程進霞，李景軍

（安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

食物源活性肽（BPs）是一類蛋白質(zhì)多功能化合物片段的分子統(tǒng)稱，所述化合物中包含對人體的生命活動有利的物質(zhì)或其他具有一定的功能和生理活性的物質(zhì)，在保護人體生理健康結(jié)構(gòu)和生理代謝系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中能起到主要作用。生物活性肽種類極為繁多，由大約20種主要天然必需氨基酸和以許多不同化學(xué)組成類型和結(jié)構(gòu)排列組合方式共同構(gòu)成起來的一種從單二肽發(fā)展到更復(fù)雜多樣的呈線形、環(huán)形結(jié)構(gòu)排列的有機肽類衍生物的化學(xué)總稱［1］。食物源活性肽通常是以一種非生物活性的多肽形式存在于生物大分子的長鏈末端，從而避免了游離氨基酸間的相互吸收［2］。食物源活性肽的提取工藝、分離純化、生物功能特性等是目前國內(nèi)外研究學(xué)者關(guān)注的焦點。具有良好生物活性的多肽，常采用超濾進行粗分離，色譜進行細分離，結(jié)合光譜、質(zhì)譜等方法對肽進行表征，采用固相法合成目標多肽，再通過體內(nèi)和體外試驗進行活性驗證和穩(wěn)定性分析［3］。研究食物源生物活性肽，對于開發(fā)功能性食品、營養(yǎng)保健品、醫(yī)藥制劑和化妝品等行業(yè)具有重要的現(xiàn)實意義［4］。

1 食物源活性肽來源

食物源活性肽是一種以食源性蛋白為原料，通過微生物酶解作用或自然發(fā)酵分解后而形成的具有從線性二肽鍵到較復(fù)雜結(jié)構(gòu)的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)變化的3種不同功能肽類結(jié)構(gòu)的化學(xué)總稱［5］。食物源活性肽的品種類別還有很多，按其原料主要物質(zhì)來源分類，可簡單分為植物源活性肽、動物蛋白源生物活性肽以及微生物源生物活性肽等［6］。食物源活性肽在提高人類營養(yǎng)和健康功能以及人體疾病生理調(diào)節(jié)能力中均發(fā)揮著極其重要的作用，已可逐步廣泛應(yīng)用于健康功能性食品研制及相關(guān)臨床輔助治療方法中［7］。

1.1 植物源活性肽

存在于多種植物果實中含有的天然生物活性肽對保護人體功能具有極大的醫(yī)療利用潛在價值。由于天然植物源生物活性肽成分來源較為豐富、成本低、原料制備簡單，因此國內(nèi)外有過許多植物研究生產(chǎn)人員專門從某些植物根莖類原料，例如，大豆類根莖（黃豆、扁豆等）原料、谷物秸稈類（小麥、燕麥、玉米）種子、麻類植物的種子原料和向日葵油菜籽原料等來提取其生物活性肽。其中，大豆蛋白酶分解物中提取的肽類His-Cys-Gln-和Arg-及Pro-和Arg可進一步刺激人體巨噬細胞的細胞吞噬激活功能，從而達到生物免疫雙向調(diào)節(jié)的作用［8］；Chang等［9］人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多肽lunasin可用于針對可獲得性免疫缺陷綜合征患兒的特異性免疫應(yīng)答治療。玉米中的低聚肽能直接抑制心肌ACE的活性，舒張血管，從而使病人的血壓下降；其中，從玉米淀粉中提取的Leu-和Pro-對心肌ACE的抑制作用最好；它含有豐富的支鏈氨基酸，能夠顯著提高病人的肝功能，提高病人的抗肝功能，同時還含有豐富的谷氨酰胺和亮氨酸，它能提高病人的整體免疫力，提高身體的運動協(xié)調(diào)性［10］。小麥低聚肽還具有抗阿片樣活性，通過調(diào)整植物的神經(jīng)突觸傳導(dǎo)信號，實現(xiàn)對神經(jīng)和疼痛的雙重抑制，并且其含有豐富的抗谷氨酰胺，可以迅速增強宿主免疫系統(tǒng)的抗感染和反應(yīng)機制；另外，小麥肽對小鼠消化道水腫的機理和保護小腸黏膜的損害、促進小腸功能的恢復(fù)等具有一定的藥理作用［11］。李?，B等［12］人研究分析后發(fā)現(xiàn)，中高劑量鷹嘴豆源活性肽對環(huán)磷酰胺缺乏所引起的免疫低下小鼠的細胞免疫活性具有很明顯的改善作用，表達活性水平明顯提高，增加了約1.19～1.34倍。普通植物源活性肽具有安全性更高、操作原料較簡單、功能成分的表達結(jié)構(gòu)較容易理解等這些突出技術(shù)特點，因此也更廣泛有效地直接被應(yīng)用于臨床開發(fā)及功能性食品生產(chǎn)加工研究中。

