黃蘭英，張達娟，張樹林,通信作者，馬丞鴻，黃鶯

（1. 天津農學院 水產學院，天津 300392；2. 天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是目前世界上最重要的經濟蝦類之一，于1988年引入我國。因其具有適應力強、抗病力強、生長快及適合高密度養(yǎng)殖等優(yōu)點，在我國養(yǎng)殖得到迅速發(fā)展[1]。2019年全球對蝦產量530萬噸左右，而我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產量高達181萬噸[2]，穩(wěn)居全球首位。在凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖密度高、人工餌料大量投入等，養(yǎng)殖水體常呈現富營養(yǎng)化狀態(tài)，并極易引起藻類尤其是藍藻異常繁殖，從而產生以微囊藻（Microcystissp.）為主的藍藻水華并釋放微囊藻毒素（Microcystins，MCs），影響凡納濱對蝦的生長[3-4]。MCs是微囊藻屬、魚腥藻屬（Anabaenasp.）等藍藻產生的次級代謝產物[5]，具有嗜肝性[6]，可以破壞水生動物的肝細胞結構，導致肝細胞變形，引起肝功能失調[7-8]。MCs除積累在肝臟外，同時也存在于腎臟、膽囊、生殖腺、腸胃、肌肉等器官并產生生物毒性[9-10]，嚴重影響水生動物的正常生長、繁殖及其他生理過程[11]。MCs在動物體內累積一般通過直接接觸（腮和皮膚）、攝入產毒藍藻或已經積累毒素的動植物[12-13]等途徑實現。MCs存在多種異構體，以 MC-LR、MC-RR和MC-YR產量最大，分布最廣，研究最深入[8,14]，其中MC-LR為最常見且毒性最大[15]。因此，研究MC-LR對凡納濱對蝦的半致死濃度及毒性作用機制具有一定意義。不同生物對MCs的耐受性不同，與哺乳動物相比，魚類對MCs具有更強的耐受性[16]，如與家兔（Oryctolagus cuniculus）相比，鯽魚（Carassius auratus）表現出對MC-LR更強的耐受性[17]。同種生物不同個體大小對MC-LR的耐受性也不同，如 GON?ALVES-SOARES等[18]研究了 MC-LR 注射（11.0±1.9）g凡納濱對蝦96 h的LC50為100 μg/kg；王鑫[19]表明MC-LR對（2.1±0.5）g凡納濱對蝦的LC50為123.21 μg/kg。雖然目前已有微囊藻毒素對凡納濱對蝦半致死濃度的研究報道，但受試對蝦規(guī)格集中在2～15 g，缺少20 g及以上規(guī)格凡納濱對蝦的基礎數據。本研究以20 g左右凡納濱對蝦為試驗對象，采用不同濃度的MC-LR進行注射感染，計算不同濃度 MC-LR感染情況下凡納濱對蝦的死亡率及LC50，為凡納濱對蝦的科學養(yǎng)殖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凡納濱對蝦購于天津濱海新區(qū)海通江洋水產養(yǎng)殖專業(yè)合作社，體長（15.0±0.5）cm，體重（20±1）g，試驗前實驗室暫養(yǎng)5 d，暫養(yǎng)期間每天喂食1次，試驗前24 h停止喂食。試驗用水為曝氣 24 h后的自來水，海水晶調配鹽度至（7～8）‰，水溫（22±1）℃，溶解氧（7～8）mg/L，pH 8.0～8.5。暫養(yǎng)期間每天更換1/3體積水，暫養(yǎng)結束后隨機挑選大小一致、健康有活力的凡納濱對蝦用于急性毒性試驗。

微囊藻毒素標準品（MC-LR）購于臺灣Express（Express Technology Co.Ltd）公司，純度≥95%。毒性試驗前將標準品充分溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS）中。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

本試驗設1個對照組和3個處理組，處理組分別注射濃度為50、100和200 μg/kg（每千克蝦注射MC-LR量）磷酸緩沖液（PBS）溶解的MCLR，對照組不注射MC-LR（注射等體積 PBS），注射部位為對蝦第二腹節(jié)下血竇處，注射劑量20 μL。各處理組及對照組均設置3個平行，每個平行分別投放30尾蝦。試驗期間不喂食，其他養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同。從注射后開始，每4 h記錄對蝦死亡個數并及時剔除死亡個體（以對蝦側倒且附肢不運動為死亡標準），記錄96 h內對蝦死亡數。

1.2.2 微囊藻毒素配制及注射

MC-LR 用 PBS（NaCl 8 g，Na2HPO42.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g；蒸餾水定容至1 000 mL）溶解至一定體積配制成母液。按試驗各處理組將母液配置為對應三個濃度。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數據經過Excel 2010整理后，使用SPSS 26.0軟件中Probit程序計算24、48、72和96 h的LC50及相應的95%置信區(qū)間，并計算藥物毒性蓄積程度系數（MAC）[20]用于分析生物體對MC-LR蓄積和降減動態(tài)。安全濃度（SC）的計算公式如下：

SC=0.1 ×96 hLC50

式中96 h LC50為凡納濱對蝦感染MC-LR96 h后的半致死質量濃度值。

2 結果與分析

由表1可知，不同濃度MC-LR對凡納濱對蝦的影響不同。在96 h的急性毒性試驗過程中，對照組中對蝦未出現死亡情況，各濃度處理組對蝦死亡率隨 MC-LR濃度增加和試驗時間延長而上升。200 μg/kg MC-LR濃度組96 h死亡率為19%。

