李艷秋 丁超 胥國(guó)強(qiáng) 劉娟 王欣

(遂寧市中心醫(yī)院1.血液科；2.檢驗(yàn)科，四川 遂寧 629000)

骨髓增殖性腫瘤(Myeloproliferative neoplasms，MPN)是一種因骨髓中一系或多系骨髓細(xì)胞持續(xù)異常增殖引起的血液系統(tǒng)克隆性疾病，臨床以血栓、出血、脾大等為主要表現(xiàn)，隨著病情進(jìn)展可轉(zhuǎn)化為骨髓纖維化及急性白血病，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)MPN患者存在不同的基因突變，給臨床MPN的診斷及患者預(yù)后評(píng)估帶來了極大的便利[4-5]。p53基因是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的一種基因，與乳腺癌、食管癌、多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，可為多種腫瘤疾病的靶向治療提供參考依據(jù)[6-7]。已有研究證實(shí)，p53基因突變?cè)诠撬柙錾惓＞C合征(Myelodysplastic syndromes,MDS)的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[8]，但有關(guān)p53基因突變?cè)贛PN患者中的分布情況研究報(bào)道較少。本研究分析了p53基因突變與MPN臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在加強(qiáng)對(duì)MPN發(fā)病機(jī)制的理解，為MPN預(yù)后不良高風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月～2020年1月我院收治的MPN患者126例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床檢查符合2008年WHO頒布的造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)MPN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，且均經(jīng)骨髓檢查、影像學(xué)檢查、組織活檢等確診。②患者性別不限，年齡≥18歲，均為初診患者。③一般臨床資料、實(shí)驗(yàn)室資料完整患者。④患者知情同意，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他血液腫瘤患者。②既往存在MPN治療史患者。③合并重要臟器功能障礙、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病患者。④存在嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙，難以配合治療患者。126例MPN患者中男性71例，女性55例，年齡35～70歲，平均(56.73±10.24)歲；真性紅細(xì)胞增多癥(PV)47例、原發(fā)性血小板增多癥(ET)64例、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)15例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床資料收集 收集患者的性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)疾病史(糖尿病、高血壓)、血紅蛋白(HB)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、骨髓原始細(xì)胞比例、脾腫大和血栓栓塞發(fā)生情況等一般臨床資料。

1.2.2 染色體核型分析及預(yù)后分層 患者就診后行骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓血0.2～0.3 mL培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，收集骨髓細(xì)胞常規(guī)制片，采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析；根據(jù)患者染色體核型結(jié)果參考國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IPSS)染色體核型分組標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行染色體核型預(yù)后分層，分為低危、中危和高危。

1.2.3p53基因突變檢測(cè) 所有患者均于首次治療前取空腹靜脈血5 mL，低溫離心后分離血漿和血細(xì)胞，血細(xì)胞層用于提取基因組DNA。取樣品基因組DNA 10～17 ng，采用Ion Torrent檢測(cè)平臺(tái)中的Ion Ampliseq超高多重PCR靶向技術(shù)，富集112個(gè)血液腫瘤相關(guān)基因。采用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)p53基因突變情況，平均基因覆蓋率為97.10%，平均測(cè)序深度為1314×；測(cè)序后數(shù)據(jù)利用dbSNP、1000genome、polyphen2、cosmic等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選和突變驗(yàn)證。

1.2.4 隨訪 所有患者均于確診之日起進(jìn)行隨訪，隨訪形式包括門診定期隨訪、問卷及電話隨訪。隨訪截止時(shí)間為2021年6月30日，中位隨訪時(shí)間為20.0(3.0～54.0)個(gè)月，總生存(OS)時(shí)間定義為確診之日至死亡或末次隨訪時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 MPN患者p53基因突變情況分析 126例MPN患者中，12例(9.52%)患者檢出p53基因突變，突變分別位于4號(hào)(4/12)、6號(hào)(3/12)、5號(hào)(2/12)、8號(hào)(2/12)和7號(hào)(1/12)外顯子上。不同類型患者的p53基因突變檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同類型MPN患者p53基因突變情況分析[n(×10-2)]Table 1 Analysis of p53 gene mutations in patients with different types of MPN

2.2p53基因突變患者與非突變患者臨床特點(diǎn)分析p53突變組患者年齡大于p53非突變組，WBC水平低于p53非突變組(P<0.05)；兩組患者的性別、BMI、基礎(chǔ)疾病、HB、PLT、骨髓原始細(xì)胞比例、脾腫大和血栓栓塞發(fā)生情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 p53基因突變患者與非突變患者一般臨床資料比較Table 2 Comparison of general clinical data of patients with p53 gene mutations and non-mutated patients