1.2 動物源活性肽

動物原料食品中也存在相當豐富活性，如蛋白質(zhì)、碳水化合物等天然營養(yǎng)成分。許多動物研究學(xué)者試圖提取其中含有的天然活性成分如生物活性肽等進行分析探究。動物基源有：動物性牛奶蛋白、肉制品脂肪蛋白、奶酪、蛋類等［13］。柳慧琴［14］用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶聯(lián)合酶解牛脊髓，獲得具有抗氧化作用的牛脊肽。葉孟亮［15］研究小組用酶解和純化法分離得到牦牛骨膠原蛋白，結(jié)果表明，在3 kDa以下的氨基酸組分中，具有高分子量促進骨細胞增殖和生長的能力。王少平等［16］通過實驗研究分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土鱉蟲的活性多肽能明顯降低大鼠的膽汁細胞膽固醇、血脂指標，并能提高實驗性大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，增加實驗小鼠腸道分泌物細胞中的腸道菌群蛋白的生物活性相對參比豐度。馬志鷹［17］從駱駝血液中提取和提純了降壓活性肽，采用液相色譜法檢測其抗ACE活性。Wang等［18］利用Q-Exactive質(zhì)譜法分析了鯖魚源中的生物活性肽，并對其進行了特異性的鑒定，確定了其抗氧化活性肽的具體序列。張可佳［19］從牡蠣中分離出一種具有ACE抑制作用的多肽，并用SHR模型對其進行了研究。

1.3 微生物源活性肽

除了上述一些天然動物、植物細胞壁分子中存在的多種有效活性肽，食源和其他藥用性真菌中本身也可能會含有這些極為豐富的有效物質(zhì)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、糖、維生素等各種高級植物營養(yǎng)成分，因此近年來國內(nèi)外有許多研究學(xué)者開始嘗試探索如何從各種天然活性食用菌多糖物質(zhì)中直接提取與篩選出活性肽。程湛等［20］利用酶水解還原法成功制備成了香菇多肽，得到的香菇多肽還具有更為顯著和更好的抗氧化等生物活性、抗腫瘤和抗菌醒酒等方面的藥理活性。靈芝肽、姬松茸肽、茶樹菇肽、雙孢菇肽、云芝子肽均對增強小鼠機體的骨骼肌肉發(fā)育生長機能和改善運動肌肉耐力方面有其一定程度的生物學(xué)促進作用，能增強并逐步降低健康小鼠正常的空腹血糖及其生化檢測指標，而中高劑量濃度的食用菌生物活性肽對小鼠血糖變化的輔助控制和作用效果則相對更加明顯［21］。

2 食物源活性肽的制備方法

食物源活性肽是存在于蛋白質(zhì)中具有一定的生物活性的氨基酸序列，多數(shù)由2～20個氨基酸殘基組成，其被加密在原親本蛋白的序列中，在其前體蛋白中并不活躍，需要蛋白質(zhì)經(jīng)過體外深加工，菌種發(fā)酵，內(nèi)、外源性蛋白酶水解及體內(nèi)消化吸收等方式特異性切割并釋放。其相比于其他大分子物質(zhì)更易被身體消化吸收，且肽段越小越易被腸上皮細胞肽酶水解，但底物蛋白質(zhì)的分離過程可能受到多糖、脂質(zhì)、蛋白酶、氧化酶和多酚的干擾，故直接從動植物中分離純化生物活性肽是一項非常困難的任務(wù)，且成本高、產(chǎn)量低［22］。操作簡單、成本低的制備方法更適用于實際應(yīng)用，食物源活性肽蛋白的提取制備技術(shù)主要包括下面三種研究途徑：一是酶解法，研究通過酶對天然食物源生物多肽蛋白質(zhì)分子進行活性酶解從而獲得具有人類各種器官功能活性因子的功能性生物肽；二是微生物發(fā)酵法，通過采用特定的化學(xué)法，使特定食物源生物蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中特定的肽鍵發(fā)生斷裂從而得到特殊的生命活性肽類衍生物；三是化學(xué)水解法，通過采用人工合成法制備以獲得的具有一定小分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)的多肽類化合物。目前，采用化學(xué)水解法、酶解法、微生物發(fā)酵法等工藝，但是，由于化學(xué)水解法制備的副產(chǎn)品很多，容易導(dǎo)致肽失活，因此并不是活性肽制備的優(yōu)選方法［22］。

