郭偉勝 付利然 趙 林 魏光亞 張 娟

（河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院普外二區(qū)，鄭州 450000）

胃癌是世界范圍內常見疾病，是癌癥死亡的第二大常見原因，全世界每年約有100 萬新增胃癌病例［1］。目前胃癌在外科手術、放射治療、化療和新輔助治療方面取得了巨大進展，早期胃癌患者五年生存率可達到90%以上，但由于早期確診率較低，多數患者為晚期胃癌［2-3］。因此，尋找胃癌發(fā)生發(fā)展中的生物標志物，對胃癌診斷和治療具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在發(fā)育和基因表達中發(fā)揮精確調控功能，參與X 染色體沉默、表觀遺傳學修飾、轉錄激活/干擾、核內運輸等多種細胞調控過程［4-6］。近年越來越多研究表明，lncRNA 在腫瘤進展中通過轉錄調控基因表達，參與調節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移、上皮-間質轉化等過程［7］。如乳腺癌中l(wèi)ncRNA HOTAIR 通過miR-20a-5p/HMGA2 軸調控腫瘤細胞凋亡與侵襲［8］；lncRNA-MEG3 通過p53 信號通路抑制胃癌增殖和轉移［9］。細胞周期蛋白依賴性激酶19（cyclindependent kinase 19，CDK19）的基因產物屬于細胞周期蛋白依賴性激酶家族成員，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期和轉錄的關鍵調控因子，具有調控細胞周期、啟動DNA 合成及調控細胞轉錄等功能，在細胞增殖、分化中發(fā)揮重要作用，其功能失調常引起基因異常表達，與胃癌、乳腺癌、前列腺癌、急性粒細胞白血病等惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后相關［10-11］。頭頸部鱗狀細胞癌中，CDK19 高表達與腫瘤局部復發(fā)、淋巴結轉移、遠端轉移及總生存期明顯縮短相關［12］。CDK19 的核表達在前列腺癌轉移性腫瘤進展過程中增加，TCGA 表達數據聚類分析發(fā)現前列腺癌中CDK19 高表達與侵襲性增強和總生存期縮短有關［13］。但目前關于CDK19 在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程的作用知之甚少，故本文將研究CDK19在胃癌中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃正常黏膜上皮細胞GSE-1（CRL-1658）購自ATCC；人胃癌細胞系SGC-7901（CL-0206）、MGC-803（CL-0158）、NCI-N87（CL-0169）購自Procell 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自凱基生物技術股份有限公司；胰酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；胎牛血清購自Hyclone 公司；總RNA 提取試劑、Prime script RT、qPCR 試劑均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；qPCR 引物由擎科生物技術有限公司合成；CCK-8 試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；Cytotoxicity Detection KitPLUS（LDH）購自Merck 公司；細胞凋亡檢測試劑盒（FITC-Annexin ⅤApoptosis Detection kit Ⅱ）購自BD 公司；載體構建及病毒包被由漢恒生物科技有限公司負責；Lipo‐fectamine2000 購自日本TaKaRa 公司；一抗GAPDH（ab8245）、CDK19（ab168633）均購自Abcam 公司；羊抗鼠IgG 二抗和羊抗兔IgG 二抗均購自CST 公司；ECL試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 LDH 法測定NK 細胞殺傷敏感性 效應細胞為健康志愿者外周血單個核細胞中分離的NK 細胞，Control、sh-NC、sh-CDK19 組細胞為靶細胞，設置效靶比為20∶1。收集相應組別細胞，加樣至反應板，吹打均勻，500 g 室溫離心3 min，使效靶細胞混勻；6 h 后檢測NK 細胞對靶細胞的殺傷作用?；诒壬ǖ腖DH測定法計算殺傷率，酶標儀檢測450 nm處吸光度（A），根據說明書計算細胞活性。

