譚建福 饒麗娟 （南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，長沙 410004）

子宮肌瘤是女性高發(fā)的非惡性腫瘤疾病，由子宮平滑肌增生導(dǎo)致，30~50 歲女性是高發(fā)人群，患者臨床主要以腹部疼痛及月經(jīng)量增多為主［1］。流行病調(diào)查顯示，子宮肌瘤發(fā)病率占女性腫瘤的50%以上，被稱為婦科第一瘤［2］。子宮肌瘤影響因素較多，包含雌激素和性激素等，同時受局部多肽類物質(zhì)影響，在生育期產(chǎn)生，絕經(jīng)期腫瘤病灶逐漸萎縮。文獻證實，子宮肌瘤雖然不會導(dǎo)致患者死亡，但臨床疼痛及其他癥狀會影響患者身心健康及生存質(zhì)量［3］。Wnt 信號通路參與子宮肌瘤產(chǎn)生及發(fā)展，主要通過調(diào)節(jié)β-catenin 磷酸化和降解，導(dǎo)致β-catenin在細胞核內(nèi)聚集，與受體結(jié)合時，細胞質(zhì)中的β-catenin移位到細胞核中進而激活靶基因。相關(guān)研究表示，Wnt信號通路抑制劑能夠通過減少子宮肌瘤細胞中細胞質(zhì)和細胞核中β-catenin 表達進而下調(diào)與通路相關(guān)的靶基因［4］。因此，了解Wnt 信號通路在子宮肌瘤中的作用對臨床研究具有重要意義。

中藥在抗腫瘤研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用，枸杞歸肝腎經(jīng)，性微寒無毒，味甘、平，具有滋腎、明目等功效。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞的主要成分，能夠通過增加淋巴細胞功能提高免疫功能，具有抗氧化、抗腫瘤的作用［5］。目前對子宮肌瘤細胞的研究文獻較少，因此，本文以此作為創(chuàng)新點，觀察LBP 對子宮肌瘤細胞生物活性、Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 選擇2019年1月至2020年1月，在南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院婦產(chǎn)科室進行子宮肌瘤剔除術(shù)的10 例患者，平均年齡（43.50±1.50）歲，術(shù)前未經(jīng)全身治療，將子宮肌瘤組織置于青鏈霉素的預(yù)冷D-Hanks 溶液中保存，后進行實驗室分離培養(yǎng)子宮肌瘤細胞。

1.1.2 實驗動物、藥品、主要試劑與儀器 健康SD大鼠30只購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，SPF 級，雌性未孕。LBP（含量50%，批號：2014 1208）購自寧夏宏德生物技術(shù)；DMEM 培養(yǎng)基購自中國深圳市百恩維生物；胎牛血清購自加拿大Hy‐clone公司；Wnt5b和β-catenin抗體購自Abcam；MTT試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）購自上海研謹生物科技；TRIzol 購自北京柏萊斯特科技。蛋白電泳儀購自北京由萊普特科學(xué)儀器；RT-PCR 試劑盒和儀器購自上?？道噬锟萍?。

1.2 方法

1.2.1 子宮肌瘤大鼠建模及藥物干預(yù) 30 只健康SD大鼠，隨機分為5組：對照組、模型組、LBP低劑量組、中劑量組和高劑量組每組6只。除對照組外，其余各組大鼠肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，每周3 次，共12 周，繼而肌內(nèi)注射黃體酮注射液5 mg/kg，每周2 次，共4 周，大鼠子宮重量、子宮系數(shù)明顯提高，子宮平滑肌形態(tài)紊亂，子宮形態(tài)學(xué)改變類似于人體子宮肌瘤病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，提示造模成功，對照組在相同時間給予等量生理鹽水。造模結(jié)束后，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠分別給予10、50和100 mg/kg LBP灌胃，1次/d，連續(xù)14 d，對照組和模型組大鼠相同時間內(nèi)給予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 大鼠子宮系數(shù)計算 實驗結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，分離大鼠子宮，稱量，計算子宮系數(shù)，子宮系數(shù)（%）=子宮重量/體質(zhì)量×100%。

1.2.3 人子宮肌瘤組織分離及子宮肌瘤細胞培養(yǎng) 將保存的子宮肌瘤組織中瘤核去除，預(yù)冷DHanks 溶液清洗表層血污，剪切成小塊放入離心管中，15%消化液消化，水浴后搖晃消化，連續(xù)5 次，每隔1 h 收集濾液（200 目過濾），將離心機調(diào)整至3 000 r/min離心5 min，棄上清，預(yù)冷D-Hanks溶液沉淀檢測存活率。細胞培養(yǎng)：放入培養(yǎng)基中制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，生長至85%~90%融合時，1∶3傳代，取對數(shù)細胞進行實驗。