2.1 蛋白酶酶解法

蛋白酶酶解法工藝目前已經(jīng)是在國內(nèi)合成制備生物活性肽時采用的最基本，也是最成熟且簡便可靠的蛋白質(zhì)合成純化方法。酶解法的工藝方法具有整個生產(chǎn)制造周期相對成本低、生產(chǎn)過程加工反應(yīng)條件也比較自然溫和、水解酶進程控制相對穩(wěn)定、易于工業(yè)自動化生產(chǎn)控制操作且制備生物產(chǎn)品安全性較高等這些主要性能特點。而在酶解反應(yīng)體系中，如何合理地篩選出適用的酶，也是一項技術(shù)難點。不同種類的食物蛋白經(jīng)過蛋白酶分解切取后得到各種具有不同反應(yīng)活性蛋白質(zhì)的蛋白片段。具有生物活性的功能性蛋白酶有：胃、胰、堿、菠蘿、中性蛋白酶等。此外，這些活性功能酶劑間的兩兩或者三三復(fù)配使用往往更加高效、穩(wěn)定。但用于酶解時的以上各種酶最優(yōu)復(fù)配組合的條件仍需要通過反復(fù)進行或多個酶單質(zhì)因素的復(fù)配及綜合試驗來進一步分析確定，如底物濃度、用于酶解時需要的各種酶最佳適配酶組合比例及添加酶的量、酶解反應(yīng)終止時間等。不同酶活性位點的酶切合位點可能不同，使用具有這些功能不同的蛋白酶來水解一些活性位相同位點上的多肽段蛋白質(zhì)，意味著將會同時隨機獲得另一些具有活性位點或不同功能位點上的多肽段。

2.1.1 單一酶酶解法

蛋白酶是由一組能產(chǎn)生快速水解特定蛋白質(zhì)作用的活性酶。但因為不同生物種類組成的活性蛋白酶作用來自于特定蛋白質(zhì)序列中的不同氨基酸的肽鏈位點，因此經(jīng)過不同的蛋白酶水解的同一種類蛋白質(zhì)，水解后水解物的結(jié)構(gòu)具有完全不同性質(zhì)的特定氨基酸［23］。張寶林［24］以馬鮫魚的魚骨為原料，利用中性蛋白酶酶解，得到的酶解產(chǎn)物的羥基清除率達87.70%.黃湛媛等［25］采用中性蛋白酶酶解法對竹節(jié)蝦頭副產(chǎn)物進行選擇性酶降解，最優(yōu)的酶降解條件下，獲得的酶水解最終產(chǎn)物平均DPPH的清除率大約為69.5%.該項研究使多肽具有較高的降解速率，從而提高了其副產(chǎn)物的綜合價值。陳秋鑾等［26］人通過結(jié)合單因素法和響應(yīng)面法，從五種蛋白酶中優(yōu)選出一種中性蛋白酶作為酶解的最佳蛋白酶，獲得了穩(wěn)定性極佳的活性ACE抑制劑肽，該研究進一步證實了多肽的生物功能。Li和Yuchen等［27］人近年來相繼通過體外實驗成功用胃蛋白酶法和胰蛋白酶提取方法成功對小球藻蛋白等進行體外定量水解提取，發(fā)現(xiàn)使用胰蛋白酶酶解法提取小球藻蛋白效果達到最佳，水解度約在35.5%左右。楊雪等［28］利用酶解技術(shù)對野生芥菜籽多肽進行了研究，并對其進行了一系列的定量研究，最后得出了用堿性蛋白酶進行酶解的最佳工藝，其最佳的提取條件為：底物濃度為4%，加酶量為7%，溫度為50℃，pH為8.5，酶解反應(yīng)開始時間為120 min，多肽含量約為35.4 mg/mL.該研究使野生芥菜的種子得到了更好利用，從而極大地提高了它的經(jīng)濟價值。尹樂斌［29］等人分別采用響應(yīng)面法制備及優(yōu)化酶解純化工藝法制備了豆清液培養(yǎng)基中的多肽樣品并繼續(xù)探討對其生物誘導(dǎo)抗氧化作用等活性檢測指標，篩選出風(fēng)味蛋白酶為其最優(yōu)生物活性抗氧化酶，在采用上述最優(yōu)的優(yōu)化酶解及制備等工藝參數(shù)方法控制條件下，最終研究獲得的肽組分的生物獲得率為71.1%.此項研究對豆清液多肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論分析。

綜上所述，單酶裂解是用一種蛋白酶分解蛋白質(zhì)，然后生成多肽，通過一種特定的蛋白酶進行分解，從而得到一種特定的多肽。盡管操作簡便，可以控制反應(yīng)的條件，但是酶解常常是不完全的，并且不能有效地提高酶解的效果。