1.2.2 細胞轉染 細胞傳代生長12 h 后，胰酶消化、計數，1×104個/孔接種于12孔板，貼壁培養(yǎng)24 h，采用Lipofectamine2000 試劑分別轉染pcDNA-Con‐trol、pcDNA-CDK19、miR-222-3p inhibitor、sh-CDK19等至靶細胞，轉染48 h 后熒光顯微鏡觀察轉染效果，qPCR和Western blot檢測各組細胞轉染效率。

1.2.3 qPCR 檢測目的基因mRNA 表達 TRIzol 法提取細胞總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，Nanodrop3000 測定RNA 濃度與純度，1 μg RNA 被逆轉錄為cDNA，逆轉錄產物稀釋3倍，qPCR反應體系（20 μl）為：2 μl 稀釋后的逆轉錄產物、10 μl SYBR Green Mix、正反向引物（10 μmol/L）各0.4μl、7.2μl ddH2O。95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)后終延伸完成PCR。2?ΔΔCt法計算目的基因表達。以ACTB、U6為內參，引物序列見表1，實驗獨立重復3次。

表1 qPCR引物Tab.1 Primer sequences of qPCR

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達 收集目的組別細胞，預冷PBS 洗滌，胰酶消化3 min，置于新的EP管，800 g 離心4 min，棄上清，PBS 洗滌2 次，加入全細胞裂解液冰上裂解10 min，4 ℃、14 000 r/min 離心10 min，收集細胞總蛋白，BCA 顯色法測定蛋白濃度。每組樣品取40μg 蛋白進行SDS-PAGE，濕轉法轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，次日PBST洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌，加入ECL化學發(fā)光液顯影。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期胃癌MGC-803、NCI-N87 細胞，1×105個/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)12 h，分別轉染sh-NC、sh-CDK19，培養(yǎng)24 h，胰酶消化，預冷PBS 洗滌2 次，800 g 離心5 min，加入200μl Annexin Ⅴbinding 緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC 混勻，避光孵育15 min，加入5 μl PI 混勻避光孵育5 min，上機檢測細胞凋亡。單染的PI和Annexin Ⅴ-FITC調節(jié)補償。

1.2.6 CCK-8 檢測細胞增殖 嚴格參照CCK-8 實驗手冊將各組細胞以2 000 個/孔接種于96 孔板，90 μl/孔，設置6 個平行孔作為重復。0 h、24 h、48 h、72 h 時，10 μl/孔添加CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測 靶細胞轉染嵌合熒光素酶報告基因質粒，預冷PBS洗滌，裂解緩沖液裂解，13 000 g 離心5 min，收集上清，按照制造商說明進行雙熒光素酶測定。轉染效率通過海腎熒光素酶的共表達進行標準化。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行數據分析，GraphPad 7.0 軟件制圖。所有實驗獨立重復3 次，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CDK19在胃癌組織及細胞系中高表達 TCGA數據庫分析結果顯示，與癌旁正常組織相比，CDK19在胃癌組織中顯著高表達（P<0.01，圖1A）。胃癌患者總生存期結果顯示，CDK19 低表達組患者總生存周期更長（P=0.035，圖1B）。GEO 數據庫分析GSE26889、GSE13911 結果顯示，與癌旁正常組織相比，胃癌組織中CDK19 呈顯著高表達（P<0.000 1，圖1C）。qPCR 結果顯示，胃癌細胞系SGC-7901、MGC-803、NCI-N87 中CDK19 表達顯著高于正常人胃上皮細胞GES-1（圖1D）。Western blot 結果顯示，胃癌細胞系中CDK19 蛋白表達顯著高于正常胃上皮細胞（圖1E）。GEPIA2 數據庫分析發(fā)現，與胃癌一致，CDK19 在膽管癌、彌漫性大B 細胞淋巴瘤、腎透明細胞癌、急性髓細胞樣白血病、腦低級別膠質瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胸腺癌中異常高表達，而在宮頸鱗癌和腺癌、腎嫌色細胞癌、卵巢漿液性囊腺瘤、睪丸癌中異常低表達（圖1F）。提示CDK19在胃癌患者及細胞系中異常高表達，且低表達CDK19的胃癌患者生存期更長。

