楊 靜 陳 娜 崔曉雪

天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化工學(xué)院 天津 300402

黃芩(Scutellaria baicalensis)又名山茶根、黃芩條等，為唇形科植物黃芩的干燥根，屬多年生草本植物，是一種非常常見的傳統(tǒng)中藥[1]。黃芩主要功效有清熱燥濕、消炎抗菌、抗氧化等。黃芩苷作為黃芩的主要有效成分，具有抑菌抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓、抗變態(tài)反應(yīng)等藥理作用，亦被作為黃芩和黃芩制劑的主要質(zhì)量控制指標成分[2]。

黃芩是生產(chǎn)雙黃連口服液、清肺排毒湯的重要中藥材之一?，F(xiàn)階段，黃芩在國內(nèi)的需求量極大，也是出口到國外最多的藥材之一。利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以人工控制營養(yǎng)、溫度、光照等培養(yǎng)條件，不受病蟲害、季節(jié)和地理位置的干擾，獲得質(zhì)量穩(wěn)定的植物細胞有效成分。本文以黃芩實生苗為材料誘導(dǎo)出愈傷組織，通過研究物理因子對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響，建立黃芩細胞懸浮培養(yǎng)體系，為利用細胞大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃芩種子購自河北省安國市藥材市場，黃芩苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所；化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

TCYA ZYSA0351型搖床，202型電熱恒溫干燥箱，BCN-1360型超凈工作臺，Satorius BS 2202S型電子天平，UV-7500紫外分光光度計，HPG-280B強光照培養(yǎng)箱等。

1.3 方法

1.3.1 黃芩無菌苗的獲得

取飽滿的黃芩種子用75%的乙醇溶液浸泡1min，用無菌水沖洗3次，在2%的次氯酸鈉溶液中進行表面消毒20min，再用無菌水沖洗5次。將消毒滅菌的種子接種于添加有0.2mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基上，pH值為5.8，光照16h培養(yǎng)，4～5d種子萌發(fā)，20d后可得長勢良好的試管苗。

1.3.2 黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)

取黃芩試管苗幼嫩莖段，用自來水沖洗干凈，75%的乙醇溶液消毒30s，無菌水沖洗3次，切成0.5cm左右長的小段，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為MS培養(yǎng)基，附加有1.0mg/L6-BA、2.0mg/LNAA、3%蔗糖、1%瓊脂，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為25±1℃，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)大約6周后可得愈傷組織。

1.3.3 黃芩愈傷組織的增殖

挑選生長良好疏松的愈傷組織稱重后進行繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)3次后獲得生長穩(wěn)定、質(zhì)地疏松的黃芩愈傷組織。

1.3.4 不同接種量對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響

將新鮮、疏松連續(xù)繼代3次以上的綠色愈傷組織2g接種到250mL三角瓶中培養(yǎng)，瓶內(nèi)裝50mL附加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液體培養(yǎng)基。接種量分別為2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%，培養(yǎng)基pH值為5.8，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，每組重復(fù)3～4瓶。

1.3.5 光照條件對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響

將新鮮、疏松連續(xù)繼代3次以上的綠色愈傷組織2g接種到250mL三角瓶中培養(yǎng)，瓶內(nèi)裝50mL附加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液體培養(yǎng)基。第一組正常光照/黑暗交替培養(yǎng)(12h/12h)，第二組光照培養(yǎng)24h，第三組用牛皮紙包住三角瓶進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH值為5.8，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，每組重復(fù)3～4瓶。

1.3.6 培養(yǎng)基pH值

導(dǎo)師對研究生的培養(yǎng)傾向于選擇與其科研項目相關(guān)的知識、方法和目標，缺乏對研究生進行系統(tǒng)、全面的專業(yè)知識、科學(xué)方法、科研能力和學(xué)術(shù)道德的培養(yǎng)。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，52%的研究生認為“參與導(dǎo)師的科研項目對自己的科研能力提升程度”有“部分幫助”或者“很少幫助”;73%的研究生認為“導(dǎo)師課題和自己研究興趣的一致程度”“部分一致”或“不一致”。［2］87

將新鮮、疏松連續(xù)繼代3次以上的綠色愈傷組織2g接種到250mL三角瓶中培養(yǎng)，瓶內(nèi)裝50mL附加1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌前pH值分別調(diào)到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，每組重復(fù)3～4瓶。

1.3.7 生物量的測定

取懸浮細胞液置于離心管中，轉(zhuǎn)速8000r/min，離心15min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌細胞2～3次，棄去上清液，稱得到沉淀細胞質(zhì)量，即為細胞鮮重，置于烘箱中60℃干燥7～8h以至恒重，得到的質(zhì)量為細胞干重。細胞干重增殖倍數(shù)=(收獲的細胞干重-接種的細胞干重)/接種的細胞干重。

1.3.8 黃芩苷含量測定

1.3.8.1 樣品溶液的制備

將黃芪細胞培養(yǎng)物50℃下烘干至恒重，用研缽將其研磨成細粉。用95%乙醇溶液對黃芩干細胞粉進行超聲處理，每次20min，提取兩次。混合兩次提取液進行減壓濃縮直至浸膏狀，用95%乙醇溶解定容至50mL，備用。

1.3.8.2 黃芩苷含量測定

用紫外可見分光光度計在最大吸收波長278nm處測定制備好的溶液的吸光度A，根據(jù)標準曲線計算培養(yǎng)液中的黃芩苷含量，另取95%的分析乙醇溶液作空白。

