王艷明 羅 波 黃 磊 （武漢市武昌醫(yī)院，武漢科技大學附屬武昌醫(yī)院感染性疾病科，武漢 430063）

肝癌是受多種因素影響的發(fā)病于肝臟的惡性腫瘤，是導致世界范圍內癌癥性相關疾病死亡的第二主要原因，通常分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，其中原發(fā)性肝癌比較常見，主要有肝區(qū)疼痛、乏力、消瘦、進行性肝腫大等不良癥狀，發(fā)展到后期會導致肝腎衰竭、肝癌破裂出血等，對患者的生命安全造成威脅［1-2］。早期診斷方法不足、生存率較低等原因導致我國肝癌發(fā)病率較高，因此探究能夠抑制肝癌細胞增殖及遷移的靶向分子對肝癌的臨床治療具有重要意義［3］。miRNA 是內源性非編碼小分子RNA，在調控基因表達方面發(fā)揮重要作用，與癌癥等許多疾病密切相關，并參與細胞增殖、遷移等多種生物學進程［4-5］。多項研究顯示miR-299-5p 在結直腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中低表達，miR-299-5p表達上調可顯著抑制腫瘤細胞的增殖及遷移［6-7］。梅博升等［8］研究發(fā)現(xiàn)，虎眼萬年青皂苷類提取物能通過上調肝癌細胞中miR-299-5p 等多種miRNAs 的表達作用于肝癌細胞的增殖分化及凋亡過程，但關于miR-299-5p 對肝癌細胞增殖及遷移作用的影響及相關機制研究較少。資料顯示人類Krüppel 樣因子3（human Krüppel like factor 3，KLF3）含有同源鋅指結構，能與DNA 中含有GC 的區(qū)域結合，在肺癌中表達增高，KLF3 基因敲除可抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，但關于KLF3 在肝癌細胞中的作用并不明確［9］。因此，本研究通過體外細胞實驗探究miR-299-5p 對肝癌細胞增殖、遷移的調控及其與KLF3 的關系，為肝癌的診斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 HL-7702 人正常肝細胞株及Hep3B、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L 人肝癌細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000 Reagent（貨號：11668-027）購于美國Invitrogen；RIPA 裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（貨號：P0013C、P0027、P0009）購于上海碧云天公司；細胞凋亡雙染試劑盒（貨號：BB-4101）購于貝博生物；RNA 提取試劑盒、CCK-8 試劑盒、青鏈霉素混合液、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液（貨號：R2220、CA1210、P1400、11011-8611、31600）購于北京索萊寶科技有限公司；KLF3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Bax、Bcl-2、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、GAPDH 抗體、羊抗兔IgG（貨號：ab154531、ab13847、ab32503、ab321124、ab92536、ab76003、ab8245、ab150077）購于英國Abcam。

1.1.3 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱（型號：MCO-15AC）購于日本SANYO；倒置顯微鏡（型號：TS100）購于日本Nikon；細胞計數(shù)器（型號：NC-100）購于丹麥Chemimetec；PCR 儀（型號：simpliamp）購于美國ABI；流式細胞儀（型號：Accuri C6）購于美國BD；酶標儀（型號：XElx800）購于美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HL-7702、Hep3B、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L 細胞株置于37 ℃水浴鍋中快速融化，轉移至特定離心管，懸浮接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過程均用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組及pcRNA 轉染 收集對數(shù)生長期的HepG2 肝癌細胞，以4×106個/ml接種于6 孔板，每孔2 ml，待細胞貼壁后分為空白對照組、陰性對照組、miR-299-5p 組、miR-299-5p+pc-KLF3 組，按照轉染試劑盒說明書轉染，陰性對照組轉染陰性mimic，miR-299-5p 組轉染miR-299-5p mimic，miR-299-5p+pc-KLF3 組共轉染miR-299-5p mimic 及pc-KLF3，轉染結束后于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h，PBS 洗滌2次后加入含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，收集各組HepG2 肝癌細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR 檢測肝癌細胞中miR-299-5p 表達 參照RNA 提取試劑盒說明書提取肝癌細胞、正常肝細胞、1.2.2中各組細胞的總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書反轉錄得到cDNA。miR-299-5p 正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGTTTACCGTCCCAC-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATGTATGT-3'；內參U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'?？偡磻w系為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，H2O 8 μl，正反向引物各0.5 μl，10× cDNA 模板1 μl。反應條件設定為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸50 s，共40 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。根據(jù)2?ΔΔCt算法分析各肝癌細胞、正常肝細胞、1.2.2 中各組細胞miR-299-5p表達量。實驗重復3次。