圖1 CDK19在胃癌組織及細胞系中高表達Fig.1 CDK19 is overexpressed in gastric cancer tissues and cell lines

2.2 下調CDK19 表達對胃癌細胞增殖、凋亡和NK細胞殺傷敏感性的影響 CCK-8 結果顯示，胃癌細胞系MGC-803、NCI-N87 中下調CDK19 表達可顯著抑制細胞增殖（P<0.01，P<0.01，圖2A）。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，胃癌細胞系MGC-803 和NCI-N87中下調CDK19表達顯著提高細胞凋亡水平（圖2B）。NK 細胞殺傷能力檢測結果顯示，CDK19表達下調顯著提高NK細胞對胃癌細胞系MGC-803、NCI-N87 的殺傷能力（P<0.05，P<0.01，圖2C）。表明下調CDK19 表達可促進MGC803、NCI-N87 細胞凋亡，抑制細胞增殖，提高NK 細胞對胃癌細胞的殺傷能力。

圖2 下調CDK19 表達對胃癌細胞增殖、凋亡和NK 細胞殺傷敏感性的影響Fig.2 Effects of down-regulating CDK19 on prolifera?tion，apoptosis and NK cell killing sensitivity of gastric cancer cells

2.3 CDK19 通過IL-6、IL-8 調控NK 細胞殺傷敏感性 抗體CHIP 分析結果顯示，NCI-N87 細胞中敲低CDK19 后，IL-6、IL-8 表達顯著下降（圖3A）。qPCR結果顯示，敲低CDK19 后NCI-N87 細胞IL-6、IL-8 mRNA 水平顯著降低（P<0.001，P<0.01，圖3B）。NK細胞殺傷能力檢測顯示，IL-8作用于MGC-803細胞后NK細胞殺傷敏感性降低，IL-6和IL-8同時作用NK 細胞后殺傷敏感性進一步下調，同樣在NCI-N87細胞中加入IL-6、IL-8 均可下調NK 細胞殺傷敏感性，IL-6 和IL-8 同時作用可進一步下調NK 細胞對NCI-N87 的殺傷敏感性（圖3C）。進一步分別在MGC-803 和NCI-N87 細胞中加入anti-IL-6、anti-IL-8或anti-IL-6+anti-IL-8，NK 細胞殺傷敏感性顯著提高，同時加入anti-IL-6 和anti-IL-8 時NK 細胞殺傷敏感性大幅度提高（圖3D）。胃癌細胞系MGC-803 和NCI-N87 中sh-CDK19 組NK 細胞殺傷敏感性顯著高于sh-NC 組，當加入IL-6、IL-8 或同時加入兩者均明顯下調Sh-CDK19組NK細胞殺傷敏感性（圖3E），表明在胃癌細胞中下調CDK19表達可抑制IL-6和IL-8表達，IL-6 和IL-8 可降低NK 細胞對MGC-803 和NCI-N87 細胞的殺傷敏感性，anti-IL-6 和anti-IL-8 可增強NK 細胞對MGC-803 和NCI-N87 細胞的殺傷敏感性。

圖3 CDK19通過IL-6、IL-8調控NK細胞殺傷敏感性Fig.3 CDK19 regulates NK cell killing sensitivity through IL-6 and IL-8

