常 越 田金成 趙 茜 周亞南 英葉霞 呂 葉 曹相玫

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004）

聚梳組蛋白（polycomb group，PcG）是重要的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄阻遏物，既往研究表明，PcG 蛋白組裝成2 個(gè)抑制性蛋白復(fù)合物，即多疏阻遏復(fù)合物1（PRC1）和多疏阻遏復(fù)合物2（PRC2），兩者協(xié)同調(diào)控組蛋白修飾及染色質(zhì)狀態(tài)沉默基因表達(dá)［1］。多梳樣蛋白2（polycomb-like protein 2，PCL2）是構(gòu)成PRC2復(fù)合物的重要輔助因子，能夠調(diào)節(jié)PRC2 酶活性及PRC2基因合成等，影響多能基因表達(dá)程序穩(wěn)定性，在細(xì)胞命運(yùn)控制中起重要作用［2-3］。近年研究報(bào)道，過表達(dá)PCL2 能夠增加白血病細(xì)胞的化療敏感性，有效降低異種移植小鼠模型急性髓細(xì)胞樣白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）復(fù)發(fā)率［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PCL2 表達(dá)增加與膠質(zhì)瘤增殖關(guān)系密切［5］。因此，本研究將繼續(xù)研究PCL2 與膠質(zhì)瘤血管形成的關(guān)系，旨在明確其對(duì)膠質(zhì)瘤血管異常增生的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源細(xì)胞系U87-MG由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCL2、核因子E2 相關(guān)因子2（nu‐clear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer ofzesteho‐molog 2，EZH2）、β-actin、GAPDH、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；EDTA 抗原修復(fù)液、山羊血清、DAB 試劑、蘇木素購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清、胰蛋白酶、0.25%EDTA、牛血清白蛋白、BSA 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；0.45μm PVDF 膜、ECL 發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 本研究中所有腫瘤PCL2 表達(dá)數(shù)據(jù)源自在線分析軟件GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）。GEPIA（基因表達(dá)譜交互式分析）是基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤和正常樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析的資源，采用生物信息學(xué)工具CIBERSORT、EPIC 和quantTIseq 對(duì)TCGA/GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中各樣本進(jìn)行分析，由北京大學(xué)的TANG等［6］共同開發(fā)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 膠質(zhì)瘤石蠟組織標(biāo)本源自2013 年至2015 年寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者，共73例，男38例，女35例，所有標(biāo)本均經(jīng)過病理證實(shí)，病例資料完整。由兩位資深病理醫(yī)師復(fù)驗(yàn)后確診，WHOⅠ級(jí)3 例，Ⅱ級(jí)25 例，Ⅱ~Ⅲ級(jí)1 例，Ⅲ級(jí)18 例，Ⅲ~Ⅳ級(jí)24 例，Ⅳ級(jí)2例。將腫瘤與正常腦組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張（4μm），進(jìn)行抗原修復(fù)，65 ℃烘片，3%H2O2阻斷8 min，檸檬酸高壓抗原修復(fù)10 min，10%山羊血清封閉20 min，添加一抗工作液（PCL2 1∶100 稀釋）37 ℃孵育1 h，添加二抗工作液（山羊抗小鼠IgG）37 ℃孵育60 min，顯微鏡觀察DAB 染色時(shí)間，蘇木素復(fù)染1 min 使核著色，清水洗掉多余染色劑，乙醇脫水，中性樹脂封片，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析數(shù)據(jù)。染色結(jié)果由染色強(qiáng)度百分比（棕黃色顆粒表示陽(yáng)性結(jié)果）和染色細(xì)胞百分比（細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中棕黃色顆粒表示陽(yáng)性結(jié)果）確定。

1.2.3 U87 細(xì)胞處理 將U87 細(xì)胞接種于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，2×105個(gè)/100 cm2培養(yǎng)，5%CO2、37 ℃孵育8 h，貼壁后進(jìn)行慢病毒感染，感染滴度設(shè)置為MOI=20∶1、50∶1、100∶1，無(wú)血清MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率。

