代澤詠 駱芷寒 王禹蒙 劉延友 肖靜 汪宇輝 郭慧玲 江舟

(四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院·國家衛(wèi)生健康委員會時間生物學重點實驗室，四川 成都 610041)

芫根，又名蕪青、蔓菁，藏語名為妞瑪，維語名為恰瑪古，十字花科蕓薹屬蕓薹種蕪菁亞種二年生草本植物[1]，是川藏高原地區(qū)頗具特色的蔬菜資源，也是當?shù)刂匾慕?jīng)濟作物[2]。芫根富含生物堿、多糖、維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸、黃酮類、粗蛋白、槲皮素、甾體等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，有食、藥、飼三大應(yīng)用價值[3]。芫根的藥理學研究顯示，芫根提取物在降血糖[4]，抗缺氧[5]，抗腫瘤[6]，改善腸道菌群和調(diào)節(jié)免疫[7-8]，抗疲勞[9]等多重功效，提示芫根的藥用價值不可估量。目前關(guān)于芫根藥理功效的研究還停留在其原料提取、動物實驗及驗證等方面，有關(guān)芫根改善機體免疫功能的分子生物學機制研究還是空白。小腸是機體最主要的食物消化和物質(zhì)吸收器官，同時也是最大的免疫器官和免疫前哨站[10]。本課題組擬在前期的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測芫根對小鼠小腸組織全基因表達譜的影響，一方面對系統(tǒng)闡明芫根的免疫調(diào)節(jié)功能及分子生物學機制有重要的意義，為合理表征芫根的性效及拓寬其臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)，從而給發(fā)掘利用這種川藏特色經(jīng)濟作物資源提供科學指導(dǎo)；另一方面，相關(guān)機制可以作為指導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)的篩選標準之一，給相關(guān)藥物靶點的篩選和新藥的研究開發(fā)等工作提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物分組 雄性SPF級BALB/c小鼠18只購買自四川成都達碩動物有限公司，周齡8周左右，體重18～20g。將小鼠飼養(yǎng)在光暗節(jié)律12L:12D的光暗循環(huán)箱，室溫(25±2)℃，保持動物室安靜，小鼠自由飲水和進食，適應(yīng)新環(huán)境兩周使小鼠狀態(tài)同步化。然后將小鼠隨機分為3組，每組6只，SC1組灌胃芫根提取液，SC2組灌芫根原漿懸液，NC組灌胃生理鹽水。芫根提取液和芫根原漿懸液由四川小葉本草生物科技有限公司生產(chǎn)提供。按規(guī)格，小鼠(20 g)的單次劑量：人(70 kg)的單次劑量=1∶387.9，經(jīng)計算后，SC1組小鼠每只每次灌胃 150 μL 芫根提取液，SC2組小鼠每只每次灌胃 150 μL芫根原漿懸液，NC組小鼠每只每次灌胃 150 μL生理鹽水，每日灌胃一次，連續(xù)7 d。本研究通過動物倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小腸RNA的提取與測序 小鼠灌胃7 d后用勁椎脫臼法處死，每組隨機取3只小鼠取小腸樣本，使用PBS溶液清洗3遍。按照福際生物RNA提取試劑盒說明書提取總RNA?？俁NA經(jīng)質(zhì)檢合格后，采用 Illumina Hiseq4000 進行測序，測序讀長為雙端 2*150bp(PE150)。

1.2.2 基因水平差異表達研究及制圖 利用上述數(shù)據(jù)分析程序?qū)蛩奖磉_差異展開研究，以參考基因組為基準利用Hisat軟件將3組測序數(shù)據(jù)分別兩兩比對，利用比對后的結(jié)果(alignments)參與組裝轉(zhuǎn)錄本。然后使用edgeR對NC組基因分別與SC1組和SC2組基因的差異表達分析，最后采用R語言圖形化以差異倍數(shù)log2(foldchange)為橫坐標，顯著水平-log10(p value)為縱坐標，顯著差異的閾值為|log2foldchange|≥1，P<0.05，進行基因表達差異評估，對差異表達的所有基因繪制火山圖。