2.1.2 復(fù)合酶酶解法

采用復(fù)合酶水解法能夠在短期內(nèi)顯著地克服蛋白質(zhì)在單酶作用方式下導(dǎo)致的產(chǎn)物蛋白質(zhì)構(gòu)型單一、性能不佳、產(chǎn)品蛋白水解反應(yīng)效率低下等諸多技術(shù)缺陷，使蛋白酶的分解速度大大加快。如劉靜［30］分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶三種酶的復(fù)合水解技術(shù)，得到了高質(zhì)量的大豆肽。3種蛋白酶的協(xié)同水解和提純速度都比常規(guī)單一酶法快，所得到的大豆肽分子體積更小，分子量也更集中地控制在6000 Da以內(nèi)。多酶復(fù)合水解的大豆多肽能明顯地降低水解大豆多肽產(chǎn)品的苦味值。林洋［31］等利用了堿性、中性蛋白酶復(fù)合物和中性胰蛋白酶復(fù)合體，進行單酶和復(fù)合酶酶解后的水解豆粕多肽來研究制備水解大豆肽，通過實驗分別研究對比了單酶、雙酶的復(fù)合蛋白酶及這3種復(fù)合酶酶解后的豆粕蛋白多肽的蛋白水解度值和蛋白質(zhì)降解苦味值，發(fā)現(xiàn)對上述的3種單酶組合成復(fù)合酶制備新的大豆肽水解度值更高、苦味含量也相應(yīng)更偏低。Fernando Rivero-pino等［32］對黃粉蟲進行多酶復(fù)合水解，結(jié)果表明利用枯草桿菌蛋白酶和風(fēng)味酶結(jié)合得到的水解液對DPP-Ⅳ抑制率最高，為2.62 mg/mL，水解度為20%.由此可見，多酶水解可以在一定程度上提高水解度，提高多肽的產(chǎn)率，也能提高多肽的活性。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵技術(shù)是通過微生物本身的細胞外蛋白酶來降解蛋白質(zhì)，從而可以制備生物活性多肽和食物水解蛋白。微生物發(fā)酵工藝通過微生物自身的細胞外蛋白酶，使其充分、高效地降解大分子蛋白質(zhì)，它是一種安全、簡便、快捷、高效的生物多肽制品的工業(yè)化生產(chǎn)工藝。食品蛋白在某些細菌體內(nèi)發(fā)酵降解的整個過程中會被逐漸吸收，并被某些微生物細菌酶進一步吸收降解，從而再次釋放和制造出具備某些特殊潛在功能價值的生物活性多肽蛋白［33］。楊金梅等［34］以葛根粉為主要原料，以嗜酸乳桿菌為發(fā)酵劑，以反應(yīng)平面設(shè)計為參數(shù)，對其進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：采用微生物發(fā)酵法可以有效地改善葛根粉中的活性成分，為開發(fā)新型功能食品奠定了基礎(chǔ)。Karina Ramirez等［35］通過用克勞氏芽孢桿菌Bacillusclausii發(fā)酵咖啡廢料，得到了一種水解蛋白，該蛋白對二肽基肽酶-Ⅳ具有抑制作用，經(jīng)過分析研究表明：經(jīng)發(fā)酵處理后，總蛋白、可溶性蛋白、蛋白水解物的含量分別增加了2.7倍、2.2倍和1.2倍。從發(fā)酵殘留物中還獲得了其他7種具有抗氧化活性、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性和二肽IV肽酶活性的活性肽。馬萌等［36］用植物乳桿菌Lactobacillusplantarum發(fā)酵生產(chǎn)蕎麥肽，采用大孔樹脂、葡聚糖—凝膠、液相色譜等方法對其進行純化，獲得了蕎麥多肽的粗提物并采用液相色譜—質(zhì)譜法對其進行表征，結(jié)果表明：經(jīng)純化后的蕎麥多肽具有較大的抗氧化能力。Sajad Shokri等［37］利用超聲波、高壓和脈沖電場等輔助處理技術(shù)來改善微生物的發(fā)酵率，介紹了目前微生物發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)越性。李璇［38］對多種菌體進行篩選，發(fā)現(xiàn)乳桿菌MW1水解乳蛋白后的產(chǎn)物具有較高的雙酶（α-葡萄糖苷酶、DPP-IV酶）抑制活性。

發(fā)酵法具有許多優(yōu)勢，是今后食物源活性肽制備的發(fā)展方向。微生物發(fā)酵技術(shù)最大的難點是選育出的菌種，目前，如何篩選出適宜的、高產(chǎn)量、低毒性的菌種是目前面臨的十分復(fù)雜的課題。