1.2.4 細胞分組及藥物干預(yù) 取對數(shù)生長細胞，細胞密度為5×105個/ml，將細胞隨機分為4 組：子宮肌瘤組、低LBP 組、中LBP 組和高LBP 組，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。藥物干預(yù)：子宮肌瘤組加入等量的生理鹽水，低、中、高LBP 組分別加入100、200、400 μg/ml的LBP，連續(xù)干預(yù)72 h。

1.2.5 MTT 法檢測子宮肌瘤細胞存活率 傳代方法將子宮肌瘤細胞以5×105個/ml 接種至96 孔板，更換含1%牛血清的培養(yǎng)基中同步消化后，每組設(shè)6個復(fù)孔，均加入5 mg/ml 的MTT 溶液20 μl，培養(yǎng)24 h、48 h 及72 h 后，棄培養(yǎng)液，每孔中加入50μl DMSO，搖勻后放入490 nm 波長下檢測OD 值，取3 次平均值，細胞存活率（%）=［A加藥?A凋零］/［A對照?A凋零］×100%。

1.2.6 流式細胞儀檢測子宮肌瘤細胞凋亡率 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以0.125%胰蛋白酶消化后，置于PBS 溶液，予以洗滌，將離心機調(diào)整為3 000 r/min 離心5 min后，收集100μl細胞懸液后進行重懸，5 μl 的FITC AnnexinⅤ與5 μl PI 混合后染色，無光條件下，孵育15 min 后注入400 μl 結(jié)合緩沖液混勻，洗滌3次后記錄細胞凋亡情況。

1.2.7 Transwell 小室檢測子宮肌瘤細胞遷移和侵襲 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以50 mg/L 的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37 ℃下呈凝膠狀態(tài)，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，拭去殘留細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，計算子宮肌瘤侵襲細胞數(shù)。

1.2.8 Western blot 檢測子宮肌瘤細胞Wnt5b 和β-catenin 蛋白表達 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以0.125%胰蛋白酶消化，高速離心后，保留血清樣本。進行電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS 沖洗，5 min/次，分別加入兔抗人單克隆抗體Wnt5b、β-catenin 和GAPDH 抗體（1∶500），二抗（1∶2 000），分別雜交，PBS 沖洗3 次。將膜浸入ECL 工作液進行檢測，獲取圖像。

1.2.9 qRT-PCR 檢測子宮肌瘤細胞Wnt5b 和β-catenin mRNA 5×105個/ml 子宮肌瘤細胞以0.125%胰蛋白酶消化，沖洗后置于無菌試管中，提取RNA，75%乙醇離心，?80 ℃保存。將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，加入Wnt5b和β-catenin抗體，內(nèi)參采用β-actin，60 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性，72 ℃退火，各30 s，95 ℃延伸，5 min，循環(huán)次數(shù)以40 次為準，2?ΔΔCt方法計算各組肺組織中Wnt5b 和β-catenin mRNA 相對表達水平，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 研究數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件分析，計量資料以±s表示，3 組及以上比較方差分析（單因素方法分析、重復(fù)測量方差分析），兩組比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮系數(shù)比較 與對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量降低，子宮重量、子宮系數(shù)提高（P<0.05），與模型組相比，低、中及高劑量組大鼠子宮重量、子宮系數(shù)均降低，體質(zhì)量增加，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of rats uterine coefficients in each group（±s，n=6）

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of rats uterine coefficients in each group（±s，n=6）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs LBP low-dose group；4）P<0.05 vs LBP medium-dose group.

Groups Weight/g Uterine weight/g Control Model LBP low-dose LBP medium-dose LBP high-dose F Pe 332.05±26.35 268.25±18.551）296.33±21.501）2）0.580±0.121 1.478±0.4151）1.350±0.3351）2）Uterine coefficient（%）0.176±0.043 0.580±0.1101）0.430±0.0951）2）290.27±19.661）2）3）1.189±0.3051）2）3）0.383±0.0861）2）3）0.371±0.0901）2）3）4）3.711<0.001 285.20±24.051）2）3）4）4.667 0.006 1.022±0.2261）2）3）4）8.241 0.001

2.2 CCK-8檢測各組子宮肌瘤細胞存活率 CCK-8檢測結(jié)果顯示：低、中、高LBP 組24 h、48 h及72 h子宮肌瘤存活率均低于子宮肌瘤組（P均<0.05），子宮肌瘤組在24 h、48 h 及72 h 時差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），低、中、高LBP 組在24 h細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其余時間點均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），見表3、圖1。

圖1 各組子宮肌瘤細胞存活率Fig.1 Survival rate of uterine fibroids in each group

表3 各組子宮肌瘤細胞存活率比較（±s）Tab.3 Comparison of cell survival rate of uterine fi?broids in each group（±s）

表3 各組子宮肌瘤細胞存活率比較（±s）Tab.3 Comparison of cell survival rate of uterine fi?broids in each group（±s）

Note：1）P<0.05 vs uterine fibroids group；2）P<0.05 vs low LBP group；3）P<0.05 vs middle LBP group.