1.2.3 差異表達基因GO功能富集性分析 對差異表達基因的GO功能富集分析可了解功能組基因的富集情況，富集程度高提示兩組在此功能方面的差異效應(yīng)顯著，該GO功能基因組比較重要。首先把所有顯著性差異表達基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的各功能基因組映射，計算每個功能基因組的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在顯著性差異表達基因中顯著富集的GO條目(P<0.05)。采用edgeR對GO富集分析結(jié)果以散點圖展示。

1.2.4 差異表達基因KEGG信號通路富集性分析 基于信號通路的分析有助于更進一步了解基因的生物學效應(yīng)。在生物體內(nèi)，不同基因需要通過相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，KEGG是有關(guān)信號通路的主要公共數(shù)據(jù)庫，通過差異基因的KEGG富集分析了解哪些信號通路對應(yīng)的基因富集較多。信號通路基因顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在顯著性差異表達基因中顯著性富集的信號通路(P<0.05)，采用edgeR對KEGG富集分析結(jié)果以散點圖展示。

1.2.5 免疫通路差異表達基因熱圖繪制 為了更好地直觀反映免疫功能和信號通路相關(guān)基因的差異表達和聚類表達模式，我們采用 log10(FPKM+1)進行基因表達展示，同時將差異表達基因 FPKM 通過Z值方式進行基因表達展示(P<0.05)。選取SC1組和SC2組中發(fā)生同向表達差異的免疫通路相關(guān)基因，橫坐標為樣本，縱坐標為基因，不同的顏色表示不同的基因表達水平，顏色由藍色經(jīng)由白色至紅色 表示表達量從低到高。紅色表示高表達基因，藍色表示低表達基因。

2 結(jié)果

2.1 小鼠小腸的轉(zhuǎn)錄譜表達差異分析 小鼠小腸樣品轉(zhuǎn)錄組測序共檢測到27733條 mRNA的表達，通過繪制火山圖能可視化差異表達基因的整體分布情況。 差異基因的整體分布情況見火山圖(圖1A、B)。與NC組相比，SC1組灌喂芫根提取液小鼠腸道表達上升基因有1236個，SC2組灌喂絞碎芫根原漿懸液小鼠腸道表達上調(diào)基因有2233個；相比對照組，SC1和SC2組分別有399和639個基因表達水平下調(diào)(圖1C)。其中，有1287個基因在SC1組灌喂芫根提取液小鼠和SC2組灌喂絞碎芫根原漿懸液小鼠均同向差異表達(圖1D)。

圖1 小鼠小腸的轉(zhuǎn)錄譜表達差異分析Figure 1 Differential analysis of transcription profile expression in small intestine of mice注：A、B分別為差異表達基因火山圖，橫坐標代表基因在不同樣本中差異表達倍數(shù)變化，縱坐標代表基因表達量變化差異的統(tǒng)計學顯著性，紅色代表上調(diào)的顯著差異表達基因，藍色代表下調(diào)的顯著差異表達基因，灰色的點代表非顯著性差異表達基因；C.差異表達分析基因柱狀圖；D.差異表達分析基因韋恩圖

2.2 差異表達基因GO功能富集性分析 GO功能富集分析結(jié)果以散點圖展示，富集度前20位，采用ggplot2對GO富集分析結(jié)果以散點圖展示，Rich factor表示位于該GO的差異基因個數(shù)/位于該GO的總基因數(shù)，Rich factor越大，GO富集程度越高(P<0.05)，見圖2；其中細胞對干擾素的反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答、多細胞機體發(fā)育、白細胞介素分泌、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控是SC1組、SC2組差異表達基因GO功能富集度均位于前20的功能基因組，見表1。

表1 SC組差異表達基因GO功能富集度均位于前20的功能基因組Table 1 The GO enrichment degree of differentially expressed genes in SC group was all in the top 20 functional genomes