1.3.8.3 標準工作曲線的繪制

精密稱取0.0100g黃芩標準品，用乙醇制成100μg/mL的黃芩苷標準溶液。分別移取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL于5個10mL的容量瓶中，用95%的分析乙醇溶液定容至刻度，充分搖勻，靜置。選擇空白乙醇溶液為參比，用紫外分光光度計測定其278nm處吸光度。選擇吸光度A做縱坐標、黃芩苷含量C為橫坐標得到標準工作曲線(圖1)。標準曲線方程為A=0.5117C+0.0576，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

圖1 黃芩苷標準曲線Fig.1 Standard curve of baicalin

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種量對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響

接種量過小，細胞生長緩慢，培養(yǎng)時間延長；接種量過大，營養(yǎng)物質(zhì)過量消耗，造成培養(yǎng)液溶氧不足，影響產(chǎn)物合成。接種量對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響結(jié)果見表1。隨著接種量的增加，黃芩細胞的鮮重和干重也在增加，當(dāng)接種量在2.5%時得到了黃芩細胞最大的干重增殖倍數(shù)，黃芩苷的合成也達到了最大值58.54μg/g。當(dāng)接種量繼續(xù)增加時，黃芩細胞的干重增殖倍數(shù)開始減小，黃芩苷的合成也急劇下降，表明細胞生長受到了抑制。綜合分析，黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的接種量也不是越多越好，選用2.5%的接種量最好。

表1 接種量對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響Table.1 Effects of different inoculum size on cell suspension culture of Scutellaria baicalensis

2.2 光照條件對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響

部分光照培養(yǎng)、光照24h和暗培養(yǎng)對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響見表2所示。實驗結(jié)果表明：黑暗培養(yǎng)條件下，無論是黃芩細胞生長速率還是黃芩苷的合成速度均顯著高于部分光照和光照培養(yǎng)條件，收獲時黃芩苷含量達59.76μg/g，并且部分光照培養(yǎng)條件下的黃芩苷的含量高于黑暗培養(yǎng)條件。

表2 光照條件對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響Table.2 Effects of light conditions on cell suspension culture of Scutellaria baicalensis

2.3 培養(yǎng)液pH值對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)液pH值對丹參黃芪細胞懸浮培養(yǎng)的影響見表3。當(dāng)pH值較低時，黃芩細胞生長受阻，黃芩苷積累緩慢。當(dāng)培養(yǎng)基pH值大于5.0時，黃芩細胞生長加速，pH值為6.5時，細胞生長速率達到最高。黃芩苷的合成量在pH值為6.0和pH值為6.5培養(yǎng)條件下比較高。綜合分析，pH值為6.0的培養(yǎng)環(huán)境更適合黃芩細胞生長黃芩苷的積累。

表3 培養(yǎng)液pH對黃芩細胞懸浮培養(yǎng)的影響Table.3 Effects of pH on cell suspension culture of Scutellaria baicalensis

3 討論和結(jié)論

影響植物細胞懸浮培養(yǎng)的因素很多，本實驗選取了接種量、pH值、光照條件等三個因素對細胞生長的影響進行分析。在最適合的接種量下細胞可以迅速適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的條件開始正常繁殖。顧長海等[3]研究接種量對黃芩細胞生長的影響中得出接種量為1.0g/30mL條件下，最適合其生長，并且黃芩苷含量最高。其研究結(jié)果與本實驗略有差別，可通過更加細化的接種量來做進一步實驗進行驗證。

培養(yǎng)基pH值可以影響細胞膜電荷的變化，影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝途徑中酶的活性。郭紫娟等[4]試驗表明，白背三七懸浮細胞可以通過自身不斷調(diào)節(jié)代謝活動改變培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度，從而影響次生代謝產(chǎn)物的合成。姜鴻運等[5]在進行水飛薊細胞懸浮培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值小于6.0或高于7.5時，懸浮細胞嚴重褐化幾乎不生長。pH值在6.0～7.0時，懸浮細胞增長量隨著pH值的增加而增加；在pH值為7.0時，細胞增長量最大，達到8.68g，并且生長狀態(tài)良好，顏色為淡黃色。

光是植物生長發(fā)育的重要物理因子，它可通過提供能量或觸發(fā)光感受器，調(diào)控植物細胞生長發(fā)育、形態(tài)建成和次生代謝產(chǎn)物的合成[6]。鐘春水等[7]試驗結(jié)果表明黑暗是肌醇促進金花茶懸浮細胞生長的適宜條件。白木香懸浮細胞在黑暗培養(yǎng)下生長緩慢，在1500Lux的光照強度下，光照黑暗交替培養(yǎng)時，細胞的活力最高，細胞鮮重、生長密度分別較黑暗的提高了54.86%和52.94%，較24h光照的分別提高了33.09%和38.30%[8]。從本實驗結(jié)果可以看到黑暗培養(yǎng)條件下進行，黃芩苷合成達到最大，與白木香的實驗結(jié)果保持一致。

本文選取接種量、光照條件和pH值等3個因素進行分析，并以培養(yǎng)過程中細胞生長和黃芩苷含量變化為主要指標，探討以上因素對于黃芩次生代謝的可能影響。由單因素實驗結(jié)果分析可知，采用接種量2.5%，培養(yǎng)基初始pH值為6.0，黑暗條件下培養(yǎng)，最適于黃芩苷的積累，這為我們后續(xù)進一步開展黃芩懸浮細胞大規(guī)模培養(yǎng)提供了依據(jù)。