1.2.4 熒光素酶報告試驗 采用TargetScan 數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/vert_71/）分析預測miR-299-5p 與KLF3 的靶向作用位點，構建野生型（WT）和突變型（MUT）基因靶點KLF3 的3'-UTR 熒光素酶表達載體，分別轉染至陰性對照組和miR-299-5p 組HepG2 肝癌細胞，轉染后48 h 測定熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.2.5 CCK-8 法檢測HepG2 肝癌細胞增殖情況 取各組HepG2 細胞，以5×106個/孔接種于96 孔板，分別在轉染0 h、12 h、24 h、48 h 后，每孔加入CCK-8試劑10μl 和9 μl 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。于全自動酶標儀中檢測每孔細胞的吸光度值。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞術檢測HepG2 肝癌細胞凋亡情況 參考文獻［10］采用Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒測定細胞凋亡，各組HepG2細胞采用胰蛋白酶消化，消化結束后調整細胞密度為1×106個/ml，轉移至無菌1.5 ml EP 管，經(jīng)PBS 清洗、70%乙醇溶液4 ℃固定過夜、PBS 溶液清洗后離心并重懸細胞，依次加入2μl RNA酶、1μl Triton X-100，靜置45 min后加入2 μl PI 溶液染色1 h，于流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.7 Transwell 小室實驗檢測HepG2 肝癌細胞侵襲能力 收集各組HepG2細胞，調整細胞濃度至2×105個/ml，取200 μl 細胞液加入預鋪設好的Transwell 小室上室，以RPMI1640 培養(yǎng)液補至1 ml，下室加入600μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后擦拭未過膜的細胞，置于4%多聚甲醛中固定20 min，室溫條件下風干，采用1%結晶紫染液浸染20 min，室溫條件下風干，于光學顯微鏡下觀察小室細胞侵襲情況。隨機取6 個視野，計算穿過Matrigel 基質的平均細胞數(shù)［11］。實驗重復3次。

1.2.8 劃痕實驗檢測HepG2肝癌細胞遷移能力 收集各組HepG2 細胞，將細胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪滿板內85%左右時，以200 μl 槍頭垂直于6 孔板底部做直線劃痕，然后將細胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)24 h 后，倒置光學顯微鏡下拍照（×100）觀察，利用Image J 軟件測量劃痕區(qū)域寬度，并計算細胞劃痕愈合率［12］。實驗重復3次。

1.2.9 Western blot 檢測 采用Western blot 檢測1.2.2 中各組細胞KLF3、細胞凋亡相關因子相關蛋白的表達，RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定細胞中總蛋白含量，采用SDSPAGE 分離蛋白，半干轉膜法將蛋白轉移至硝酸纖維膜，5% 脫脂牛奶封閉，于4 ℃下添加KLF3、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 兔抗鼠一抗與GAPDH（1∶500）孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌后添加二抗（辣根過氧化物酶綴合的二抗，1∶5 000）常溫下孵育2 h。采用蛋白成像凝膠儀對KLF3、凋亡相關蛋白（Caspase-3、Bax、Bcl-2）、遷移相關蛋白（MMP-2、MMP-9）水平進行半定量分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 以SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較行LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人肝癌細胞株中miR-299-5p表達水平比較 與HL-7702 細胞相比，Hep3B、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L 細胞中miR-299-5p 表達水平顯著降低（P<0.05），其中HepG2 細胞株中miR-299-5p 表達水平最低，選取HepG2 細胞株進行后續(xù)實驗（表1）。

