安 寧 周 賢 張曉霞 楊 濤 許美霞
(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉與危重病研究所,武漢 430022)
血管內皮細胞損傷在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其不僅是膿毒癥發(fā)生時受損的靶細胞,而且是炎癥反應和繼發(fā)器官損傷的積極參與者[1-3]。因此,阻斷內皮細胞的損傷將可能改變膿毒癥的進程。Kv1.5蛋白是電壓依賴性氧敏感鉀離子通道,廣泛表達于多種細胞,其生理功能不僅局限于心肌細胞膜電位的維持,也與細胞的增殖、凋亡等多個病理生理過程有關[4-6]。近年來,研究發(fā)現Kv1.5 蛋白參與氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、H2O2等誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷[7-8]。因此,本研究通過建立膿毒癥動物模型,給予Kv1.5 蛋白通道特異性阻滯劑DPO-1(diphenyl phosphine oxide-1)干預后,觀察內皮細胞凋亡及氧化損傷情況,探討Kv1.5 蛋白通道阻滯劑DPO-1 對LPS 誘導的大鼠主動脈內皮細胞損傷的影響。
1.1 材料 成年清潔級SD 雄性大鼠80 只,體質量(200±20)g,購于華中科技大學動物研究所。LPS及DPO-1 購于美國Sigma 公司;內皮細胞特異性分子-1(Endocan)、內皮細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、IL-6、IL-1β 及TNF-α試劑盒購于中國上海玉博生物科技有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒購于北京寶賽生物技術生物有限公司;脂質過氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 動物模型制備與分組 SD 大鼠在實驗前12 h 開始禁食,實驗前4 h 禁水。將大鼠隨機分為4組,每組20只。Control組:尾靜脈注射0.9%Nacl溶液;LPS組:尾靜脈注射5 mg/kg LPS(等滲NaCl溶液稀釋至1 ml)制造大鼠膿毒癥模型;LPS+DPO-1 1組:先腹腔注射0.3 mg/kg DPO-1,30 min 后尾靜脈注射5 mg/kg LPS;LPS+DPO-1 2 組:先腹腔注射3 mg/kg DPO-1,30 min 后尾靜脈注射5 mg/kg LPS。各組大鼠均在自然光下繼續(xù)飼養(yǎng)6 h。
1.2.2 Western blot 檢測Kv1.5 蛋白表達情況 采集大鼠胸主動脈于裂解緩沖液。用Brd Frad 法測定蛋白濃度。提取的蛋白依次進行凝膠電泳、轉膜、封閉和孵育(加入一抗在4 ℃下孵育過夜),加入辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育2 h,ECL顯影。
1.2.3 流式細胞術檢測主動脈內皮細胞凋亡情況 大鼠取胸主動脈約2 cm,剝取內膜,70%乙醇固定,制備單細胞懸液,按照Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作,用流式細胞儀檢測各組主動脈內皮細胞早期凋亡率。
1.2.4 ELISA 法檢測Endocan、VCAM-1、vWF 及炎癥因子表達量 大鼠眶后靜脈取血,分離血清,按照ELISA 試劑盒方法檢測各組Endocan、VCAM-1、vWF及血清炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α表達量。
1.2.5 比色法檢測SOD、MDA 及MPO 含量 取大鼠胸主動脈,加入0.9%Nacl,用電動勻漿器制備組織勻漿。勻漿過程于冰水中進行。按照試劑盒說明書操作檢測SOD、MDA及MPO含量。
1.3 統(tǒng)計學分析 本實驗計量資料以±s表示,采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計學分析,多組間均數比較采用單因素方差分析,兩組間均數比較采用t檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 Kv1.5 蛋白在大鼠主動脈內皮細胞中表達情況 Kv1.5 蛋白在Control 組及LPS 組均存在表達,LPS組相對蛋白表達水平為1.042±0.021,與Control組比較,LPS 組Kv1.5 蛋白表達明顯增加(P<0.01,圖1)。
圖1 大鼠主動脈內皮細胞Kv1.5蛋白的表達水平Fig.1 Expression of Kv1.5 protein in rats aortic endothe?lial cells
