。其中RMSD是用于評價分子動力學(xué)模擬過程中當(dāng)前構(gòu)型與初始構(gòu)型變化大小的數(shù)值，是用來評價體系是否達(dá)到平衡的標(biāo)準(zhǔn)，波動越小表示配體與蛋白結(jié)合得越緊密。見圖5。由圖5可知，化合物100及102與SOD1的復(fù)合物體系均在約30 ns后趨于平衡，曲線保持在3 ?范圍內(nèi)合理波動，通過曲線對比可以發(fā)現(xiàn)相較于化合物102，化合物100與SOD1的結(jié)合更為穩(wěn)定，這與分子模擬對接的結(jié)果一致。由RMSF曲線可見，出現(xiàn)較大范圍波動的區(qū)域主要為蛋白鏈上無規(guī)則卷曲的loop區(qū)，例如GLY 138-SER 142，其穩(wěn)定性由于自身結(jié)構(gòu)所致波動較大。2條曲線對比，化合物100的總體波動較小，且在結(jié)合位點周圍的蛋白較總體穩(wěn)定，初步印證了我們關(guān)于分子模擬對接結(jié)果的判斷及化合物102與SOD1的作用強(qiáng)于化合物100，其具有作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步開發(fā)為抗ALS臨床候選的可能性。

圖5 化合物100(粉線)及102(藍(lán)線)與SOD1分子動力學(xué)模擬RMSD(A)及RMSF曲線(B)

3 結(jié)論

藥效團(tuán)、分子模擬對接及分子動力學(xué)模擬是藥物設(shè)計學(xué)中發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)最為重要的幾種手段，將其應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)研究中，能夠降低研究成本，提高研究效率。本研究通過調(diào)研文獻(xiàn)，建立了杜仲中所含成分的化合物庫，基于已報道的具有SOD1抑制活性的化合物構(gòu)建了HipHop藥效團(tuán)模型，并對藥效團(tuán)匹配到的杜仲中的化學(xué)成分進(jìn)行了與SOD1靶點的分子模擬對接，最終發(fā)現(xiàn)了6種具有潛在SOD1抑制活性的化合物，通過分子動力學(xué)模擬對打分位于前2位的化合物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)配體-受體復(fù)合物的穩(wěn)定性與分子模擬對接結(jié)果基本一致。本研究通過提取其類似物的化學(xué)特征建立了藥效團(tuán)并篩選出具有新穎母核的木脂素類化合物作為潛在的SOD1抑制劑，為新型抗ALS藥物的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。包含藥效團(tuán)與分子對接技術(shù)在內(nèi)的虛擬篩選手段被廣泛用于活性先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)中，采用這些手段對包含中藥在內(nèi)的復(fù)雜成分庫進(jìn)行前期篩選，相較于高通量篩選等手段能夠有效降低實驗成本并更高效地發(fā)現(xiàn)候選化合物[32-33]，為進(jìn)一步的基于藥理或藥動學(xué)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供理論依據(jù)。杜仲為陜西省道地藥材之一，從杜仲中發(fā)現(xiàn)對ALS等難治性疾病有治療活性的單體對杜仲資源的開發(fā)、利用與進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化有著重要的意義。隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，相信越來越多的依托于中藥的更為安全有效的健康產(chǎn)品會被用于ALS等疑難雜癥的治療。本研究也具有一定局限性，篩選的化合物并未考慮其含量及制備的難度，且目前ALS驗證模型主要以SOD1表達(dá)缺陷的轉(zhuǎn)基因動物模型為主，驗證具有一定難度，具體的藥效學(xué)及藥動學(xué)特征仍亟待觀察。