安 寧 周 賢 張曉霞 楊 濤 許美霞

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉與危重病研究所，武漢 430022）

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其不僅是膿毒癥發(fā)生時(shí)受損的靶細(xì)胞，而且是炎癥反應(yīng)和繼發(fā)器官損傷的積極參與者［1-3］。因此，阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的損傷將可能改變膿毒癥的進(jìn)程。Kv1.5蛋白是電壓依賴性氧敏感鉀離子通道，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，其生理功能不僅局限于心肌細(xì)胞膜電位的維持，也與細(xì)胞的增殖、凋亡等多個(gè)病理生理過程有關(guān)［4-6］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Kv1.5 蛋白參與氧化低密度脂蛋白（OxLDL）、H2O2等誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［7-8］。因此，本研究通過建立膿毒癥動(dòng)物模型，給予Kv1.5 蛋白通道特異性阻滯劑DPO-1（diphenyl phosphine oxide-1）干預(yù)后，觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及氧化損傷情況，探討Kv1.5 蛋白通道阻滯劑DPO-1 對LPS 誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 成年清潔級SD 雄性大鼠80 只，體質(zhì)量（200±20）g，購于華中科技大學(xué)動(dòng)物研究所。LPS及DPO-1 購于美國Sigma 公司；內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1（Endocan）、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、IL-6、IL-1β 及TNF-α試劑盒購于中國上海玉博生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于北京寶賽生物技術(shù)生物有限公司；脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與分組 SD 大鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h 開始禁食，實(shí)驗(yàn)前4 h 禁水。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只。Control組：尾靜脈注射0.9%Nacl溶液；LPS組：尾靜脈注射5 mg/kg LPS（等滲NaCl溶液稀釋至1 ml）制造大鼠膿毒癥模型；LPS+DPO-1 1組：先腹腔注射0.3 mg/kg DPO-1，30 min 后尾靜脈注射5 mg/kg LPS；LPS+DPO-1 2 組：先腹腔注射3 mg/kg DPO-1，30 min 后尾靜脈注射5 mg/kg LPS。各組大鼠均在自然光下繼續(xù)飼養(yǎng)6 h。

1.2.2 Western blot 檢測Kv1.5 蛋白表達(dá)情況 采集大鼠胸主動(dòng)脈于裂解緩沖液。用Brd Frad 法測定蛋白濃度。提取的蛋白依次進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和孵育（加入一抗在4 ℃下孵育過夜），加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h，ECL顯影。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況 大鼠取胸主動(dòng)脈約2 cm，剝?nèi)?nèi)膜，70%乙醇固定，制備單細(xì)胞懸液，按照Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測各組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡率。

1.2.4 ELISA 法檢測Endocan、VCAM-1、vWF 及炎癥因子表達(dá)量 大鼠眶后靜脈取血，分離血清，按照ELISA 試劑盒方法檢測各組Endocan、VCAM-1、vWF及血清炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α表達(dá)量。

1.2.5 比色法檢測SOD、MDA 及MPO 含量 取大鼠胸主動(dòng)脈，加入0.9%Nacl，用電動(dòng)勻漿器制備組織勻漿。勻漿過程于冰水中進(jìn)行。按照試劑盒說明書操作檢測SOD、MDA及MPO含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料以±s表示，采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kv1.5 蛋白在大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)情況 Kv1.5 蛋白在Control 組及LPS 組均存在表達(dá)，LPS組相對蛋白表達(dá)水平為1.042±0.021，與Control組比較，LPS 組Kv1.5 蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01，圖1）。

圖1 大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Kv1.5蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Expression of Kv1.5 protein in rats aortic endothe?lial cells

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況 與Control 組比較，LPS 組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率［（42.29±1.19）%］明顯上升（P<0.01），而LPS+DPO-1 1 組及LPS+DPO-1 2 組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率分別為（40.24±1.25）%、（29.68±1.34）%，較LPS 組降低（P<0.01，圖2）。

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of rat aortic endothelial cells in each group

2.3 各組大鼠血清Endocan、VCAM-1 及vWF 表達(dá)情況 與Control 組比較，LPS 組血清內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Endocan、VCAM-1 及vWF 水平明顯升高（P<0.05）；與LPS組比較，LPS+DPO-1 1組及LPS+DPO-1 2 組大鼠血清內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Endocan、VCAM-1 及vWF 水平降低（P<0.05），且這一效應(yīng)隨DPO-1 劑量增加而加強(qiáng)（表1）。

表1 各組大鼠血清Endocan、VCAM-1、vWF 表達(dá)情況（ng/ml，±s，n=20）Tab.1 Expressions of Endocan，VCAM-1 and vWF of rats in each group（ng/ml，±s，n=20）

表1 各組大鼠血清Endocan、VCAM-1、vWF 表達(dá)情況（ng/ml，±s，n=20）Tab.1 Expressions of Endocan，VCAM-1 and vWF of rats in each group（ng/ml，±s，n=20）

Note：1）P<0.05 vs Control group；2）P<0.05 vs LPS group.