2.2 流式細胞術檢測各組大鼠主動脈內皮細胞凋亡情況 與Control 組比較,LPS 組內皮細胞凋亡率[(42.29±1.19)%]明顯上升(P<0.01),而LPS+DPO-1 1 組及LPS+DPO-1 2 組內皮細胞凋亡率分別為(40.24±1.25)%、(29.68±1.34)%,較LPS 組降低(P<0.01,圖2)。
圖2 各組大鼠主動脈內皮細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of rat aortic endothelial cells in each group
2.3 各組大鼠血清Endocan、VCAM-1 及vWF 表達情況 與Control 組比較,LPS 組血清內皮細胞標志物Endocan、VCAM-1 及vWF 水平明顯升高(P<0.05);與LPS組比較,LPS+DPO-1 1組及LPS+DPO-1 2 組大鼠血清內皮細胞標志物Endocan、VCAM-1 及vWF 水平降低(P<0.05),且這一效應隨DPO-1 劑量增加而加強(表1)。
表1 各組大鼠血清Endocan、VCAM-1、vWF 表達情況(ng/ml,±s,n=20)Tab.1 Expressions of Endocan,VCAM-1 and vWF of rats in each group(ng/ml,±s,n=20)
表1 各組大鼠血清Endocan、VCAM-1、vWF 表達情況(ng/ml,±s,n=20)Tab.1 Expressions of Endocan,VCAM-1 and vWF of rats in each group(ng/ml,±s,n=20)
Note:1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs LPS group.
vWF 11.87±0.69 41.80±1.211)40.68±1.372)27.24±1.392)Groups Control LPS LPS+DPO-1 1 LPS+DPO-1 2 Endocan 0.128±0.017 0.871±0.0441)0.837±0.0642)0.521±0.0622)VCAM-1 8.14±0.71 66.82±4.451)63.39±3.852)46.15±2.492)
2.4 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α水平變化 與Control 組比較,LPS 組血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平明顯升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+DPO-1 1組及LPS+DPO-1 2組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平降低(P<0.05,表2)。
表2 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平(±s,pg/ml,n=20)Tab.2 Expressions of IL-6,IL-1β and TNF-α of rats in each group(±s,pg/ml,n=20)
表2 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平(±s,pg/ml,n=20)Tab.2 Expressions of IL-6,IL-1β and TNF-α of rats in each group(±s,pg/ml,n=20)
Note:1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs LPS group.
TNF-α 58.42±6.49 141.81±7.461)115.37±8.622)80.97±8.852)Groups Control LPS LPS+DPO-1 1 LPS+DPO-1 2 IL-6 50.63±4.40 214 5.39±144.171)180 9.28±157.002)100 7.16±194.642)IL-1β 23.07±1.18 924.39±72.381)634.83±58.002)279.10±30.062)
2.5 各組大鼠主動脈內皮組織SOD、MDA 及MPO含量變化 LPS 組較對照組MDA 、MPO 含量上升,SOD 活性降低(P<0.05),而LPS+DPO-1 1 組及LPS+DPO-1 2組較LPS 組MDA、MPO 含量下降,SOD 活性上升(P<0.05,表3)。
表3 各組大鼠內皮組織SOD、MDA、MPO含量(±s,n=20)Tab.3 Expression of SOD,MDA and MPO in each group(±s,n=20)
表3 各組大鼠內皮組織SOD、MDA、MPO含量(±s,n=20)Tab.3 Expression of SOD,MDA and MPO in each group(±s,n=20)
Note:1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs LPS group.