表1 人肝癌細胞株中miR-299-5p表達水平比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of miR-299-5p expression level in human hepatoma cell lines（±s，n=3）

表1 人肝癌細胞株中miR-299-5p表達水平比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of miR-299-5p expression level in human hepatoma cell lines（±s，n=3）

Note：Compared with HL-7702 cell line，1）P<0.05.

miR-299-5p/U6 1.01±0.15 0.50±0.071）0.61±0.091）0.21±0.031）0.49±0.071）0.45±0.061）Cell line HL-7702 Hep3B HuH-7 HepG2 SMMC-7721 MHCC97-L

2.2 各組HepG2 細胞中miR-299-5p 及KLF3 蛋白表達水平比較 與空白對照組相比，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細胞中miR-299-5p表達水平顯著升高（P<0.05），KLF3 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細胞中KLF3 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖1、表2。

表2 各組HepG2細胞中miR-299-5p及KLF3蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of miR-299-5p and KLF3 protein expression levels in HepG2 cells of each group（±s，n=3）

表2 各組HepG2細胞中miR-299-5p及KLF3蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of miR-299-5p and KLF3 protein expression levels in HepG2 cells of each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with miR-299-5p group，2）P<0.05.

KLF3/GAPDH 1.15±0.17 1.18±0.19 0.33±0.031）0.66±0.051）2）34.002 0.000 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 F P miR-299-5p/U6 0.94±0.13 0.97±0.14 1.89±0.301）1.74±0.281）14.667 0.001

圖1 各組HepG2細胞中KLF3蛋白表達情況Fig.1 Expression of KLF3 protein in HepG2 cells of each group

2.3 miR-299-5p與KLF3的靶向關系預測及驗證 TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測結果顯示，miR-299-5p 在KLF3 3'-UTR區(qū)有相應的結合位點（圖2）；熒光素酶報告實驗結果顯示，與KLF3 WT+陰性對照組相比，KLF3 WT+miR-299-5p 組HepG2 細胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），KLF3 MUT+陰性對照組與KLF3 MUT+miR-299-5p 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 熒光素酶報告實驗檢測miR-299-5p 與KLF3 的靶向作用關系（±s，n=3）Tab.3 Relationship between miR-299-5p and KLF3 by luciferase reporter assay（±s，n=3）

表3 熒光素酶報告實驗檢測miR-299-5p 與KLF3 的靶向作用關系（±s，n=3）Tab.3 Relationship between miR-299-5p and KLF3 by luciferase reporter assay（±s，n=3）

Note：Compared with KLF3 WT+negative control group，1）P<0.05.

Relative luciferase activity 1.02±0.16 0.57±0.081）1.03±0.16 1.01±0.15 67.939 0.000 Groups KLF3 WT+negative control KLF3 WT+miR-299-5p KLF3 MUT+negative control KLF3 MUT+miR-299-5p F P

圖2 miR-299-5p與KLF3的3'-UTR區(qū)序列相互結合Fig.2 Interaction between miR-299-5p and 3'-UTR region of KLF3

2.4 各組HepG2 細胞增殖情況比較 與空白對照組、陰性對照組相比，miR-299-5p 組HepG2 細胞增殖能力在24 h和48 h時顯著下降（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細胞增殖能力在48 h時顯著提高（P<0.05）。見表4、圖3。

圖3 各組HepG2細胞增殖情況比較Fig.3 Comparison of proliferation of HepG2 cells in each group

表4 各組HepG2細胞增殖情況比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of proliferation of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

表4 各組HepG2細胞增殖情況比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of proliferation of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with miR-299-5p group，2）P<0.05.