圖2 差異表達基因GO功能富集性分析Figure 2 GO functional enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 差異表達基因KEGG信號通路富集性分析 KEGG信號通路富集分析結(jié)果以散點圖展示，富集度前20位，采用ggplot2對KEGG富集分析結(jié)果以散點圖展示，Rich Factor表示位于該KEGG的差異基因數(shù)/位于該KEGG的總基因數(shù)，Rich Factor值越大，KEGG富集程度越大(P<0.05)，見圖3；其中維生素消化和吸收、T細胞受體信號通路、脂肪消化和吸收是SC1組、SC2組差異表達基因KEGG信號通路富集度均位于前20的信號通路基因組，見表2。

圖3 差異表達基因KEGG富集性分析Figure 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

表2 SC組差異表達基因KEGG信號通路富集度均位于前20的信號通路基因組Table 2 KEGG signal pathway enrichment degree of differentially expressed genes in SC group was all in the top 20 signal pathway genomes

2.4 白細胞介素分泌相關(guān)基因表達 差異基因聚類分析用于判斷基因在不同實驗條件下調(diào)控模式的聚類模式。根據(jù)樣品基因表達譜的相近程度，將基因進行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品(或是不同處理)中的表達情況，由此獲取生物學相關(guān)信息。根據(jù)前面差異表達基因富集度的結(jié)果，重點結(jié)合免疫相關(guān)通路，我們選擇了白細胞介素分泌、細胞對干擾素的反應(yīng)、T細胞受體信號通路的差異表達基因制圖進行聚類分析。芫根處理小鼠后，小鼠小腸中Ccl20、Il18、Il1a、Il2rg、Cd274等21個白細胞介素分泌相關(guān)基因發(fā)生顯著性差異表達。其中19個基因表達上調(diào)，2個基因表達下調(diào)(圖4)。表達下降的Ccl20和Il18是主要分布在腸道黏膜層炎性趨化因子的基因，表達上調(diào)的大多屬于白介素配體和相關(guān)受體亞基蛋白基因，如Il1和Il2rg等。Cd274是經(jīng)典活化型巨噬細胞表面特異表達的抗原分化簇的基因，也呈表達上升趨勢。

圖4 白細胞介素分泌過程相關(guān)基因表達變化熱圖Figure 4 Heat map of interleukin secretion related gene expression changes

2.5 細胞對干擾素的反應(yīng)相關(guān)基因表達 芫根處理小鼠后，小鼠小腸中Ifng、Ifnar1、Ifngr2、Ifit3、Cd274等共30個細胞對干擾素反應(yīng)相關(guān)基因發(fā)生顯著性差異表達。其中25個基因表達上調(diào)，5個基因表達下調(diào)(圖5)。此系統(tǒng)里有多個基因同屬上述白介素系統(tǒng)，干擾素誘導(dǎo)蛋白家族基因里Ifit3和Ifit1表達下調(diào)，其余Ifit表達上升。與此相應(yīng)，各種干擾素基因和受體亞基基因也均上調(diào)表達。

圖5 細胞對干擾素的反應(yīng)過程相關(guān)基因表達變化熱圖Figure 5 Heat map of gene expression changes related to the reaction process of cells to interferon

2.6 T細胞受體信號通路相關(guān)基因表達 芫根處理小鼠后，小鼠小腸中共21個T細胞受體信號通路相關(guān)基因發(fā)生顯著性差異表達。其中19個基因表達上調(diào)，2個基因表達下調(diào)(圖6)。T細胞受體信號通路的受體亞基蛋白CD4，接頭蛋白LAT，T細胞活化相關(guān)激酶LCK、ZAP70、FYN、ITK和調(diào)節(jié)蛋白GRB2、SOS1等的編碼基因均表達升高。

圖6 T細胞受體信號通路途徑相關(guān)基因表達變化熱圖Figure 6 Heat map of T cell receptor signaling pathway related gene expression changes