2.3p53基因突變患者與非突變患者染色體核型及預(yù)后分層分析 兩組患者的染色體核型、IPSS預(yù)后分層比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 p53基因突變患者與非突變患者染色體核型及預(yù)后分層分析[n(×10-2)]Table 3 Chromosomal karyotype and prognostic stratification analysis of p53 gene mutation patients and non-mutated patients

2.4p53基因突變與MPN患者預(yù)后的關(guān)系 截至末次隨訪日，126例MPN患者中24例(19.05%)患者死亡，其中p53突變組死亡5例(41.67%)，p53非突變組死亡19例(16.67%)。p53非突變組患者的OS時(shí)間、累計(jì)生存率均明顯高于p53突變組患者，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 p53基因突變患者與非突變患者預(yù)后情況分析Table 4 Analysis of the prognosis of patients with p53 genemutations and non-mutated patients

圖1 p53基因突變患者與非突變患者生存曲線Figure 1 Survival curves of p53 gene mutation patients and non-mutantpatients

3 討論

既往研究表明，炎癥因子、表觀遺傳學(xué)突變及造血微環(huán)境的改變是MPN發(fā)生發(fā)展的重要因素，隨著全基內(nèi)組和靶向測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，多種基因在MPN發(fā)生及轉(zhuǎn)歸中的作用被揭示[10-11]。p53基因是一種經(jīng)典的抑癌基因，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、基因修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定性的作用，其突變或功能缺失會(huì)影響細(xì)胞正常周期，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-13]。臨床研究證實(shí)，在人類所有的腫瘤中，p53基因突變率高達(dá)50%，并且合并p53基因突變的患者預(yù)后較未突變者更差[14]。盡管p53基因在實(shí)體腫瘤中具有較高的突變率，但其在血液系統(tǒng)腫瘤中的突變率普遍較低，為5%～10%。一項(xiàng)有關(guān)人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者p53基因突變的分子遺傳學(xué)特征分析研究發(fā)現(xiàn)，約有9.1%的AML患者存在p53基因突變[15]。本研究結(jié)果顯示，p53基因突變?cè)贛PN患者中的發(fā)生率為9.52%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。對(duì)p53基因突變位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，p53突變位點(diǎn)主要位于4～10號(hào)外顯子上[16]。本研究中，MPN患者的p53基因突變位于4～8外顯子，與既往研究結(jié)果一致。本研究未發(fā)現(xiàn)不同類型MPN患者的p53基因突變檢出率存在差異，提示p53基因突變檢測(cè)可能無法為MPN的不同類型鑒別提供依據(jù)。

進(jìn)一步分析不同突變情況患者的臨床資料可知，p53突變組患者年齡大于p53非突變組，WBC水平低于p53非突變組，提示p53基因突變多發(fā)生于年長(zhǎng)患者，且對(duì)患者的WBC水平有一定影響。Li等[17]對(duì)MDS患者的p53基因突變情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)p53基因突變?cè)谳^年長(zhǎng)MDS患者中更常見，認(rèn)為p53基因突變頻率會(huì)隨著年齡的增加而逐漸增高。本研究的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

染色體核型異常是影響血液系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后的重要因素，其中復(fù)雜核型被認(rèn)為是高危核型異常，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[18-19]。此外，IPPS較高危分組也是影響MDS、AML等血液系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，p53基因突變患者與非突變患者的染色體核型、IPSS預(yù)后分層存在明顯差異，提示p53基因突變與MPN患者的異常核型及中高危IPSS預(yù)后分層相關(guān)。分析相關(guān)原因可能是p53基因突變影響了基因組穩(wěn)定性，出現(xiàn)染色體異常，從而使患者染色體核型發(fā)生變化[22-23]。近年來相關(guān)研究表明，p53基因突變?cè)谑彻馨⑷橄侔┲袝?huì)導(dǎo)致更差的OS，均為獨(dú)立的預(yù)后不良因素[24-25]。本研究結(jié)果顯示，p53非突變組患者的OS時(shí)間、累計(jì)生存率均明顯高于p53突變組患者，提示p53基因突變會(huì)影響患者的預(yù)后。

4 結(jié)論

骨髓增殖性腫瘤患者p53基因突變發(fā)生率較高，與患者年齡、WBC水平、異常核型及IPSS預(yù)后分層相關(guān)；p53基因突變會(huì)影響患者的預(yù)后，可作為臨床篩查預(yù)后不良高風(fēng)險(xiǎn)人群的客觀指標(biāo)。