2.4 CASC2 在NCI-N87 細胞中通過miR-222-3p 調控CDK19 表達 RT-PCR 結果顯示，胃癌細胞系NCI-N87 中，sh-CASC2 組miR-18a-5p mRNA 水平與sh-NC組無差異，而CDK19 mRNA水平顯著低于sh-NC組（P<0.01，圖4A）。Western blot 結果顯示，相比于WT組和sh-NC組，sh-CASC2組NCI-N87細胞CDK19蛋白表達顯著降低（圖4B）。RT-PCR 結果顯示，在NCI-N87 細胞中敲低CASC2，miR-222-3p 水平顯著提高（P<0.001，圖4C），miR-222-3p inhibitor 組比對照組有更高的CDK19蛋白及mRNA 表達（P<0.001，圖4D）。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，相比于對照組，miR-222-3p inhibitor 組細胞CDK19 基因表達顯著降低（P<0.01，圖4E）。表明在胃癌細胞NCI-N87 中敲低CASC2 可顯著下調CDK19 mRNA及蛋白表達，上調miR-222-3p表達；敲低miR-222-3p可明顯上調CDK19 蛋白及mRNA 水平，且直接調控CDK19基因轉錄。

圖4 CASC2 在NCI-N87 細胞中通過miR-222-3p 調控CDK19表達Fig.4 CASC2 regulates CDK19 expression through miR-222-3p in NCI-N87 cells

2.5 CDK19 對NK 細胞殺傷敏感性的影響受CASC2 和miR-222-3p 調控 NK 細胞殺傷敏感性實驗結果顯示，以胃癌細胞系NCI-N87為研究對象，相對于sh-NC 組，sh-CASC2 組NK 細胞殺傷敏感性顯著增強，而sh-CASC2+OE CDK19 組NK 細胞殺傷敏感性低于sh-CASC2 組，與sh-NC 組差異無統(tǒng)計學意義（圖5A）。同時，miR-222-3p inhibitor 組NK 細胞殺傷敏感性較對照組顯著降低，miR-222-3p inhibi‐tor+shCDK19組NK細胞殺傷敏感性高于miR-222-3p inhibitor組，但與對照組差異無統(tǒng)計學意義（圖5B）。表明敲低CASC2 可增強NCI-N87 細胞的NK 細胞殺傷敏感性，在此基礎上過表達CDK19 則抑制該效應，抑制miR-222-3p 可降低NCI-N87 細胞的NK 細胞殺傷敏感性，而抑制miR-222-3p 同時過表達CDK19則NK細胞殺傷敏感性無變化。

圖5 CDK19 對NK 細胞殺傷敏感性的影響受CASC2 和miR-222-3p調控Fig.5 Effect of CDK19 on NK cell killing sensitivity is regulated by CASC2 and miR-222-3p

3 討論

胃癌是一種高發(fā)病率和高病死率的惡性腫瘤，目前仍是全球癌癥死亡的第二大原因［14］。由于胃癌早期癥狀不明顯，多數患者發(fā)現時已是晚期，因此新的生物標志物研究對降低胃癌發(fā)病率和致死率十分關鍵。細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin depen‐dent kinases，CDKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期和轉錄的關鍵調控因子［15］。CDK19已被證明通過調節(jié)轉錄因子磷酸化、活性和翻轉從而影響細胞穩(wěn)態(tài)發(fā)育［16-17］。越來越多的研究表明，CDK19 在腫瘤中也發(fā)揮關鍵作用，在頭頸部鱗狀細胞癌研究中發(fā)現，與原發(fā)性腫瘤相比，CDK19 在局部復發(fā)和遠處轉移的腫瘤組織中高表達，且高表達CDK19 的原發(fā)性腫瘤患者無病生存期明顯縮短［12］。CDK19 在前列腺癌中過表達與腫瘤侵襲相關［13］。通過對腫瘤組織的免疫組化檢測發(fā)現，CDK19 蛋白核易位在腫瘤轉移進程中增加，且通過TCGA 表達數據分析發(fā)現，CDK19 高表達與侵襲性增強、無病生存期縮短高度相關。體外實驗表明，通過敲低CDK19 或采用CDK19 抑制劑治療可顯著抑制腫瘤遷移和凋亡。本研究表明，CDK19 在胃癌患者及細胞系中異常高表達，與既往研究結論一致，高表達CDK19 的患者總生存期顯著縮短。細胞增殖實驗表明，在胃癌細胞系MGC-803 和NCI-N87 中敲低CDK19 可顯著抑制腫瘤細胞生長；凋亡分析發(fā)現，敲低CDK19 亦可促進腫瘤細胞凋亡。表明CDK19高表達促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，在胃癌進程中發(fā)揮關鍵作用。