2.3 化學(xué)合成法

肽的固相合成和高效液相化學(xué)合成被稱為肽合成的有效方法。固相合成是利用各種化學(xué)溶劑和合成路線，將多肽的氨基酸序列從分子的C端向N端反復(fù)添加，以獲得10～100個殘基的多肽序列的反應(yīng)［39］?；镜暮铣蛇^程一般是樹脂的溶脹、接到第一個氨基酸、脫除保護的基團、檢測、洗滌、縮合、再進行洗滌、直到連接到最后一個氨基酸，脫掉保護基、從樹脂基體上開始切割出多肽、干燥后對其進行檢測［40］。然而，固相合成所需的高成本和時間，以及只能合成短而低純度的多肽的事實限制了它們的使用。高效液相合成法可以實現(xiàn)短鏈多肽的定量和中鏈多肽的分離，其產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率也較高，可以在生物工業(yè)技術(shù)中大量的應(yīng)用，如短鏈多肽和中鏈多肽、保健多肽的制備。產(chǎn)品純度指標高、技術(shù)工藝先進成熟，但是操作管理上較復(fù)雜，又因為原料產(chǎn)量相對質(zhì)量低、成本高，所以廣泛地應(yīng)用于各類醫(yī)學(xué)實驗室和臨床相關(guān)的研究和治療領(lǐng)域，以生產(chǎn)具有更高的醫(yī)療科學(xué)價值的特定功能和保健型蛋白多肽產(chǎn)品［41］。

除上述將蛋白質(zhì)水解成肽鏈的生化手段外，利用化學(xué)合成法將氨基酸連接同樣可獲得肽，雖然合成肽的操作復(fù)雜、經(jīng)濟損耗大、安全性有待考證，但此方法獲得的肽純度較高，可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，并能夠?qū)Π悬c進行針對性治療。故目前合成肽已經(jīng)成為藥物研發(fā)的主要趨勢，但在食品領(lǐng)域人們更傾向于從食物基質(zhì)中分離獲得目標活性肽，化學(xué)合成法更多被作為深入探究的一種手段。

2.4 三種食物源生物活性肽制備方法比較

利用食品級蛋白酶進行酶解可維持氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，此過程中沒有毒害物質(zhì)產(chǎn)生，安全性高、重復(fù)性好，反應(yīng)條件溫和；而發(fā)酵法的酶解率高，過程中的代謝調(diào)控可合成和分泌小肽，代謝產(chǎn)物也能夠修飾肽的功能基團提高活性，二者顯然優(yōu)于化學(xué)合成。因此，目前生產(chǎn)生物活性多肽的主要工藝是酶解和微生物發(fā)酵。三種食物源生物活性肽的制備工藝分析比較（如表1所示）。

表1 三種食物源生物活性肽制備方法分析比較［42］

綜合單一方法的優(yōu)勢及局限，近年通過微生物發(fā)酵聯(lián)合酶解技術(shù)形成優(yōu)勢協(xié)同，提高蛋白質(zhì)的水解度和轉(zhuǎn)化率，生成高活性肽的研究較為廣泛。

3 食物源生物活性肽的分離純化

利用生物活性肽的提取和純化，為進一步研究和純化食物源生物活性肽提供了實驗依據(jù)。針對食物源生物活性肽若想進行深入的體內(nèi)外靶向研究，分離純化必不可少。通常也會考慮根據(jù)其分子量、等壓電點、疏水性、酸堿性值等多種理化參數(shù)性質(zhì)上的差異不同，選擇合適的分離純化方法。同時，多維色譜組合，以及多種分離方法聯(lián)用，可以獲得更好的分離效果［43］。近年來，國內(nèi)外已廣泛采用超濾、RP-HPLC、葡聚糖柱層析、大孔樹脂吸附、毛細管電泳法等多種方法來對多肽進行分離和純化。因此，根據(jù)生物活性肽的物理性質(zhì)（例如分子量、極性、電荷種類等）和化學(xué)性質(zhì)不同，來選擇合適的分離純化方法尤為重要。由于生物活性肽的結(jié)構(gòu)不同，通過單一的分離純化方法難以實現(xiàn)理想的分離和純化。目前，通常使用兩種或兩種以上分離和純化的方法來獲得高純度的目標生物活性肽。