1.2.4 Western blot 收集1.2.3 中各組細(xì)胞并提取全蛋白，BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒定量，加入上樣緩沖液（40 μg/孔）95 ℃熱變性5 min，10%SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉1 h，加入3%BSA 稀釋的一抗（PCL2 1∶200、Nrf2 1∶500、HO-1 1∶500、EZH2 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶2 000）室溫孵育60 min，以β-actin 為內(nèi)參。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（A∶B=1∶1）顯色1 min，曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白表達(dá)=目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PCL2 在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析腫瘤中PCL2基因表達(dá)，PCL2在AML、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）、腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、腎嫌色細(xì)胞癌（kidney chromophobe，KICH）等腫瘤組織中表達(dá)低于正常組織。相反，PCL2在低級(jí)別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glio‐blastoma，GBM）、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、食道癌（esophageal carcinoma，ESCA）等腫瘤組織中表達(dá)高于癌旁組織（圖1）。

圖1 PCL2在多種腫瘤中的表達(dá)Fig.1 Expression of PCL2 in many kinds of tumors

2.2 PCL2 在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，與腫瘤厚壁血管形成相關(guān) 免疫組化觀察73 例膠質(zhì)瘤組織中PCL2 表達(dá)和分布情況，PCL2 蛋白表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色，主要位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，部分樣本中PCL2也在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖2）。PCL2 蛋白在有厚壁血管增生的膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)較高，提示PCL2 表達(dá)增加與膠質(zhì)瘤形成腎小球樣厚壁血管相關(guān)（χ2=13.909，P<0.01，表1）。

圖2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PCL2 表達(dá)及表達(dá)部位（根據(jù)WHO 2016分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）Fig.2 Expression of PCL2 in glioma cells and its expres?sion sites（according to WHO 2016 grading stan?dard）

表1 PCL2表達(dá)與厚壁血管形成相關(guān)［例（%）］Tab.1 PCL2 expression is associated with thick-walled vessel formation［n（%）］

2.3 過表達(dá)PCL2 蛋白水平測(cè)定 Western blot 檢測(cè)hPCL2蛋白表達(dá)，腺病毒載體梯度MOI=20∶1、50∶1、100∶1 時(shí)感染U87-MG 細(xì)胞，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組PCL2 蛋白表達(dá)較低，hPCL2 組蛋白表達(dá)明顯升高，hPCL2與空白對(duì)照組間及hPCL2組內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 重組腺病毒內(nèi)PCL2表達(dá)測(cè)定Fig.3 Determination of PCL2 protein level in recombi?nant adenovirus

2.4 hPCL2 上調(diào)EZH2 表達(dá)，并促進(jìn)促血管生成因子合成 檢測(cè)血管形成的正調(diào)控基因Nrf2 和HO-1蛋白含量（PCL2 MOI=20∶1、50∶1、100∶1），hPCL2 組Nrf2 和HO-1 明顯高于對(duì)照組及空載體組，且在MOI=50 時(shí)表達(dá)最為顯著（圖4）。提示高表達(dá)PCL2可增加HO-1 和Nrf2 表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)EZH2 表達(dá)（PRC2復(fù)合物核心組分）。

圖4 過表達(dá)PCL2促進(jìn)血管生成因子合成Fig.4 Overexpression of PCL2 promotes angiogenic factor synthesis

3 討論

膠質(zhì)瘤占成人原發(fā)性腦腫瘤的70%，具有浸潤(rùn)性、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，且預(yù)后不良［7］。在新生微血管延伸的引導(dǎo)下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移至大腦不同區(qū)域，并進(jìn)一步發(fā)展。新血管形成一般包括血管發(fā)生和血管生成兩個(gè)過程［8］。血管發(fā)生指來自中胚層的纖維母細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并在無(wú)血管組織中增生形成原始血管網(wǎng)［9］。血管生成包括血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增生與遷移、細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解、管腔樣結(jié)構(gòu)形成與融合及細(xì)胞外基質(zhì)重建等多個(gè)步驟［10］。