72 h 96.21±2.05 48.10±5.011）32.15±2.071）2）19.60±3.571）2）3）583.200<0.001 Groups Uterine fibroids LBP low-dose LBP medium-dose LBP high-dose F P 24 h 95.60±2.33 71.20±3.051）68.02±4.771）66.30±4.401）79.220<0.001 48 h 96.60±2.05 59.02±4.111）50.20±3.661）2）45.04±2.331）2）3）326.800<0.001

2.3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：低、中、高LBP 組子宮肌瘤凋亡率分別為（15.48±1.20）%、（26.37±2.33）%及（42.37±4.12）%，均高于子宮肌瘤組［（4.58±0.20）%，F(xiàn)=205.000，P均<0.05］，低、中、高LBP 組兩兩相比子宮肌瘤細胞凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測子宮肌瘤細胞凋亡率Fig.2 Flow cytometry to detect apoptosis rate of uterine fibroids

2.4 Transwell 檢測各組子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目 Transwell 小室結(jié)果顯示：低、中、高LBP 組子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目均低于子宮肌瘤組（均P<0.05），低、中、高LBP 組兩兩相比子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目均有差距（P均<0.05），見圖3。

圖3 各組子宮肌瘤細胞侵襲數(shù)目比較Fig.3 Comparison of number of uterine fibroids cell inva?sion in each group

2.5 各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平比較 Western blot 結(jié)果顯示：子宮肌瘤組細胞中Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平表達均高于低、中、高LBP 組（均P<0.05），低、中、高LBP 組Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b 和β-catenin 蛋白水平比較Fig.4 Comparison of Wnt5b and β-catenin protein levels in uterine fibroids in each group

2.6 qRT-PCR 檢測各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b 和β-catenin mRNA表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示：子宮肌瘤組細胞中Wnt5b和β-catenin mRNA相對表達量高于低、中及高LBP 組（P均<0.05），低、中、高LBP組Wnt5b 和β-catenin mRNA 相對表達量逐漸降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

圖5 各組子宮肌瘤細胞中Wnt5b和β-catenin mRNA比較Fig.5 Comparison of Wnt5b and β-catenin mRNA in uterine fibroids in each group

3 討論

既往研究證實能夠通過干擾內(nèi)源激素水平提高子宮肌瘤細胞凋亡率，改善病情。按照隋·巢元方在《諸病源候論》中記載，中醫(yī)認為子宮肌瘤的產(chǎn)生與“寒濕不調(diào)，飲食失節(jié)及臟氣相搏”相關(guān)，利用中藥材治療子宮肌瘤已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點［6］。LBP 是一種生物活性物質(zhì)，為枸杞進行提取純化而獲得，為淡黃色纖維狀固體，可輔助用于多種中藥制劑發(fā)揮作用［7］。本文通過建立子宮肌瘤大鼠模型，采用10、50 和100 mg/kg 的LBP 灌胃，14 d后發(fā)現(xiàn)大鼠子宮腫瘤及系數(shù)降低，體質(zhì)量增加，說明LBP 能夠通過減少腫瘤體積而降低子宮重量。黃霞等［8］體外培養(yǎng)人肝癌HepG2 細胞株，采用LBP干預(yù)72 h 時能夠顯著抑制細胞活性，加快凋亡，且存在濃度依賴性，證實LBP 具有抗腫瘤功效。本研究從子宮肌瘤病理組織中分離和培養(yǎng)子宮肌瘤細胞，無菌操作，制備出重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的子宮肌瘤細胞。