3.1 UF（超濾分離技術(shù)）

超濾法是一種能夠使分子物質(zhì)順利地穿過孔隙的壓力驅(qū)動膜分離技術(shù)［44］。利用超過濾技術(shù)，可以將各種分子質(zhì)量的多肽分離出來，并測定其生物活性。超濾可以保證超濾膜長期穩(wěn)定地進行分離。超濾膜通常用于大規(guī)模生產(chǎn)。在實驗室測試中，可以采用超濾管來代替。超過濾技術(shù)也被廣泛地用于制備生物活性多肽。超濾法對混合液進行分離時，要使用一定的外力，將混合溶液裝入超濾管，通過超過濾膜的孔徑，以膜的孔徑為基準，在膜上方的是比膜孔徑更大的成分，而在膜下面的則是比薄膜孔徑更小的成分，按照自己的需求收集不同的組分。按分子量大小的不同，超濾膜具有不同的規(guī)格，在試驗室通常使用3 kD、5kD和10 kD的超濾管。葉孟亮［45］用酶解法制備了牦牛骨的膠原蛋白并通過超濾法分離，結(jié)果表明，在3 kD以下的部分具有很高的促成骨細胞增殖活性作用。忽曉平［46］利用孔徑分別為3 kD、10 kD的超濾膜分離金華火腿粗肽，得到兩種不同分子量大小的多肽組分，并且分子量＜3kD的金華火腿小肽的抗氧化活性顯著高于粗肽。Nadalian等［47］采用超過濾技術(shù)，從雞皮中分離出一種能有效清除自由基的多肽。使用超濾分離具有操作簡單、分離效率高、不損害組分結(jié)構(gòu)的優(yōu)點。值得注意的是，在超濾系統(tǒng)中，通常要先選擇使用截留分子量較大的超濾膜，然后再使用相對截留分子量小一些的超濾膜，即超濾膜相對截流后分子量會逐漸減小的，這樣可以避免堵塞超濾膜。在連續(xù)使用超濾膜后，超濾膜表面會有一些殘留物質(zhì)形成的吸附沉淀層，這樣會影響分離效果，膜的表面雜質(zhì)可通過適當?shù)姆椒▉磉M行清理。超濾技術(shù)是一種通過酶解獲得的多肽片段的分離純化技術(shù)。它能將酶解后的多肽按其分子質(zhì)量大小進行分離，在生物多肽的提純中得到了廣泛的應(yīng)用。

3.2 RP-HPLC（反相高效液相色譜技術(shù)）

反相液相色譜法是目前應(yīng)用最廣泛的一種分離和提純技術(shù)，廣泛用于化學(xué)、藥學(xué)、生物、工業(yè)等領(lǐng)域［48］。RP-HPLC通常的固定流動相是十八烷基鍵合型硅膠，流動相主要是甲醇水或水乙腈。RP-HPLC可用于離子、極性、非極性化合物的分離，該方法對物質(zhì)的分辨率高、分離效果好、物質(zhì)結(jié)構(gòu)無損傷等都有很大的優(yōu)越性。Pokora等［49］人通過超濾膜、凝膠濾液相色譜法、RP-HPLC法等對蛋清蛋白水解液進行了進一步的純化，并在此基礎(chǔ)上，還得到了兩種新的蛋白四肽，這兩種蛋白都是由SWVE和DILN組成的，結(jié)果表明，它們均對ACE有一定的抑制作用。江明珠［50］利用RP-HPLC對流動相A（含有0.05%TFA的超純水）、流動相B（含有0.05%TFA的超純水）=90：10進行純化，并得到了兩種大豆降糖肽：Glu-Ala-Lys和Gly-Ser-Arg.

3.3 GFC（凝膠過濾層析技術(shù)）

通常被稱為排阻層析，又被叫作分子篩層析，其目的是根據(jù)所分離的物質(zhì)的分子量而得到高純度的靶物。膠體層析技術(shù)的基本理論是：膠體在網(wǎng)格中能形成網(wǎng)格，并根據(jù)樣品的分子量、形狀等因素，將其存儲到網(wǎng)格中，從而達到分離的目的。蛋白質(zhì)和多肽的分離通常是通過凝膠過濾色譜法進行的。凝膠過濾層析技術(shù)采用具有一定孔徑的親水性凝膠顆粒。凝膠顆粒在使用前要先進行預(yù)處理，通常采用水溶解。在凝膠色譜中，常用的助劑有葡萄糖-G-25、SephadexG-15、大孔樹脂等。沈佳奇［51］利用Sephadex G-50葡聚糖凝膠純化獲得的麥芽根多肽仍對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性；宋曉光等［52］通過DA201-C大孔樹脂對水蛭活性肽進行純化，結(jié)果表明，該方法具有較好的純化效果。凝膠過濾色譜法具有試驗效率高、不損傷物質(zhì)結(jié)構(gòu)、重復(fù)性好且條件溫和等特點，但是，單一的分離純化效果不理想，因此常與其他分離提純方法結(jié)合。

綜上所述，在對食物源生物活性肽進行分離純化時需要研究者明晰原材料的特點，并結(jié)合不同的技術(shù)的優(yōu)缺點，采用多種分離技術(shù)結(jié)合的模式，實現(xiàn)食物源活性肽的精確分離（例如：超濾—離子交換色譜/凝膠過濾色譜/加壓毛細管電聚焦—反相液相色譜結(jié)合）。