病理狀態(tài)下產(chǎn)生的大量調(diào)控因子能夠激發(fā)異常血管生成，這些調(diào)控因子包括血管生成因子、細(xì)胞因子、蛋白酶、粘連分子、血管生成相關(guān)基因、DNA 和組蛋白修飾及ncRNA 表達(dá)等［11］。病理性血管生成主要原因?yàn)榇傺苌梢蜃樱ㄈ缪軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 等）和抑血管生成因子（如血管抑素、內(nèi)皮抑素）相互調(diào)節(jié)，當(dāng)其平衡被破壞，即生成病理性血管，相應(yīng)因子合成增加并與靶細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞）相應(yīng)受體結(jié)合，經(jīng)過多個(gè)步驟，最終在腫瘤內(nèi)形成新生血管［12］。表觀遺傳學(xué)參與血管形成基因表達(dá)調(diào)控和生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成過程［13］。

Nrf2 是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通過誘導(dǎo)抗氧化防御的多種基因表達(dá)在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14-15］。病理性血管形成與Nrf2 活化有關(guān)。KIM 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，敲低Nrf2 可阻斷結(jié)腸癌中氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）依賴性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)并抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)能減少小鼠異種移植模型中依賴VEGF 血管生成。膀胱癌患者清中Nrf2、HO-1 含量較高者VEGF 也呈高表達(dá)［17］。表明高表達(dá)的Nrf2 使VEGF表達(dá)升高，并最終促進(jìn)腫瘤血管生成。

HO 是血紅素分解過程中的起始酶和限速酶，HO-1被認(rèn)為是Nrf2依賴性細(xì)胞應(yīng)答的主要效應(yīng)物，其代謝產(chǎn)物具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子合成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移、減少血管抑制因子合成和抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用［18-20］。CO 是HO-1 的代謝產(chǎn)物，通過刺激血管形成并誘導(dǎo)血管生成相關(guān)因子VEGF 與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal derived factor-1，SDF-1）表達(dá)促進(jìn)血管生成［21］。

表觀遺傳的各種機(jī)制共同參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展，且與膠質(zhì)瘤增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程密切相關(guān)［22］。表觀遺傳學(xué)機(jī)制包括DNA 甲基化異常、組蛋白修飾（乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等翻譯后修飾）、非編碼RNA、染色質(zhì)修飾等均與腫瘤發(fā)生有關(guān)［23］。PCLs 是重要的表觀遺傳因子，過表達(dá)PCL2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并延緩細(xì)胞衰老［24］。

EZH2 是PRC2 的催化亞基，是一種特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過三甲基化修飾靶基因，抑制或沉默靶基因［25］。而EZH2 參與腫瘤血管形成，主要通過VEGF-E2、F-EZH2-VASH1 和FGF-2-NDY1/EZH2-miR-101 EZH2發(fā)揮作用［26-27］。HIF-1α與EZH2表達(dá)呈正相關(guān)，這兩種蛋白借助miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中取得聯(lián)系［28］。腫瘤內(nèi)部的缺氧微環(huán)境使其HIF 表達(dá)異常增加，并最終導(dǎo)致EZH2 高表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤血管形成能力。研究表明，EZH2 是卵巢癌和其他癌癥中腫瘤血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，VEGF通過上調(diào)EZH2表達(dá)抑制血管抑制蛋白1（vasohibin 1，VASH1）表達(dá)，從而促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成［29］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的PCL2 能夠上調(diào)EZH2表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)H3K27三甲基化及H3K4二甲基化，下調(diào)H3K9 二甲基化促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，PCL2 在多種腫瘤中呈異常表達(dá)，包括DLBC、ESCA、HNSC、膠質(zhì)瘤和LGG 等腫瘤組織；免疫組化分析顯示，PCL2 在膠質(zhì)瘤組織中呈較高表達(dá)，且在有厚壁血管形成的膠質(zhì)瘤中表達(dá)較高。

多項(xiàng)研究表明，在多種惡性腫瘤中，VEGF 和HIF-1α 可促進(jìn)EZH2 表達(dá)。本研究表明，過表達(dá)PCL2基因能夠促進(jìn)EZH2 表達(dá)，使Nrf2 和HO-1 表達(dá)升高，推斷其可能通過上調(diào)促血管生成因子（VEGF、HIF-1α 等）間接或直接進(jìn)行血管形成正向調(diào)控。由此認(rèn)為PCL2 在膠質(zhì)瘤血管形成過程中發(fā)揮重要作用。