王鑫 成慧昕 李祥 于湘友 楊春波

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)中心，新疆 烏魯木齊 830054)

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而引起危及生命的器官功能障礙的疾病[1]?？股刂委煛⒏腥驹纯刂?、液體復(fù)蘇及血管活性藥物的應(yīng)用是目前膿毒癥治療的基石[2-4]，免疫治療、體外血液凈化等療法也被視為控制膿毒癥炎癥反應(yīng)的輔助手段[3,5]。連續(xù)血液凈化(Continuous blood purification,CBP)可在一定程度上控制機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)失衡、降低機(jī)體細(xì)胞因子風(fēng)暴、減輕臟器功能損傷[6]。然而，大規(guī)模的RCT研究及Meta分析提示體外血液凈化治療并未顯著改善膿毒癥患者的臨床預(yù)后[7-9]。腸道既是膿毒癥的“始動(dòng)因素”，也是膿毒癥器官損傷的靶點(diǎn)[10]。腸道內(nèi)環(huán)境紊亂、微循環(huán)障礙、炎性因子風(fēng)暴、腸道動(dòng)力障礙、菌群失調(diào)及移位等因素共同作用，可加重腸道黏膜屏障的破壞[11]。在內(nèi)源性及外源性刺激下，NOD樣受體家族核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NOD-like receptor family， pyrin domaincontaining 3，NLRP3)炎癥小體可通過(guò)同型相互作用招募ASC、caspase-1前體激活caspase-1，繼而引起促炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的成熟及釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[12]。現(xiàn)有研究提示，NLRP3炎癥小體活化與膿毒癥導(dǎo)致的多器官損傷密切相關(guān)[13]。膿毒癥患者應(yīng)用CBP治療對(duì)于腸道黏膜屏障功能的研究相對(duì)較少,缺乏相應(yīng)的研究基礎(chǔ)，CBP治療是否影響NLRP3炎癥小體的研究缺乏理論支持。因此，本文就連續(xù)血液凈化治療對(duì)膿毒癥患者腸道屏障功能、NLRP3炎癥小體及臨床預(yù)后的影響進(jìn)行探討和分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用前瞻性研究方法，納入2019年5月～2021年5月入住新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)(ICU)中心的符合Sepsis 3.0標(biāo)準(zhǔn)[1]的膿毒癥患者作為研究對(duì)象。根據(jù)進(jìn)行CBP治療將其分為膿毒癥常規(guī)治療組及膿毒癥CBP治療組。同時(shí)納入同期入住ICU的非膿毒癥患者作為對(duì)照組。 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18周歲；膿毒癥組患者符合Sepsis 3.0的診斷標(biāo)準(zhǔn)；入住ICU時(shí)間≥3 d；取得患者或患者家屬的知情同意；臨床資料齊全。 排除標(biāo)準(zhǔn)：患者或家屬拒絕；既往存在慢性胃腸道疾病或伴有胃腸道惡性腫瘤；免疫系統(tǒng)疾病患者；入院72 h內(nèi)死亡或自動(dòng)出院者；妊娠或哺乳期患者。本研究作為前瞻性研究不對(duì)臨床治療進(jìn)行干預(yù)，僅對(duì)不同組別的患者進(jìn)行血液標(biāo)本的收集，與患者或家屬充分溝通獲得同意后進(jìn)行。本研究已通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：20200624-14)，并在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心進(jìn)行注冊(cè)且通過(guò)審核(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR 2000040813)。本研究共納入100例，排除ICU住院時(shí)間<72 h(4例)、既往存在慢性胃腸道疾病(6例)、伴有胃腸道惡性腫瘤及孕產(chǎn)婦等(7例)，最終納入83例研究對(duì)象。其中非膿毒癥組24例、膿毒癥常規(guī)治療組35例、膿毒癥CBP治療組24例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 收集3組患者各時(shí)點(diǎn)的第0、1、3天的外周血樣本：非膿毒癥患者在入住ICU第0、1、3天；膿毒癥常規(guī)治療組為診斷膿毒癥時(shí)的第0、1、3天；膿毒癥CBP治療組則為進(jìn)行CRRT上機(jī)前(第1天)、經(jīng)上機(jī)治療后第3天(清晨08∶00)進(jìn)行血液標(biāo)本的收集。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) RNA提取：相同時(shí)間點(diǎn)收集的外周血5 mL，提取外周血淋巴細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體相關(guān)指標(biāo)的RNA。引物的設(shè)計(jì)由生工生物工程(上海)股份有限公司在線設(shè)計(jì)。RT-PCR：應(yīng)用SYBR法,體系為20 μL?；旌弦餅?.2 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，cDNA模板100ng，添無(wú)酶水至20 μL(所有操作均在冰上進(jìn)行)。應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC以及GAPDH的mRNA表達(dá)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定血清相關(guān)指標(biāo) 嚴(yán)格按ELISA試劑盒(武漢華美公司)說(shuō)明書步驟操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定及分析。測(cè)定指標(biāo)包括腸道損傷指標(biāo)血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Serum intestinal fatty acid binding protein，I-FABP)、炎癥因子IL-1β、IL-18的水平。

