許 慧, 薛 曉, 李楷原, 劉 翠, 鄧雅姍, 張媛媛

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院, 山東 青島 266042)

ε-己內(nèi)酯作為重要中間體，特別是新型聚合物聚己內(nèi)酯的單體，引起了廣泛的關(guān)注[1].現(xiàn)使用的生產(chǎn)方法有一定的危險(xiǎn)性與環(huán)境污染性.近年來(lái)，越來(lái)越多的研究致力于ε-己內(nèi)酯合成方法的改進(jìn).脂肪酶介導(dǎo)的一鍋法[2]從環(huán)己酮和乙酸乙酯(EtOAc)合成ε-己內(nèi)酯的工藝，通常認(rèn)為該反應(yīng)體系由兩個(gè)連續(xù)的反應(yīng)組成[3-4]：1) 脂肪酶催化羧酸或酯與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成過(guò)氧乙酸；2) 形成的過(guò)氧乙酸化學(xué)氧化酮形成內(nèi)酯.本文提出另外一個(gè)反應(yīng)存在于該體系中：3) 反應(yīng)生成乙酸，經(jīng)脂肪酶催化原位生成過(guò)氧乙酸.具體反應(yīng)過(guò)程如圖1所示.

圖1 脂肪酶介導(dǎo)的環(huán)己酮氧化為ε-己內(nèi)酯的反應(yīng)Fig.1 The reaction of lipase-mediated oxidation of cyclohexanone to ε-caprolactone

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(2)

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基于Baeyer-Villiger氧化(BV氧化)的化學(xué)-酶用環(huán)己酮制備ε-己內(nèi)酯的方法，通常采用過(guò)氧化氫或過(guò)氧化氫脲(UHP)作為氧化劑，T. laibacchi脂肪酶B作為催化劑，EtOAc作為?；w和溶劑[2-6].現(xiàn)有工藝的ε-己內(nèi)酯的濃度很低，僅約0.225～0.370 mol/L，轉(zhuǎn)化率為80%～90%，為了降低生產(chǎn)成本，提高過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，應(yīng)該大幅度增加產(chǎn)物濃度，并提高轉(zhuǎn)化率.采用穩(wěn)定性高的酶，減少高濃度底物、產(chǎn)物及中介產(chǎn)物對(duì)酶的抑制，通過(guò)使用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化工藝來(lái)提高產(chǎn)品的濃度.

為了改善酶的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性、活性、選擇性、對(duì)抑制劑或化學(xué)物質(zhì)的抗性以及可重復(fù)利用性，酶通常被固定化[7-8].戊二醛已被廣泛用作蛋白質(zhì)的交聯(lián)劑、載體活化劑以及脂肪酶和載體的交聯(lián)劑[9].將吸附的脂肪酶與戊二醛交聯(lián)，以改善脂肪酶的穩(wěn)定性[10-12].本文采用戊二醛作為T. laibacchi脂肪酶和硅藻土載體的交聯(lián)劑，提高脂肪酶的穩(wěn)定.

本文采用固定化T.laibacchi脂肪酶介導(dǎo)化學(xué)-酶BV氧化法，以環(huán)己酮和EtOAc為原料，合成ε-己內(nèi)酯.為提高ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率，采用RSM對(duì)環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度和環(huán)己酮濃度等關(guān)鍵變量進(jìn)行優(yōu)化.首次提出并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：該反應(yīng)體系中存在三個(gè)反應(yīng)，而不僅僅是兩個(gè)反應(yīng).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

EtOAc (99.8%)、環(huán)己酮(99%)、UHP (97%)和ε-己內(nèi)酯(97%)為分析純.所用的固定化脂肪酶是交聯(lián)的固定化T. laibacchii CBS5791脂肪酶(CaLB)，其酶活性為1 280 U/g，粒徑為0.45 mm[13].脂肪酶的活性采用 “橄欖乳化法”測(cè)定[14].

脂肪酶催化環(huán)己酮BV氧化生成ε-己內(nèi)酯.

反應(yīng)在一個(gè)20 mL的反應(yīng)瓶中進(jìn)行，環(huán)己酮濃度范圍為0.5～2 mol/L，環(huán)己酮與UHP物質(zhì)的量比為0.5～2，EtOAc濃度為8.9 mol/L，固定化CaLB濃度為25 mg/mL.反應(yīng)瓶在水浴振蕩器中，轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)溫度40～70 ℃，反應(yīng)時(shí)間8～12 h.從反應(yīng)溶液中取出樣品，進(jìn)行高效液相色譜分析.