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膿毒癥是宿主對感染的反應失調,產生危及生命的器官功能障礙,其中內皮細胞損傷是導致膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[1-3]。研究發(fā)現,Kv1.5 通道是電壓依賴型鉀通道的一種亞型,在平滑肌細胞、神經膠質細胞等細胞中均有表達,通過調控細胞的增殖、凋亡在肺動脈高壓、脊髓炎等疾病中發(fā)揮重要作用[4-6]。近年來,有關Kv1.5 與內皮細胞間關系的研究越來越得到關注。有研究顯示,Kv1.5 蛋白在內皮細胞中存在表達,在高血壓、動脈粥樣硬化等疾病中,其可能通過參與血管內皮細胞氧化過程影響細胞的增殖、凋亡[7-8]。DPO-1 是一種新型的有效的Kv1.5 通道阻斷劑。最新研究發(fā)現,DPO-1 通過特異性阻斷Kv1.5通道抑制肺動脈平滑肌細胞細胞膜及線粒體膜電位,抑制肺動脈平滑肌細胞的線粒體依賴性凋亡[9]。本研究發(fā)現,Kv1.5 蛋白在大鼠主動脈內皮細胞中存在表達,予以Kv1.5 特異性通道阻滯劑DPO-1 后觀察內皮細胞凋亡情況,發(fā)現給予不同濃度的DPO-1 干預后,LPS 誘導的內皮細胞凋亡減少,提示Kv1.5 蛋白通道阻滯劑DPO-1 可減輕LPS誘導的主動脈內皮細胞損傷。
內皮細胞是血管內膜的屏障,其能通過釋放各種生物活性物質對機體內環(huán)境的改變做出相應的調節(jié)。血管內皮細胞激活、損傷及功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)[10-11]。膿毒癥時大量內毒素及炎癥介質導致內皮細胞異?;罨?,一方面內皮屏障受損,VCAM-1 等多種黏附分子大量表達,vWF、TM 等活性物質釋放入血,引起炎癥風暴和凝血功能紊亂[11-12]。另一方面炎癥過度活化,炎癥因子刺激細胞表面黏附分子表達增加,促進白細胞與內皮細胞相互作用,進一步導致“炎癥瀑布”反應[13-14]。目前,用于評判血管內皮細胞激活或功能受損的生物標志物包含Endocan、VCAM-1、vWF 等,其含量的高低與內皮細胞損傷程度呈正相關[15]。本研究發(fā)現,給予LPS處理后,Endocan、VCAM-1、vWF及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平增加,而給予不同濃度Kv1.5 通道特異性阻滯劑DPO-1 可減少Endocan、VCAM-1、vWF 及炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平,進一步提示DPO-1 可能通過阻斷Kv1.5 通道,減輕LPS誘導的內皮細胞損傷,抑制局部炎癥反應。
近期研究發(fā)現,Kv1.5 蛋白表達上調,細胞內ROS 水平增加,導致血管內皮細胞損傷是高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要原因,Kv1.5 蛋白可能在血管內皮細胞氧化應激調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。而膿毒癥時,組織細胞缺血缺氧,細胞氧超載,加重炎癥反應,導致組織細胞壞死、凋亡[16]。SOD 是機體清除氧自由基最重要的酶之一,其含量可反映機體內抗氧化酶的活性及其清除氧自由基的能力。MPO、MDA 含量的高低常用于評估機體脂質過氧化損傷的程度[17-18]。本研究發(fā)現,LPS作用于內皮細胞后,SOD 含量減少,MPO、MDA 含量增加,而Kv1.5 通道阻滯劑DPO-1 可對抗LPS 產生的效應,減輕內皮細胞氧化應激損傷,增加細胞內SOD水平,并降低細胞內MPO、MDA含量。
綜上所述,DPO-1 通過阻斷Kv1.5 通道減輕內毒素誘導的大鼠主動脈內皮細胞氧化應激損傷,抑制炎癥反應。證實Kv1.5蛋白通道阻滯劑DPO-1在膿毒癥相關內皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用。