張帆 湯禮軍 黃竹 吳俊，3 黃尚卿

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心，四川 成都 610083;3.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是以胰腺的廣泛炎癥反應(yīng)伴組織壞死為主要特征的病變，病情發(fā)展迅速，當(dāng)疾病進(jìn)展為多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)時(shí)，死亡率較高[1]。腸道是重癥急性胰腺炎胰腺外并發(fā)癥最常見的器官之一，SAP所繼發(fā)的腸道炎性介質(zhì)的過度釋放、缺血-再灌注及一氧化氮損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)和腸上皮細(xì)胞凋亡在腸道損傷中起到了重要作用，也與SAP的嚴(yán)重程度和愈后密切相關(guān)[2-5]。因此，減輕腸道損傷成為治療SAP時(shí)胰腺外并發(fā)癥中尤為重要的一步。 在膽道梗阻性胰腺炎中，血清總膽汁酸濃度會(huì)明顯上升[6]，排入腸道的膽汁酸量會(huì)明顯減少,并且血清循環(huán)總膽汁酸的水平與急性胰腺炎患者的多器官功能衰竭密切相關(guān)[7-8]。而在非膽道梗阻性胰腺炎中，已經(jīng)證實(shí)?；切苋パ跄懰?Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)能顯著減輕急性胰腺炎中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)以及腺泡細(xì)胞的損傷[9-10]，并且通過腸道細(xì)菌的代謝作用減輕胰腺炎的腸道損傷[11]。那么，與TUDCA同為治療膽固醇性結(jié)石，且已經(jīng)證實(shí)在多種疾病的腸道損傷具有保護(hù)作用的鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)是否也具有類似于TUDCA的胰腺炎中胰腺和腸道保護(hù)的功能，值得研究?；诖?，本研究探討補(bǔ)充外源性膽汁酸CDCA對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠胰腺及腸道損傷的影響和意義，以期為SAP早期胰外并發(fā)癥的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD健康雄性大鼠(6～8周齡)45只購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重200～300 g, 隨機(jī)分為Sham組(n=15)、SAP組(n=15)、CDCA組(n=15)。實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，室溫和濕度適宜，交替光照和黑暗各12 h。 本實(shí)驗(yàn)所有檢測(cè)方法和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)過中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 牛磺膽酸鈉(中國索萊寶)用生理鹽水配制成5%濃度，水合氯醛(成都艾澤威生物科技有限公司)用生理鹽水配制成5%濃度，鵝去氧膽酸(浙江英沃迪生物科技有限公司)配制成含0.5%CDCA的特殊飼料，淀粉酶、脂肪酶、二胺氧化酶(Diamine Oxidase，DAO)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Intestinal Fatty Acid-Binding Protein，IFABP)、D-乳酸(D-lactic acid)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)檢測(cè)的ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司，TGR5抗體購自愛必信生物科技有限公司，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)購自Affinity公司。

1.3 模型制備 SAP組：SD大鼠術(shù)前禁食、自由飲水12 h，隨后腹腔注射5%的水合氯醛0.7 mL/100 g進(jìn)行麻醉。麻醉后，大鼠固定于操作臺(tái)，作一長(zhǎng)約5 cm的上腹部正中切口，上至劍突，隨后鋪無菌手術(shù)單并暴露腹腔，找到十二指腸降部，向左翻轉(zhuǎn)，暴露腸系膜右側(cè)面，定位膽胰管近十二指腸開口處，隨后用小動(dòng)脈夾夾閉肝門處的膽總管，使用4號(hào)針頭逆行穿刺，成功后使用1 mL注射器緩慢推注5%?；悄懰徕c1 min，推注用量為0.1 mL/100 g，推注完成后依次去掉小動(dòng)脈夾和4號(hào)針頭，停留觀察5 min后關(guān)腹，然后置于室溫23～25℃的復(fù)蘇室待醒。CDCA組：先喂養(yǎng)含0.5% CDCA的飼料一周，隨后造SAP模。Sham組：喂養(yǎng)方法同SAP組，麻醉開腹僅撥動(dòng)十二指腸降部后關(guān)腹。造模成功后24 h取標(biāo)本，小腸取回腸末端近盲腸處4～5 cm，血液通過腹主動(dòng)脈采集。