1.2 高效液相色譜分析

所用液相色譜儀為SHIMADZULC-16，色譜柱為WondaSil-WR色譜柱(250×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相是甲醇和水的比例為4∶6，流速為1.0 mL/min，樣品注入20 μL，柱溫30 ℃.ε-己內(nèi)酯和環(huán)己酮的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm和277 nm.ε-己內(nèi)酯和環(huán)己酮的保留時(shí)間分別為4.9 min和8.5 min.

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考慮到生產(chǎn)成本和酶的效率，酶濃度設(shè)定為25 mg/mL.本文采用三因素三水平Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳反應(yīng)條件.根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇環(huán)己酮濃度(A)、底物物質(zhì)的量比(B)、反應(yīng)溫度(C)為自變量，產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率(Y)為響應(yīng)值.使用Design-Expert 8.0.6軟件，共設(shè)計(jì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),其中中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，因素和水平見(jiàn)表1所列.

表1 Box-Behnken測(cè)試設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken test design

3 結(jié)果和討論

3.1 環(huán)己酮化學(xué)-酶法氧化制備ε-己內(nèi)酯的優(yōu)化：RSM實(shí)驗(yàn)和模型擬合

RSM是一種廣泛使用的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以最少的實(shí)驗(yàn)量建立最佳條件，并分析變量之間的交互作用[15-16].與傳統(tǒng)的三因素三水平正交試驗(yàn)相比，RSM可以顯著減少實(shí)驗(yàn)量，得出更精確的因素水平量，通過(guò)回歸方程得到各因素的最佳組合.表2給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design Expert8.0.6軟件建立了二次多項(xiàng)式最佳擬合模型(式4)，并進(jìn)行了回歸分析(表3)，以評(píng)估環(huán)己酮濃度(A)、環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比(B)和反應(yīng)溫度(C)對(duì)產(chǎn)率(Y)的影響.

表2 RSM的設(shè)計(jì)和響應(yīng)值Tab.2 Design and response values of RSM

Y=95.99+0.94A-7.4B+2.31C+3.14AB-1.93AC-1.77BC-15.46A2-6.04B2-20.87C2

(4)

由CaLB催化的環(huán)己酮化學(xué)-酶BV氧化法，制備ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率，可以用方程(4)計(jì)算.式中變量的正系數(shù)表示該變量對(duì)產(chǎn)量有正效應(yīng)，反之，負(fù)系數(shù)表示對(duì)產(chǎn)量有負(fù)效應(yīng).由方程(4)可見(jiàn)，線性項(xiàng)A和C以及交互作用項(xiàng)AB的系數(shù)為正，表明這些因素對(duì)ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率有正效應(yīng)；所有二次項(xiàng)(A2,B2和C2)和交互作用項(xiàng)(AC,BC)對(duì)ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率都有負(fù)效應(yīng).

表3 擬合模型的方差分析Tab.3 ANOVA analysis and variance analysis of the fitted model

3.2 不同因素對(duì)環(huán)己酮化學(xué)-酶法氧化制ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的交互作用

根據(jù)模型方程繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖2～圖4所示，可以直觀地反映變量之間交互作用對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響，可方便的用于研究各變量之間的交互作用.

每個(gè)圖有兩個(gè)變量，第三個(gè)變量保持固定水平不變.

環(huán)己酮濃度(A)和底物物質(zhì)的量比(B)對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響如圖2所示，當(dāng)環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比從0.5 (1∶2)增加到0.77 (1∶1.3)時(shí)，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率是升高的，因?yàn)殡S著B的增加，UHP濃度降低，UHP對(duì)脂肪酶活性的抑制作用減小，使得反應(yīng)加快，產(chǎn)率增加.當(dāng)物質(zhì)的量比進(jìn)一步降低時(shí)，產(chǎn)率降低，這可能是因?yàn)閁HP太少而不足以支持反應(yīng).如圖2所示，當(dāng)環(huán)己酮濃度從0.5 mol/L增加到1.22 mol/L時(shí)，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率增加，當(dāng)環(huán)己酮濃度進(jìn)一步增加時(shí)，產(chǎn)率降低，這是因?yàn)榄h(huán)己酮濃度已造成底物抑制.