4 食物源活性肽的生物功能特性

食物源生物活性肽的多種天然組成結(jié)構(gòu)形式?jīng)Q定了在其各種生理功能特性組合上具有極為豐富多樣性。研究者發(fā)現(xiàn)，食物源生物活性肽還具有顯著提高細胞抗氧化性、降血糖、降人體總脂蛋白膽固醇、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)功能等多項特殊生物活性。在人體改善細胞抗原心臟炎癥功能過程和人體調(diào)控心臟藥物的代謝過程和調(diào)控途徑中，也可發(fā)揮著極其重要而關(guān)鍵的調(diào)控作用。另外，還能具有在體外抗菌、識別體外免疫異常細胞、抗疲勞、改善提高人體骨代謝能力等多重功能特性。食物源生物活性肽研究人體功能活性多肽的試驗研究方法目前主要包括，通過在體內(nèi)進行的體內(nèi)動物功能試驗和體外動物免疫及細胞活性的試驗。通過體內(nèi)動物的功能活性多肽試驗，分析及判斷出其體內(nèi)潛在功能活性。體外生物細胞活性試驗分析研究結(jié)果可幫助有效評價鑒定體外各種生化物質(zhì)存在的同時對其宿主細胞分子系統(tǒng)的潛在生物學(xué)毒性作用程度和生物學(xué)功能活性。體外試驗鑒定技術(shù)方法相比體內(nèi)試驗技術(shù)研究方法存在技術(shù)較為先進方便、成本費用投入較低、重復(fù)性效果較好等多方面的綜合性優(yōu)點，但由于其自身又存在難于反映實際應(yīng)用且資料信息較少等諸多缺點。本節(jié)主要內(nèi)容將集中介紹食物源生物活性肽的ACE抑制作用、抗氧化能力、免疫調(diào)節(jié)活性。

4.1 ACE抑制作用（降血壓肽）

ACE可以通過抑制激肽酶、腎素酶—血管緊張素酶和激肽受體的協(xié)同作用而導(dǎo)致血壓持續(xù)升高。近年來，使用ACE蛋白治療高血壓已成為一個熱門話題［46］，蛋白水解時所生成的多肽能抑制ACE的功能，使其具有降壓作用。多肽的活性是由氨基酸和其分子結(jié)構(gòu)決定的，天然ACE抑制劑一般含有短鏈的氨基酸，它在降低血壓方面比人工合成的效果更好，并且無長期不良反應(yīng)。張可佳［19］從牡蠣中提取了一種具有ACE抑制作用的多肽，并應(yīng)用SHR模型對其進行了研究。馬志鷹［17］從駱駝血液中提取和提純了降壓活性肽，并采用液相色譜法檢測其抗ACE活性。

總之，食物源生物活性肽在ACE中的作用范圍內(nèi)存在著一定的抑制作用，并且由于其對ACE的親水和氨基酸的含量變化，從而導(dǎo)致了ACE的結(jié)構(gòu)發(fā)生畸變和失活。

4.2 抗氧化能力（抗氧化活性肽）

氧化壓力一般與心血管疾病等慢性疾病密切相關(guān)，利用外源的抗氧化劑來提高人體的抗氧化性是目前研究的熱點。有研究顯示，過量的自由基會導(dǎo)致糖尿病、癌癥、癡呆。在人體中，保持一定的自由基含量，在人體健康中扮演關(guān)鍵角色［53］。生物多肽對游離基的去除具有很好的效果［54］。目前國內(nèi)外已知的抗氧化肽種類很多，其中以動物源最多。此外，抗氧化肽還可以直接作為抑制劑、高效的自由基污染物的表面清除劑，或者直接作為過渡金屬化合物的先驅(qū)材料。它們通過清除自由基、提供電子或螯合金屬（如鐵）而發(fā)揮抗氧化作用。目前雖然一些人工和合成的天然植物抗氧化劑效果非常好，但總的來說它仍然具有一定的生物副作用性質(zhì)和化學(xué)毒性。天然的食物源生物活性肽等具有高選擇性的抗氧化、清除體外游離自由基能力等在內(nèi)的生物多重氧化功能特性，不同生物種類活性肽抗氧化反應(yīng)的能力之間也存在一些差異。一般來說，低小分子質(zhì)量度（0.5～1.5kDa）之間的、結(jié)構(gòu)上只需由少量的疏水性羥基化合物和一些游離芳香族氨基酸等組成的肽化合物，就會具有一種有較好還原程度的天然抗氧化性能的化學(xué)活性。熊明澤等［55］利用這種由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶單體和堿性蛋白酶單體聯(lián)合作用組成的復(fù)合酶體能對鴻雁骨膠原酶進行選擇性酶解。吳明澤等［56］利用中華圓田螺肉的酶解法，得到了具有抗氧化活性的多肽，并在體外進行了大量的體外實驗，發(fā)現(xiàn)分子量小于1 kDa的抗氧化肽的活性最高，其抗氧化肽的活性可達90%以上。王爽等［57］以驢血為原料通過添加不同蛋白酶，采用單因素實驗及響應(yīng)面法優(yōu)化得出DPPH自由基清除率為70.40%±1.33%，總抗氧化能力為（1.51±0.25）mmol/g的抗氧化活性肽。