表1 不同濃度MC-LR注射凡納濱對蝦后24、48、72和96 h死亡率 %

MC-LR急性侵染凡納濱對蝦時間越長，半致死濃度越低，MC-LR對凡納濱對蝦24、48、72、96 h的LC50分別為 439.99、384.66、346.66、320.66 μg/kg。MC-LR對凡納濱對蝦的安全濃度為32.07 μg/kg，藥物毒性蓄積系數均為正值，分別為46.37%、31.84%及21.79%（表2）。

表2 MC-LR對凡納濱對蝦的急性毒性特征分析

3 討論

MCs嚴重影響水生動物生長繁殖，限制水產行業(yè)的發(fā)展。目前已有大量MCs對浮游動物、蝦、蟹和魚類毒性作用研究[21-24]。半致死濃度是衡量毒素對動物急性毒性作用強弱的關鍵指標，半致死濃度與毒素毒性作用呈負相關。研究MCs對水生動物的半致死濃度為水生動物對MCs抗性研究提供依據。不同生物對MC-LR的耐受性不同，張學振研究表明 MC-LR對鯽魚與家兔的半致死濃度分別為250和33 μg/kg[17]，鯽魚表現出對毒素有更強耐受性。MC-LR對白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、羅非魚（Oreochromis niloticus）的半致死濃度分別為270和790 μg/kg，羅非魚表現出對毒素有更強耐受性[25]；MC-LR對鹵蟲無節(jié)幼體12 h及 24 hLC50分別為 30.3（28.0-33.0）及 9.5（8.8-10.4）μg/mL[26]。MC-LR對不同種類的生物生化影響機制可能不同，所以不同生物對MC-LR的敏感度不同。本研究以0、50、100、200 μg/kg MC-LR注射凡納濱對蝦，發(fā)現MC-LR對凡納濱對蝦24、48、72和96 h的LC50（95%置信限）分別為 439.99（320.65～726.22）、384.66（288.428～625.669）、346.66（264.503～553.518）和 320.66（246.464～507.745）μg/kg。研究結果表明凡納濱對蝦對MC-LR具有較強的耐受性。

許多研究表明不同種生物對 MC-LR的耐受性不同，但同種生物不同個體大小對MC-LR的耐受性情況鮮有報道。MC-LR對凡納濱對蝦的LC50隨對蝦個體大小及感染 MC-LR的時間不同而不同（表3）。同種生物不同生長發(fā)育階段及不同個體大小對外界刺激的耐受程度不同[27-28]，凡納濱對蝦不同個體大小對MC-LR耐受程度不同。

表3 MC-LR對不同規(guī)格大小凡納濱對蝦急性毒性作用

毒物在生物體內的蓄積與降減程度是分析生物耐毒能力和評價毒物毒效的基礎。藥物毒性蓄積程度系數常用來分析生物體對毒物的蓄積與降減動態(tài)[30]，其值越大，毒效蓄積程度越大，生物抗毒能力越小，致死率越大；其值為正值時，蓄積作用強度大于降減作用；其值為負值時，降減作用強度大于蓄積作用。本研究表明，MC-LR對凡納濱對蝦的藥物毒性蓄積程度系數均為正值，表明 MC-LR在凡納濱對蝦體內的蓄積作用大于降解作用，且在24～48 h時出現最大值，表明這個時間段 MC-LR在凡納濱對蝦體內表現出較強的蓄積作用，即為死亡高峰階段。過此階段后，藥物毒性蓄積程度系數下降，表明凡納濱對蝦對MC-LR的抵抗能力上升，毒性減弱。

水體富營養(yǎng)化導致藍藻水華爆發(fā)，藍藻爆發(fā)產生的MCs對凡納濱對蝦等水生生物的安全產生影響。低劑量 MCs對水生生物不具有致死效應，但易在水生生物體內富集[31-32]，PRIETO等研究發(fā)現，低劑量MC-LR則會使機體經過長時間誘導而使機體產生防御反應，這種防御反應被解釋為機體應對MCs感染而表現出的一種補償機制，表現為抗氧化酶活性增加[33]。因此，低劑量MC-LR對凡納濱對蝦不具有致死效應，但會使對蝦對MC-LR的耐受性增強。本研究所用凡納濱對蝦于7月底取自室外池塘，隨著大量餌料投入導致水體富營養(yǎng)化及氣溫升高，藍藻生物量及藻毒素釋放量升高。本研究中凡納濱對蝦對MC-LR表現出更強的耐受性，可能是由于凡納濱對蝦在池塘中受到低濃度MC-LR感染而產生防御反應。

4 結論

凡納濱對蝦對不同濃度 MC-LR表現出梯度致死效應，其死亡數隨MC-LR濃度升高而增大。MC-LR對凡納濱對蝦24、48、72和96 h的LC50分別為 439.99、384.67、346.66 和 320.66 μg/kg，表明凡納濱對蝦對 MC-LR具有較強的耐受性。MC-LR對凡納濱對蝦的藥物毒性蓄積程度系數表明，MC-LR在凡納濱對蝦體內的蓄積作用大于降解作用，在24～48 h出現死亡高峰階段，過此階段后，藥物毒性蓄積程度系數下降，表明凡納濱對蝦對MC-LR的抵抗能力上升。