3 討論

本研究利用RNA序列研究了芫根喂養(yǎng)對小鼠腸道基因表達變化的影響。 結(jié)果顯示，芫根提取液灌胃小鼠導(dǎo)致小腸中1635個基因發(fā)生差異表達，其中1236個基因表達上調(diào)，399個基因表達下調(diào)；芫根原漿灌胃小鼠導(dǎo)致小腸中2872個基因發(fā)生差異表達，其中2233個基因表達上調(diào)，639個基因表達下調(diào)。兩個芫根組的上調(diào)表達基因數(shù)都顯著高于下調(diào)表達基因數(shù)，且有1287個共同向差異表達基因，證明芫根灌胃有效達到了實驗效果。

單核-巨噬細胞統(tǒng)稱吞噬細胞，是機體內(nèi)最廣泛的免疫細胞，在不同的生理條件下吞噬細胞可極化為經(jīng)典活化性巨噬細胞(M1型巨噬細胞)和選擇替代性巨噬細胞(M2型巨噬細胞)，兩類巨噬細胞也可相互極化。M2型巨噬細胞抑制免疫反應(yīng)并促進腫瘤增殖；M1型巨噬細胞是機體的防衛(wèi)士，全方位介入非特異性免疫和特異性免疫過程，能分泌的各類細胞因子調(diào)控免疫反應(yīng)[11-14]。白細胞介素在巨噬細胞和各類白細胞的信息傳遞，介導(dǎo)T、B細胞的激活與調(diào)節(jié)免疫細胞的分裂與轉(zhuǎn)化及炎癥反應(yīng)中起重要作用。本實驗中白細胞介素分泌相關(guān)基因差異表達熱圖顯示芫根組小鼠的CD274基因表達上調(diào)，Ccl20基因表達下調(diào)。CD274蛋白是M1型巨噬細胞表面的標記性蛋白，該基因表達上調(diào)提示巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化率提高，增強了巨噬細胞的抗病毒、抗癌及各種免疫反應(yīng)中的作用[15]。CCL20蛋白是一種炎癥趨化因子，主要由受到損傷或感染的腸上皮細胞分泌，當腸道上皮細胞被破壞、受到病原體感染或菌群變化時，腸上皮CCL20的表達迅速升高，打破局部的免疫平衡，該基因的低表達提示腸道處于健康的防護的狀態(tài)[16-17]。T細胞是機體內(nèi)功能最復(fù)雜的特異性免疫核心淋巴細胞，直接參與細胞免疫和遞呈誘導(dǎo)體液免疫，因此T細胞的功能調(diào)節(jié)在免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心影響力[18-19]。本實驗中T細胞受體信號通路相關(guān)基因差異表達熱圖顯示芫根組小鼠的受體亞基蛋白CD4，接頭蛋白LAT，T細胞活化相關(guān)激酶LCK、ZAP70、FYN、ITK和調(diào)節(jié)蛋白GRB2、SOS1等蛋白的編碼基因均表達升高，提示T細胞被活化。干擾素是一類具有高度種屬特異性的糖蛋白，具有抗病毒、抗癌和調(diào)節(jié)免疫的作用，細胞對干擾素的反應(yīng)相關(guān)基因差異表達熱圖顯示芫根組小鼠的多種干擾素誘導(dǎo)蛋白和靶干擾素的基因表達量提高，尤其是IFNG和IFNA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)亞基的基因。IFNA是主要由巨噬細胞產(chǎn)生的具有抗病毒效果的干擾素，IFNG是主要由活化T細胞產(chǎn)生的具有抑制細菌生長的干擾素，這兩途徑的基因表達上調(diào)，提示機體的巨噬細胞和T細胞的功能活化，機體的抗病毒和抗病菌感染能力的提升[20-22]。