圖3和圖4分別給出反應(yīng)溫度與環(huán)己酮濃度、環(huán)己酮濃度與環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比的交互作用圖.通常，反應(yīng)溫度會(huì)影響酶的活性與穩(wěn)定性，影響酶的催化效率[17-18].圖3中，在一定溫度范圍內(nèi)，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到約56.5 ℃時(shí)，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率達(dá)到最大，隨著溫度進(jìn)一步升高，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率下降.這可能是由于在56.5 ℃之前，CaLB的活性隨著反應(yīng)溫度的升高而增加，因此ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率增加[19-20]；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，可能是由于溫度過(guò)高造成CaLB部分失活以及穩(wěn)定性降低，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率降低.這是因?yàn)槊舾邪被峥赡鼙贿^(guò)氧乙酸氧化，導(dǎo)致酶失活[21]，當(dāng)反應(yīng)溫度升至60 ℃時(shí)，較低的過(guò)氧乙酸濃度也會(huì)使脂肪酶活性也會(huì)降低[22].通常，橢圓的等高線圖表明相應(yīng)變量之間的交互作用是顯著的，而圓形等高線圖表明它們之間的交互作用可以忽略.環(huán)己酮濃度和環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比(F=54.7)之間的交互作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比反應(yīng)溫度和環(huán)己酮濃度(F=20.84)之間的交互作用更顯著.環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度之間的交互作用與這兩種交互作用相比也是顯著的(F=17.39).環(huán)己酮濃度和底物物質(zhì)的量比之間的交互作用、反應(yīng)溫度和環(huán)己酮濃度之間的交互作用對(duì)ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率具有最大的影響，圖2和圖3的等高線圖也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn).

圖2 環(huán)己酮的初始濃度和環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響(反應(yīng)溫度55 ℃)Fig.2 Effect of initial concentration of cyclohexanone and the molar ratio of cyclohexanone to UHP on the yield of ε-caprolactone (reaction temperature 55 ℃)

圖3 環(huán)己酮的初始濃度和反應(yīng)溫度對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響(環(huán)己酮與UHP物質(zhì)的量比1.25)Fig.3 Effect of initial concentration of cyclohexanone and reaction temperature on the yield of ε-caprolactone (the molar ratio of cyclohexanone to UHP 1.25)

圖4 反應(yīng)溫度和環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響(環(huán)己酮的初始濃度1.25 mol/L)Fig.4 Effect of reaction temperature and the molar ratio of cyclohexanone to UHP on the yield of ε-caprolactone (initial concentration of cyclohexanone 1.25 mol/L)

環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比是決定ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的一個(gè)重要的因素[23]，這與研究結(jié)果一致(p<0.000 1).從表3可以看出，環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比對(duì)ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率影響最大(p<0.000 1),不同的物質(zhì)的量比導(dǎo)致產(chǎn)率的顯著變化.在環(huán)己酮與UHP的最佳物質(zhì)的量比為1∶1.3時(shí)，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率達(dá)到98.06%.

在反應(yīng)中，ε-己內(nèi)酯、水、氧氣和EtOAc對(duì)CaLB的抑制作用可以忽略，而底物UHP和副產(chǎn)物乙酸對(duì)CaLB有很強(qiáng)的抑制作用，甚至?xí)?dǎo)致CaLB失活.一般認(rèn)為CaLB具有良好的穩(wěn)定性，但是UHP作為氧化劑，抑制CaLB活性.因此，必須采用最佳UHP濃度，這與環(huán)己酮與UHP的最佳物質(zhì)的量比有關(guān).UHP可以使CaLB失活，因?yàn)楫?dāng)CaLB暴露于過(guò)氧乙酸濃度較高的H2O2中時(shí)，敏感氨基酸被氧化，這可能導(dǎo)致反應(yīng)速率顯著降低.當(dāng)反應(yīng)溫度高于60 ℃時(shí)，即使過(guò)氧乙酸濃度很低，也能引起CaLB失活，不能用于下一次反應(yīng).CaLB失活隨著時(shí)間的推移逐漸發(fā)生，最終氧化過(guò)程導(dǎo)致二硫鍵斷裂和結(jié)構(gòu)損失[23-24].

3.3 反應(yīng)系統(tǒng)中存在三個(gè)反應(yīng)