NK 細胞在宿主抵抗感染和腫瘤免疫中起重要作用。多種細胞外部受體和內部信號參與NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷功能。介體復合體的細胞周期蛋白依賴激酶CDK19被認為參與NK 細胞介導的腫瘤免疫過程。研究表明，SMAC 模擬物BI-8382 增加了NK 細胞數，且與CDK19抑制劑BI-1347聯用可大幅增強NK 細胞毒性，從而在小鼠EMT6乳腺癌模型中產生強烈的協同抗腫瘤作用［18］。研究發(fā)現，腫瘤相關單核/巨噬細胞通過TGF-β1 損害NK 細胞的效應器功能［19］。本研究發(fā)現，CDK19 高表達抑制了NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，在MGC-803 和NCI-N87 細胞中敲低CDK19 可顯著增強NK 細胞殺傷敏感性。食管鱗癌研究發(fā)現，腫瘤細胞分泌的IL-6和IL-8通過STAT3途徑損害了NK細胞功能［20］。本研究發(fā)現，在NCI-N87 細胞中敲低CDK19 可顯著抑制IL-6 和IL-8 表達，進一步研究發(fā)現，IL-6 和IL-8可明顯抑制MGC-803 和NCI-N87 細胞的NK 細胞殺傷敏感性，而IL-6 抗體和IL-8 抗體可有效增強MGC-803、NCI-N87 的NK 細胞殺傷敏感性。表明在胃癌細胞中，CDK19 高表達增強了IL-6、IL-8 表達，進而損傷NK細胞的腫瘤殺傷能力。lncRNA一般通過miRNA間接參與腫瘤發(fā)展進程，通過對CDK19上游分析發(fā)現，lncRNA CASC2 通過調節(jié)miR‐18a‐5p/CDK19促進乳腺癌紫杉醇耐藥，下調CDK19表達在異種移植MCF-7/PTX 細胞小鼠中抑制腫瘤生長［21］。本研究發(fā)現，在NCI-N87 細胞中敲低CASC2 后，CDK19 mRNA 及蛋白表達明顯下降，但miR-18-5p表達差異無統(tǒng)計學意義。本課題組通過miRDB 網站預測了與CDK19相互作用的miRNA，選取評分最高的9 個miRNA 進行檢測，發(fā)現敲低CASC2 后，miR-222-3p 表達顯著升高，當在NCI-N87細胞中敲低miR-222-3p 后，CDK19 mRNA 及蛋白表達顯著提高。雙熒光素酶報告檢測證實了miR-222-3p 與CDK19 的靶向關系。最后在NCI-N87 中敲低CASC2，發(fā)現其對NK 細胞的殺傷敏感性顯著提高，當敲低CASC2 的同時過表達CDK19，NK 細胞殺傷敏感性則與未處理組相比無明顯變化；在NCI-N87細胞中敲低miR-222-3p 時NK 細胞殺傷敏感性顯著降低，在敲低CASC2 同時過表達CDK19，NK 細胞殺傷敏感性則與未處理組相比無明顯變化。由此可知，CDK19 受CASC2 和miR-222-3p 調控進而影響NK細胞殺傷敏感性。

綜上，CDK19 在胃癌腫瘤組織及細胞系中異常高表達，受上游lncCASC2/miR-222-3p 調控，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，且促進IL-6、IL-8 表達，進而抑制胃癌NK細胞殺傷敏感性。