vWF 11.87±0.69 41.80±1.211）40.68±1.372）27.24±1.392）Groups Control LPS LPS+DPO-1 1 LPS+DPO-1 2 Endocan 0.128±0.017 0.871±0.0441）0.837±0.0642）0.521±0.0622）VCAM-1 8.14±0.71 66.82±4.451）63.39±3.852）46.15±2.492）

2.4 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α水平變化 與Control 組比較，LPS 組血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平明顯升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+DPO-1 1組及LPS+DPO-1 2組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平降低（P<0.05，表2）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平（±s，pg/ml，n=20）Tab.2 Expressions of IL-6，IL-1β and TNF-α of rats in each group（±s，pg/ml，n=20）

表2 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平（±s，pg/ml，n=20）Tab.2 Expressions of IL-6，IL-1β and TNF-α of rats in each group（±s，pg/ml，n=20）

Note：1）P<0.05 vs Control group；2）P<0.05 vs LPS group.

TNF-α 58.42±6.49 141.81±7.461）115.37±8.622）80.97±8.852）Groups Control LPS LPS+DPO-1 1 LPS+DPO-1 2 IL-6 50.63±4.40 214 5.39±144.171）180 9.28±157.002）100 7.16±194.642）IL-1β 23.07±1.18 924.39±72.381）634.83±58.002）279.10±30.062）

2.5 各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮組織SOD、MDA 及MPO含量變化 LPS 組較對照組MDA 、MPO 含量上升，SOD 活性降低（P<0.05），而LPS+DPO-1 1 組及LPS+DPO-1 2組較LPS 組MDA、MPO 含量下降，SOD 活性上升（P<0.05，表3）。

表3 各組大鼠內(nèi)皮組織SOD、MDA、MPO含量（±s，n=20）Tab.3 Expression of SOD，MDA and MPO in each group（±s，n=20）

表3 各組大鼠內(nèi)皮組織SOD、MDA、MPO含量（±s，n=20）Tab.3 Expression of SOD，MDA and MPO in each group（±s，n=20）

Note：1）P<0.05 vs Control group；2）P<0.05 vs LPS group.

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3 討論

膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)，產(chǎn)生危及生命的器官功能障礙，其中內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.5 通道是電壓依賴型鉀通道的一種亞型，在平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡在肺動(dòng)脈高壓、脊髓炎等疾病中發(fā)揮重要作用［4-6］。近年來，有關(guān)Kv1.5 與內(nèi)皮細(xì)胞間關(guān)系的研究越來越得到關(guān)注。有研究顯示，Kv1.5 蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中存在表達(dá)，在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中，其可能通過參與血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化過程影響細(xì)胞的增殖、凋亡［7-8］。DPO-1 是一種新型的有效的Kv1.5 通道阻斷劑。最新研究發(fā)現(xiàn)，DPO-1 通過特異性阻斷Kv1.5通道抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膜及線粒體膜電位，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的線粒體依賴性凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.5 蛋白在大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中存在表達(dá)，予以Kv1.5 特異性通道阻滯劑DPO-1 后觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)給予不同濃度的DPO-1 干預(yù)后，LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少，提示Kv1.5 蛋白通道阻滯劑DPO-1 可減輕LPS誘導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)膜的屏障，其能通過釋放各種生物活性物質(zhì)對機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)。血管內(nèi)皮細(xì)胞激活、損傷及功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［10-11］。膿毒癥時(shí)大量內(nèi)毒素及炎癥介質(zhì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞異常活化，一方面內(nèi)皮屏障受損，VCAM-1 等多種黏附分子大量表達(dá)，vWF、TM 等活性物質(zhì)釋放入血，引起炎癥風(fēng)暴和凝血功能紊亂［11-12］。另一方面炎癥過度活化，炎癥因子刺激細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)增加，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，進(jìn)一步導(dǎo)致“炎癥瀑布”反應(yīng)［13-14］。目前，用于評判血管內(nèi)皮細(xì)胞激活或功能受損的生物標(biāo)志物包含Endocan、VCAM-1、vWF 等，其含量的高低與內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予LPS處理后，Endocan、VCAM-1、vWF及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平增加，而給予不同濃度Kv1.5 通道特異性阻滯劑DPO-1 可減少Endocan、VCAM-1、vWF 及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，進(jìn)一步提示DPO-1 可能通過阻斷Kv1.5 通道，減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制局部炎癥反應(yīng)。

近期研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.5 蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的重要原因，Kv1.5 蛋白可能在血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用［14-15］。而膿毒癥時(shí)，組織細(xì)胞缺血缺氧，細(xì)胞氧超載，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞壞死、凋亡［16］。SOD 是機(jī)體清除氧自由基最重要的酶之一，其含量可反映機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性及其清除氧自由基的能力。MPO、MDA 含量的高低常用于評估機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷的程度［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，SOD 含量減少，MPO、MDA 含量增加，而Kv1.5 通道阻滯劑DPO-1 可對抗LPS 產(chǎn)生的效應(yīng)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，增加細(xì)胞內(nèi)SOD水平，并降低細(xì)胞內(nèi)MPO、MDA含量。

綜上所述，DPO-1 通過阻斷Kv1.5 通道減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制炎癥反應(yīng)。證實(shí)Kv1.5蛋白通道阻滯劑DPO-1在膿毒癥相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。