48 h OD 1.01±0.13 0.96±0.11 0.65±0.071）0.83±0.082）7.690 0.010 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 F P 0 h OD 0.35±0.02 0.36±0.01 0.33±0.03 0.38±0.02 2.889 0.102 12 h OD 0.53±0.04 0.51±0.05 0.49±0.04 0.53±0.03 0.667 0.596 24 h OD 0.80±0.09 0.78±0.08 0.60±0.061）0.77±0.07 4.465 0.040

2.5 各組HepG2 細胞凋亡情況比較 與空白對照組、陰性對照組相比，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細胞凋亡率、Caspase-3、Bax 蛋白表達顯著升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3 組細胞凋亡率、Caspase-3、Bax 蛋白顯著降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見圖4、5、表5。

表5 各組HepG2細胞凋亡情況比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of apoptosis of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

表5 各組HepG2細胞凋亡情況比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of apoptosis of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with negative control group，2）P<0.05；compared with miR-299-5p group，3）P<0.05.

Bcl-2/GAPDH 1.03±0.12 1.02±0.11 0.31±0.041）2）0.74±0.081）2）3）39.710 0.000 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 Apoptosis rate（%）11.08±1.17 10.97±1.15 28.42±4.371）2）15.91±2.561）2）3）28.559 0.000 Caspase-3/GAPDH 0.93±0.11 0.97±0.11 1.87±0.211）2）1.32±0.161）2）3）24.199 0.000 Bax/GAPDH 1.01±0.12 0.98±0.11 1.90±0.231）2）1.41±0.181）2）3）19.896 0.000 F P

圖4 各組HepG2細胞凋亡情況比較Fig.4 Comparison of apoptosis of HepG2 cells in each group

圖5 各組HepG2細胞凋亡相關因子蛋白表達情況比較Fig.5 Comparison of protein expressions of apoptosis related factors in HepG2 cells of each group

2.6 各組HepG2 細胞侵襲及遷移情況比較 與空白對照組、陰性對照組相比，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 細胞侵襲細胞數(shù)及劃痕愈合率、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與miR-299-5p 組相比，miR-299-5p+pc-KLF3組肝癌細胞侵襲細胞數(shù)及劃痕愈合率、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著提高（P<0.05）。見表6、圖6~8。

表6 各組HepG2細胞侵襲及遷移情況比較（±s，n=3）Tab.6 Comparison of invasion and migration of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

表6 各組HepG2細胞侵襲及遷移情況比較（±s，n=3）Tab.6 Comparison of invasion and migration of HepG2 cells in each group（±s，n=3）

Note：Compared with blank control group，1）P<0.05；compared with negative control group，2）P<0.05；compared with miR-299-5p group，3）P<0.05.

MMP-9/GAPDH 0.97±0.12 1.01±0.14 0.31±0.041）2）0.72±0.081）2）3）29.569 0.000 Groups Blank control Negative control miR-299-5p miR-299-5p+pc-KLF3 Number of invasive cells（n）142.60±25.02 143.00±25.13 66.58±10.111）2）93.42±12.601）2）3）11.338 0.003 Wound healing rate（%）25.66±2.37 26.12±2.43 9.08±1.161）2）20.11±1.841）2）3）46.395 0.000 F P MMP-2/GAPDH 1.02±0.12 0.98±0.11 0.26±0.061）2）0.73±0.081）2）3）40.140 0.000

圖6 各組HepG2細胞侵襲情況比較Fig.6 Comparison of invasion of HepG2 cells in each group

圖7 各組HepG2肝癌細胞遷移情況比較Fig.7 Comparison of migration of HepG2 cells in each group

圖8 各組HepG2細胞遷移相關蛋白表達Fig.8 Expressions of migration related proteins of HepG2 cells in each group