綜合比較而言，食物源生物活性肽具有較為良好持久的酶體內(nèi)和外表面抗氧化反應(yīng)活性，其表面抗氧化作用能力還與產(chǎn)品制備加工方法、分子量及其大小、氨基酸序列組成息息相關(guān)。目前的研究主要集中在活性肽的功能活性上，后續(xù)應(yīng)進一步加強抗氧化肽的應(yīng)用穩(wěn)定性及加工適宜性研究，推進其市場化應(yīng)用。

4.3 免疫調(diào)節(jié)活性（免疫調(diào)節(jié)肽）

免疫調(diào)節(jié)肽免疫調(diào)節(jié)多肽是一種由食物源蛋白產(chǎn)生的多種免疫調(diào)節(jié)作用的多肽，是一種免疫調(diào)節(jié)小分子，通過刺激免疫細胞生長和提高身體的免疫力，對身體的免疫系統(tǒng)有重大影響。它的穩(wěn)定性和生物活性，不易造成人體的過敏性。目前已有很多研究顯示，免疫調(diào)節(jié)多肽在治療自身免疫和腫瘤方面具有重要的作用。因此，對不同來源的免疫調(diào)控肽進行深入的研究，對于人體健康有著十分重要的作用，并且對多種免疫調(diào)控蛋白的深入探討同樣具有十分重要的意義。除多種免疫治療之外，食物源活性成分也被認為是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的一部分［60］。付勱［61］以雞胚蛋為原料，采用最佳水解、分離等技術(shù)，得到了不同分子量的雞胚多肽，并以小鼠巨噬細胞為實驗材料，實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，巨噬細胞的生長速度和吞噬能力均有顯著提高。張東東［62］在實驗小鼠模型中對中國野生蛙皮的抗菌肽進行了體內(nèi)研究，得到了中國野生蛙皮分泌的兩種抗菌肽temproin-CEa和chensin-1b，經(jīng)實驗進一步證實，發(fā)現(xiàn)它們具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。

4.4 其他活性

此外，抗疲勞肽、降糖肽、神經(jīng)活性肽、酶調(diào)節(jié)及抑制肽、抗菌肽等也是目前研究的熱點。這些多肽具有保持身體健康的功效。

5 結(jié)論與展望

我國食物源蛋白質(zhì)資源極其廣泛豐富，食物源生物活性肽蛋白具有多種特殊生物功能。在有機食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)等相關(guān)行業(yè)里均具有極為廣闊的應(yīng)用價值前景，能夠真正為健康食品原料配方設(shè)計、開發(fā)研制提供附加價值。目前，人們多嘗試采用多種體外生化評價研究方法直接對多肽化合物的主要生物功能特性進行量化評價，許多具有良好生理作用的體外植物及實驗動物模型均已被證實，但其在生物臨床研究中的應(yīng)用卻受到技術(shù)上的制約。許多生物活性肽的生理機制還沒有完全闡明，有待于在今后更多的相關(guān)實驗中進行深入的分析和討論。根據(jù)以上介紹，研制食物源多肽促進食品健康轉(zhuǎn)化的主要功能特征，相關(guān)的產(chǎn)品多數(shù)已經(jīng)成熟進入中國市場，還有許多相關(guān)產(chǎn)品仍然處于前期開發(fā)準備階段，表明未來開發(fā)的食物源生物活性肽類產(chǎn)品具有巨大開發(fā)潛力。食物源生物活性肽的研究，在未來這幾年的最基本及發(fā)展的主攻方向仍然是通過研究發(fā)現(xiàn)這些具有新活性種類結(jié)構(gòu)的活性生物肽化合物，并根據(jù)研究結(jié)論揭示其多種潛在用途的價值和實際存在利用價值。這些特殊的天然保健活性營養(yǎng)功能成分及由于它對機體健康潛在產(chǎn)生的多種巨大健康好處，并可以進一步研發(fā)出具有實際相應(yīng)功能用途價值的多種新型食品保健及功能產(chǎn)品。另外，還意味著未來需要研究工作者不斷探索，提高多肽蛋白分離活性的提取純化新技術(shù)，以確保從多種復(fù)雜食物來源中產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)多肽并快速分離提取所需的活性肽。雖然現(xiàn)在對于我國目前關(guān)于食物源生物活性肽基礎(chǔ)研究仍然還存在著許多重大理論問題與不足，但是正是由于這些食物源生物活性肽原料來源范圍應(yīng)用廣泛、安全性要求極高、效果又比較明顯，在將來適合我國市場快速健康發(fā)展特點的生物活性肽食品產(chǎn)業(yè)上，仍具有非常好且廣闊的產(chǎn)業(yè)前景。