環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比在1∶2至1∶1之間，是由反應(yīng)(1)和反應(yīng)(3)確定，兩者都消耗UHP來(lái)產(chǎn)生過(guò)氧乙酸.在兩個(gè)反應(yīng)中，UHP的化學(xué)計(jì)量系數(shù)不同，反應(yīng)(1)的化學(xué)計(jì)量系數(shù)是2，反應(yīng)(3)是1.如果只發(fā)生反應(yīng)(1)，則比率為1∶2,如果只發(fā)生反應(yīng)(3)，比例為1∶1.實(shí)際比率值取決于反應(yīng)(1)和反應(yīng)(3)的貢獻(xiàn).本文得到的最佳物質(zhì)的量比為1∶1.3，這意味著消耗的UHP和EtOAc分別為1.83 mol/L和0.61 mol/L.對(duì)于反應(yīng)(1)，消耗1.22 mol/L UHP和0.61 mol/L EtOAc形成0.61 mol/L過(guò)氧乙酸，留下0.61 mol /L UHP.通過(guò)反應(yīng)(2)，過(guò)氧乙酸與環(huán)己酮反應(yīng)生成ε-己內(nèi)酯和乙酸，后者與UHP反應(yīng)原位生成過(guò)氧乙酸.反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3)依次進(jìn)行，直到通過(guò)反應(yīng)(3)耗盡0.61 mol/L UHP，并且通過(guò)反應(yīng)(2)同時(shí)形成0.61 mol/L ε-己內(nèi)酯.因此，總共形成了1.22 mol/L ε-己內(nèi)酯，由于轉(zhuǎn)化率為98.06%，ε-己內(nèi)酯的實(shí)際濃度約為1.2 mol/L.

從上述討論可得出結(jié)論，中間產(chǎn)物乙酸與UHP反應(yīng)，生成過(guò)氧乙酸，即反應(yīng)(3)實(shí)際上發(fā)生了.這表明反應(yīng)系統(tǒng)中有三個(gè)反應(yīng)，而不是兩個(gè)反應(yīng).本文首次提出，酶介導(dǎo)的環(huán)己酮、EtOAc反應(yīng)體系中，中間產(chǎn)物乙酸與UHP原位反應(yīng)，生成過(guò)氧乙酸.由于反應(yīng)(3)的作用，最佳物質(zhì)的量比為1∶1.3,UHP初始濃度從2.5 mol/L減少到1.568 mol/L，減少了0.932 mol/L，這非常有利于減少UHP對(duì)脂肪酶的抑制，增加產(chǎn)率.

3.4 高濃度的目標(biāo)產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯

為了提高反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性，可通過(guò)增加底物與反應(yīng)物的濃度來(lái)提高產(chǎn)物濃度，但這會(huì)影響酶的穩(wěn)定性與耐受性.在生物催化反應(yīng)過(guò)程中，底物抑制會(huì)嚴(yán)重影響酶的活性.通過(guò)包埋和交聯(lián)等固定化技術(shù)，可以增加酶的穩(wěn)定性.交聯(lián)固定化酶的穩(wěn)定性優(yōu)于吸附的固定化酶，以戊二醛為交聯(lián)劑，將CaLB固定在硅藻土載體上.環(huán)己酮的初始濃度為1.22 mol/L，目標(biāo)產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯的濃度達(dá)到約1.2 mol/L，產(chǎn)率為98.06%，遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)化率80%～90%(0.225～0.370 mol/L).這是因?yàn)楸疚闹兴玫腃aLB，采用交聯(lián)固定化，提高了CaLB的穩(wěn)定性.

3.5 最佳反應(yīng)條件的確定和驗(yàn)證

根據(jù)RSM法得到的優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件：環(huán)己酮初始濃度為1.22 mol/L，環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比為1∶1.3，溫度為56.5 ℃.在此優(yōu)化條件下進(jìn)行了三次驗(yàn)證試驗(yàn)，ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率達(dá)到98.06%，與預(yù)測(cè)值(98.42%)非常接近.這表明該模型是可靠的，可很好的關(guān)聯(lián)環(huán)己酮初始濃度、環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度等變量對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響.

4 結(jié)論

進(jìn)行了固定化CaLB催化BV氧化反應(yīng)制備ε-己內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)，用RSM法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了最優(yōu)反應(yīng)條件，產(chǎn)率達(dá)到98.06%，濃度高達(dá)1.2 mol/L，較其他研究有了顯著提高，其原因主要是所用的交聯(lián)固定化CaLB穩(wěn)定性好.最優(yōu)反應(yīng)條件也有較大貢獻(xiàn)，最佳反應(yīng)條件：環(huán)己酮的初始濃度為1.22 mol/L，環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比為1∶1.3，反應(yīng)溫度為56.5 ℃.結(jié)果表明，在環(huán)己酮、EtOAc反應(yīng)體系中有三個(gè)反應(yīng)，其中第三個(gè)反應(yīng)是中間產(chǎn)物乙酸，在固定化CaLB的催化下與UHP反應(yīng)，原位生成過(guò)氧乙酸.建立二次多項(xiàng)式模型，其R2值為0.998 8，可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率.該模型考慮了環(huán)己酮的初始濃度、環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度對(duì)ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率的影響.結(jié)果表明，環(huán)己酮與UHP的物質(zhì)的量比對(duì)ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率有非常顯著的影響(p<0.000 6).