1.2.4 其他資料 IL-6、降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、肌酐、BUN等采用新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心的數(shù)據(jù)。同時(shí)記錄入住ICU 24 h急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(APACHE Ⅱ)、入住ICU24 h內(nèi)及第3天(或血液凈化治療后)的急性胃腸功能損傷 (Acute gastrointestinal injury，AGI)評(píng)分、年齡、基礎(chǔ)疾病等。電話隨訪患者28 d生存情況。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者在性別、BMI、基礎(chǔ)疾病(糖尿病除外)、感染部位(非膿毒癥組顱內(nèi)感染占比較高)等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；與非膿毒癥組相比，膿毒癥組常規(guī)治療、CBP治療年齡較小(P<0.05)；而膿毒癥CBP治療組的APACHEⅡ評(píng)分及28 d死亡率等方面明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料情況對(duì)比Table 1 Comparison of general information at ICU admission

2.2 3組患者臨床指標(biāo)比較 組間比較：患者第1天與第3天，3組患者APACHEⅡ評(píng)分、PCT、IL-6、肌酐、BUN比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，治療后第3天，3組患者血清NE%水平比較差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較：第3天非膿毒癥組患者CRP較第1天顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第3天膿毒癥常規(guī)治療組、膿毒癥CPB組患者血乳酸含量較第1天明顯降低，且膿毒癥CPB組患者BUN相較于第1天明顯下降(P<0.05)，然而其余指標(biāo)第3天較第1天相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組患者常見(jiàn)臨床指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of common clinical indicators in each group

2.3 3組患者外周血淋巴細(xì)胞中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的基因表達(dá)情況 組間比較：第1天，膿毒癥常規(guī)治療組和膿毒癥CBP治療組的NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA水平較非膿毒癥組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。 組內(nèi)比較：膿毒癥常規(guī)治療組患者第3天的NF-κB p65及NLRP3炎癥小體的mRNA水平較第1天相比有所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，第3天膿毒癥CBP治療組患者各指標(biāo)較第1天均有顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組患者PBL中NF-κB p65、NLRP3炎癥小體的mRNA水平比較Table 3 Mrna levels of NF-Κb P65 and NLRP3 inflammatory bodies in PBL of each group

2.4 3組患者外周血IL-1β、IL-18的水平 組間比較：第1天，膿毒癥CBP治療組的IL-1β與IL-18的水平顯著高于非膿毒癥組(均P<0.05)，而與膿毒癥常規(guī)治療組相比，僅有IL-18的水平較高(P<0.05)。第3天時(shí)，膿毒癥CBP治療組的IL-1β與IL-18均顯著高于非膿毒癥組；與膿毒癥常規(guī)治療組相比，膿毒癥CBP治療組的IL-1β有明顯增加。組內(nèi)比較：膿毒癥常規(guī)治療組、膿毒癥CBP治療組第3天IL-18的水平較第1天均顯著降低(均P<0.05)，且膿毒癥CBP治療組患者第3天IL-1β水平較第1天下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非膿毒癥組患者第1天與第3天各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組患者外周血IL-1β、IL-18的水平比較[M(P25,P75)，ng/L]Table 4 Comparison of il-1 β and IL-18 levels in peripheral blood

2.5 3組患者外周血I-FABP、AGI評(píng)分的比較 組間比較：膿毒癥常規(guī)治療、膿毒癥CBP治療組的I-FABP水平、AGI評(píng)分較非膿毒癥組均明顯增加(均P<0.05)；而膿毒癥CBP治療組的AGI評(píng)分在上述時(shí)點(diǎn)均顯著高于膿毒癥常規(guī)治療組(均P<0.05)。 組內(nèi)比較：非膿毒癥組與膿毒癥常規(guī)治療組第3天各指標(biāo)較第1天升高，但僅有膿毒癥常規(guī)治療組患者I-FABP水平變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，膿毒癥CBP治療組第3天的I-FABP水平與AGI評(píng)分較第1天明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 3組患者I-FABP、AGI評(píng)分的比較[M(P25,P75)]Table 5 Comparison ofI-FABP and AGI scores in each group