腸道是機體最主要的消化吸收器官和最大的免疫器官，正常結(jié)構(gòu)功能與生理反應(yīng)相適應(yīng)，消化吸收功能的正常維持需要有強效且穩(wěn)定的免疫環(huán)境作保障，富集性結(jié)果提示芫根有調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和強化消化吸收的功效。腸道免疫細胞、非免疫細胞和腸道菌群之間有很多的相互作用，三者復(fù)雜的聯(lián)系共同參與了腸道保護、耐受和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這些相關(guān)要素以協(xié)調(diào)的方式協(xié)同工作，以預(yù)防疾病、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保障最大限度地獲取營養(yǎng)。一旦動態(tài)平衡被打破，就會導(dǎo)致腸道免疫功能失調(diào)，引發(fā)各種代謝類和消化系統(tǒng)疾病[23-24]。腸道菌群作為身體不可或缺的重要組成部分，其數(shù)量可匹敵機體本身的細胞數(shù)，種類繁多且生理機能復(fù)雜，參與了免疫系統(tǒng)發(fā)育、先天性免疫和特異性免疫等過程，對維持體內(nèi)生理環(huán)境平衡，調(diào)節(jié)腸道營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，調(diào)控機體免疫功能等都有重要研究價值[25-27]。研究發(fā)現(xiàn)芫根可促進腸道內(nèi)一種短鏈脂肪酸SCFAs的分泌，而這種腸道菌群來源的短鏈脂肪酸的增加可提高機體免疫力并維護腸道的平衡穩(wěn)態(tài)，對健康具有重要促進作用[8，28-29]。GO富集性分析顯示芫根組差異表達基因在白細胞介素分泌、細胞對干擾素的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)以及細胞質(zhì)膜兩側(cè)、正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程高度富集且多數(shù)表達上調(diào)。KEGG富集性分析顯示芫根組差異表達基因富集在T細胞受體信號通路、病菌免疫及腫瘤監(jiān)控途徑、各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收代謝途徑等通路中高度富集且多數(shù)表達上調(diào)。推測可能是芫根促進腸道益生菌增殖，抑制腸道病原菌的增殖，改善腸道了菌群結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致SCFAs分泌增加進而調(diào)節(jié)了免疫系統(tǒng)。

芫根提取液灌胃小鼠共誘導(dǎo)了小腸1635個基因發(fā)生差異表達，而芫根原漿灌胃小鼠共誘導(dǎo)了小腸2872個基因發(fā)生差異表達，芫根原漿組差異表達基因量和基因差異表達幅度高于芫根提取液組，提示芫根原漿中可能有芫根提取液中丟失的有效成分或者相關(guān)效應(yīng)分子濃度高于芫根提取液。研究發(fā)現(xiàn)食源植物miRNA跨界調(diào)控動物基因表達的途徑，是中草藥和藥食兩用作物發(fā)揮藥效的潛在調(diào)控機制[30-31]。芫根提取液在制作過程中容易破環(huán)原料內(nèi)部的核酸分子，因此可能是造成本實驗兩個芫根組差異表達基因量差異的根本原因，本課題組下一步還將以miRNA為切入點進一步深入探索機制。

4 結(jié)論

本實驗利用生物信息學技術(shù)分析小鼠小腸轉(zhuǎn)錄組基因，揭示了芫根灌胃小鼠小腸的差異表達基因在白介素分泌、干擾素反應(yīng)、T細胞受體信號通路、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等途徑高度富集，提示芫根對腸道免疫系統(tǒng)及腸黏膜功能的調(diào)節(jié)。其中Cd274的表達上調(diào)和Ccl20的表達下調(diào)提示誘導(dǎo)M1型巨噬細胞極化和T細胞活化可能是芫根調(diào)控免疫和維護腸道正常結(jié)構(gòu)功能的重要途徑。本研究結(jié)果對進一步驗證芫根調(diào)節(jié)免疫功能的指標，剖析芫根調(diào)控免疫系統(tǒng)的分子機制和深入探索其有效成分具有一定的指導(dǎo)意義。