子宮肌瘤是主要由平滑肌演變細胞分裂產(chǎn)生的良性腫瘤，細胞增殖是子宮肌瘤形成的影響因素。子宮肌瘤細胞生長受多種生長信號通路調(diào)節(jié)，通過改變子宮肌瘤細胞中遺傳因子而降低抑制腫瘤生長信號的活性，子宮肌瘤細胞增殖失控［9-10］。實驗了解到子宮肌瘤細胞孕激素表達上調(diào)，能夠抑制線粒體凋亡信號Bcl-2水平，發(fā)現(xiàn)其水平升高可能是子宮肌瘤細胞增殖的主要原因。凋亡是細胞最顯著的生物學(xué)特征，細胞受到內(nèi)在基因調(diào)控時主要發(fā)生自殺的現(xiàn)象，但細胞凋亡失控時能夠誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生［11］。子宮肌瘤細胞存在凋亡抑制，因此，增加其凋亡率對于改善病情具有一定作用。子宮肌瘤細胞侵襲是指從原發(fā)部位將周圍組織浸潤的過程，王一飛等［12］證實子宮肌瘤細胞存在侵襲性，主要由MMPs 激活發(fā)揮細胞外基質(zhì)降解作用，該過程是腫瘤細胞發(fā)生侵襲的基礎(chǔ)條件。中藥因其來源廣泛的特點在治療子宮肌瘤中發(fā)揮主要作用。LBP能夠顯著改善大鼠子宮組織病理，下調(diào)血清性激素水平，證實具有治療子宮肌瘤的作用［13］。本研究表明LBP 能夠降低子宮肌瘤細胞生物活性，凋亡率隨著LBP濃度升高而增加，侵襲數(shù)目降低，存在濃度依賴性，且與LBP 藥物干預(yù)子宮肌瘤組細胞存在差異。證實LBP 能夠抑制子宮肌瘤細胞生物活性。王曉麗等［14］表示，在子宮內(nèi)膜損傷動物模型中，采用LBP干預(yù)后，子宮內(nèi)膜組織損傷改善，雌激素水平降低，證實其具有保護子宮和卵巢作用。本研究表明LBP可抗子宮肌瘤細胞增殖，加快凋亡其機制可能在于通過調(diào)節(jié)p53、Bcl-2、Bax 表達而發(fā)揮作用。代海平等［15］表示LBP 在AS 動物模型中具有抑制MMP-2 和血管生成因子的作用。本研究推測LBP 發(fā)揮抗子宮肌瘤細胞侵襲的作用可能是通過改變子宮肌瘤細胞基質(zhì)降解能力實現(xiàn)。

在正常細胞中，Wnt信號通路表達沉默，當(dāng)受到癌基因調(diào)節(jié)活化，能夠?qū)е履[瘤細胞生長失控而促進腫瘤形成。經(jīng)典信號通路中Wnt 能夠結(jié)合β-catenin 蛋白的核易位活化靶向目標的轉(zhuǎn)錄活性，而發(fā)揮促癌作用［16］。在子宮肌瘤組織中存在Wnt信號通路表達異常，在對Wnt 信號通路進行關(guān)節(jié)基因篩查時發(fā)現(xiàn)，Wnt5b、β-catenin 水平升高而在正常組織中無表達。Wnt5b 存在于細胞質(zhì)中，參與胚胎發(fā)育及疾病生理發(fā)展。瞿秋紅等［17］和張瀟迪等［18］研究子宮肌瘤組織檢測Wnt5b 呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。β-catenin 是一種存在細胞膜中的蛋白，發(fā)揮細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，在子宮肌瘤細胞中能夠激活Wnt信號，游離的β-catenin 表達上調(diào)，惡化病情。槲皮素能夠通過下調(diào)宮頸癌細胞Wnt5b 和β-catenin 表達水平，從而減少子宮肌瘤細胞生物活性［19］。說明外源性干預(yù)能夠通過抑制Wnt5b 和β-catenin 含量而改善病情。LBP對于Wnt/β-catenin信號通路的研究在不同疾病中作用不同，在腦缺血再灌注實驗大鼠空腹注射LBP 后能夠上調(diào)Wnt/β-catenin 表達而改善病情［20］。本文研究與之不同，可能與疾病類型及LBP廣泛的藥理作用相關(guān)。本文研究發(fā)現(xiàn)低、中及高LBP 組Wnt5b 和β-catenin 含量均低于子宮肌瘤組，說明LBP 能夠降低Wnt5b 和β-catenin 表達改善疾病。研究機制可能在于LBP 能夠上調(diào)子宮肌瘤某種抑癌基因，降低性激素水平，對Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮抑制作用，而降低子宮肌瘤細胞活性。

本研究存在局限性，實驗時間及經(jīng)費受限，采用的實驗方法較為單一，動物實驗樣本量較小，未采用藥物對照組，結(jié)果存在一定的局限性，后期本課題組會加強和其他相關(guān)研究單位合作，細化實驗內(nèi)容，為子宮肌瘤的臨床研究提供參考依據(jù)。綜上所述：LBP能夠降低子宮重量及系數(shù)，抑制子宮肌瘤細胞活性，LBP濃度和凋亡呈正相關(guān)，其研究機制可能與抑制Wnt5b/β-catenin信號通路相關(guān)。