3 討論

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的常見(jiàn)病、多發(fā)病，對(duì)國(guó)家、社會(huì)及家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重威脅人民的健康福祉。2020年我國(guó)ICU內(nèi)膿毒癥的發(fā)病率為20.6%，較2014年發(fā)病率有所下降，但90天病死率仍高達(dá)35.5%[14]。研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在膿毒癥所造成的腎、肝及肺等臟器損害中具有重要作用，近年來(lái)越來(lái)越多的研究將其做為膿毒癥治療的靶點(diǎn)之一[12,15]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清中IL-1β、IL-18均明顯高于非膿毒癥者，這與Garnacho等[16]得出的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明NLRP3炎癥小體活化參與膿毒癥發(fā)生發(fā)展。此外，本研究發(fā)現(xiàn)相較其他兩組，膿毒癥CBP治療組在上機(jī)前、上機(jī)后3天I-FABP、AGI評(píng)分顯著增高，同時(shí)NLRP3炎癥小體的mRNA的表達(dá)水平也進(jìn)一步增加，提示膿毒癥疾病進(jìn)展造成的胃腸道功能障礙可能與NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。既往的研究也對(duì)此觀點(diǎn)進(jìn)行論證，研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥動(dòng)物模型發(fā)生腸道屏障功能障礙時(shí)，存在腸道組織中的NLRP3炎癥小體表達(dá)升高[17-18]。同時(shí)Feng等[19]在抗生素誘導(dǎo)的腸道損傷的模型中發(fā)現(xiàn)， NLRP3炎癥小體在活化的同時(shí)伴有腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1降低，因此膿毒癥腸道功能障礙可能與腸道連接蛋白Occludin、Claudin-1表達(dá)減少及NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。

目前，血液凈化治療已成為重癥患者重要的輔助治療手段，在臨床工作中應(yīng)用廣泛，本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥CBP治療組經(jīng)過(guò)治療后IL-6有所降低，但與上機(jī)前相比并無(wú)明顯差異，可能與本組患者的疾病仍處于進(jìn)展當(dāng)中或納入的樣本量過(guò)少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示血液凈化降低了外周血淋巴細(xì)胞中的NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的水平，提示血液凈化治療可以有效清除外周血淋巴細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的水平。Bellomo等[20]于1993 年發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CVVHDF(持續(xù)靜脈-靜脈血液透析濾過(guò)) 可顯著降低膿毒癥合并急性腎衰竭患者的炎癥因子水平，如TNF-α、IL-1β。但Cole等[21]應(yīng)用CVVH(2L/h)治療膿毒癥休克或存在器官功能不全的膿毒癥患者，結(jié)果提示許多炎癥因子水平降低與是否應(yīng)用CVVH無(wú)關(guān)。但Zuccari等[22]在對(duì)膿毒癥/膿毒性休克患者應(yīng)用CytoSorb進(jìn)行CRRT治療中僅發(fā)現(xiàn)了IL-8明顯降低。一項(xiàng)納入22個(gè)國(guó)家130個(gè)中心的研究提示， CytoSorb(CS)吸附柱的應(yīng)用可能降低膿毒癥患者IL-6的水平，但該研究觀察到的死亡率高達(dá)為65%[23-24]。

本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥CBP治療組的I-FABP、AGI評(píng)分較上機(jī)前有明顯的降低，提示連續(xù)血液凈化治療可能改善患者胃腸道功能，可能與其清除炎癥介質(zhì)、減輕機(jī)體負(fù)荷有關(guān)與須欣等[25]的研究相符。此外，終末期腎病患者采用組合式血液凈化模式(HD+HDF+HP)可顯著降低終末期腎病患者炎癥因子水平，并可能通過(guò)改善體內(nèi)微炎癥狀態(tài)來(lái)提供更好的腸道菌群多樣性，提示血液凈化對(duì)腸道具有一定的保護(hù)作用[26]。

本研究膿毒癥CBP治療組的28 d存活患者僅為29.17%(7/24)，明顯低于膿毒癥常規(guī)治療組，但該組患者APACHEⅡ評(píng)分較高及臨床結(jié)局較差，這可能與患者應(yīng)用血液凈化啟動(dòng)時(shí)機(jī)、感染嚴(yán)重程度以及其他臟器功能障礙等有關(guān)。血液凈化對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后等方面由于本研究樣本量較少，亟需更多的RCT研究，以期明確血液凈化在膿毒癥中應(yīng)用的價(jià)值。

4 結(jié)論

膿毒癥血液凈化治療可能減少外周血淋巴細(xì)胞中 NLRP3 炎癥小體的活化，繼而減少膿毒癥患者體內(nèi)炎癥因子水平，改善膿毒癥患者胃腸道屏障功能。