3 討論

miRNA 是進化保守性的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于生物體細胞及組織中，通過調控基因表達參與肝癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生、分化及轉移，肝癌發(fā)病機制復雜，研究表明miRNA 表達異?？捎绊懜伟┘毎脑鲋?、凋亡、侵襲和轉移等生物學過程［13］。miR-299-5p是miRNA家族成員，研究表明miR-299-5p在胃癌患者組織中低表達，可作為腫瘤標志物診斷胃癌的發(fā)生［14］；miR-299-5p 在頭頸部鱗狀細胞癌中也呈低表達［15］。本研究結果顯示，與正常肝細胞株相比，肝癌細胞中miR-299-5p 表達水平顯著降低，提示miR-299-5p 可能在某種程度上參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展。因涉及轉染實驗，故選取miR-299-5p表達水平較低的HepG2肝癌細胞進行后續(xù)實驗。

KLF 家族是真核生物的一類基礎轉錄因子，目前在人類基因組中識別出18 種KLFs，分別為KLF1~18［16］。KLF 家族具有調節(jié)富含CACCC 和GC啟動子基因表達作用，在細胞增殖、分化、凋亡、脂肪形成、腫瘤生成、轉移等過程中發(fā)揮重要作用［17］。研究表明miR-1224 在肺癌組織中低表達，miR-1224表達上調后可通過與KLF3 的3'-UTR 區(qū)結合下調KLF3表達，進而抑制肺癌細胞的增殖和凋亡［18］。轉染實驗結果顯示，miR-299-5p 組及miR-299-5p+pc-KLF3 組HepG2 肝癌細胞中miR-299-5p 表達水平顯著高于空白對照組，KLF3蛋白表達水平顯著低于空白對照組，表明miR-299-5p 具有下調KLF3 表達的作用，可能與肝癌細胞的增殖、遷移等生物學行為存在一定聯(lián)系。miRNA 常結合到靶基因的3'-UTR區(qū)，從而調控靶基因功能，通過查閱TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測KLF3 是miR-299-5p 的潛在靶基因，熒光素酶報告實驗結果驗證miR-299-5p 過表達能顯著下調野生型KLF3-3'UTR 熒光素酶活性，表明在肝癌細胞中miR-299-5p 可直接作用于KLF3 的3'-UTR區(qū)，進而調控KLF3的基因表達。

正常的細胞增殖、凋亡存在動態(tài)平衡，癌細胞的增殖、凋亡抵抗、侵襲、遷移等均是腫瘤細胞重要的惡性生物學行為，受細胞周期等多種機制調控［19］。李楠等［20］和郭令飛等［21］研究發(fā)現(xiàn)miR-299-5p 過表達可顯著抑制胃癌細胞增殖活力，并促進胃癌細胞凋亡。本研究結果顯示，過表達miR-299-5p 可顯著抑制HepG2 細胞的增殖活性，誘導其凋亡，并顯著降低其侵襲及遷移能力。細胞凋亡相關因子（Caspase-3、Bax、Bcl-2）在腫瘤細胞及正常細胞中表達水平不同，測定這些因子的表達水平可反映細胞凋亡情況［22］。細胞遷移相關因子（MMP-2、MMP-9）與癌細胞的浸潤、轉移密切相關［23］。本研究結果顯示，過表達miR-299-5p可顯著提高Caspase-3、Bax蛋白表達水平，降低Bcl-2、MMP-2、MMP-9 表達水平，QIAN 等［24］研究顯示，miR-1204 可通過抑制DEK 表達促進肺癌細胞凋亡，并顯著降低Bcl-2 表達，提高Bax 表達，PENG 等［25］研究發(fā)現(xiàn)miR-1301-3p 通過靶向ICT1 促進乳腺癌細胞凋亡，并下調Bcl-2 表達，上調Bax表達，與本研究結果類似，表明miR-299-5p可能通過其他信號通路調控肝癌細胞的增殖及遷移活性，因此仍需深入研究。

綜上所述，過表達miR-299-5p 可降低HepG2 肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，促進HepG2 細胞凋亡，可能與miR-299-5p 作用于KLF3 有關，但肝癌細胞增殖機制復雜，仍需深入研究。