1.4 小腸和胰腺組織病理學(xué)檢測(cè) 經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h，嚴(yán)格按照病理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的程序進(jìn)行修剪、梯度脫水、包埋、切片、HE染色、封片，最后鏡檢合格的樣片。胰腺組織病理評(píng)分參照Kusske評(píng)分方法[12]，小腸組織病理評(píng)分參照Chiu′s評(píng)分方法[13]。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶、炎性因子、腸道損傷相關(guān)指標(biāo) 血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、IFABP、D-Lac、IL-1β、IL-6 、IL-18、TNF-α水平均采用 ELISA 法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)方法以訂購的試劑盒說明書為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過包被、封閉、洗滌、加樣、溫育、加酶結(jié)合物、加顯色底物等標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)法檢測(cè)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況 小腸組織采用TUNEL 法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞的凋亡情況，經(jīng)過脫蠟、水化、浸洗、固定、反應(yīng)、DAB顯色等標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟后，使用熒光顯微鏡觀察，計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)小腸組織TGR5以及NLRP3的蛋白表達(dá)情況 小腸組織采用Western blot檢測(cè)TGR5以及NLRP3的蛋白表達(dá)情況，按照小腸組織總蛋白提取、蛋白濃度測(cè)定、變性、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、圖像采集等步驟，最后計(jì)算TGR5以及NLRP3蛋白在各組小腸組織的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CDCA對(duì)大鼠胰腺組織病理損傷觀察結(jié)果比較 HE染色后在光鏡下觀察到Sham 組大鼠的胰腺組織大體結(jié)構(gòu)正常，SAP組大鼠的胰腺組織可見小葉間明顯水腫，腺泡間隔變大，腺泡細(xì)胞排列紊亂、萎縮，同時(shí)呈現(xiàn)溶解性壞死(黑色箭頭)，呈嗜酸性的無結(jié)構(gòu)纖維狀，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黃色箭頭)，間質(zhì)可見明顯出血(綠色箭頭)。與 SAP 組比較，CDCA組胰腺組織病理損傷顯著減輕，主要表現(xiàn)為胰腺組織鏡下大體結(jié)構(gòu)清晰，但仍可見小葉間水腫，少量的腺泡細(xì)胞壞死(黑色箭頭)及少量的炎性細(xì)胞彌散性浸潤(rùn)(黃色箭頭)，見圖1。

圖1 CDCA對(duì)大鼠胰腺組織病理損傷觀察結(jié)果以及病理評(píng)分比較Figure 1 Observation on histopathological damage of rat pancreas by CDCA and comparison of pathological scores注：A.Sham組、SAP組以及CDCA組大鼠胰腺組織HE染色(標(biāo)尺=100 μm)；B.各組大鼠胰腺組織病理評(píng)分。與Sham組相比，①P<0.05；與SAP組相比，②P<0.05

2.2 CDCA對(duì)大鼠胰腺炎的血清指標(biāo)影響的比較 SAP組大鼠的胰腺炎血清指標(biāo)淀粉酶、脂肪酶的水平較Sham組有明顯升高(P<0.05)，經(jīng)CDCA干預(yù)后均有明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠胰腺炎相關(guān)指標(biāo)血清淀粉酶、血清脂肪酶水平比較Table 1 Comparison of serum amylase and serum lipase levels in rats of each group

2.3 CDCA對(duì)大鼠血清全身炎癥指標(biāo)影響的比較 與Sham組相比，SAP組大鼠血清全身炎性因子IL-1β、IL-6、IL-18 以及TNF-α水平均有明顯升高(P<0.05)；而經(jīng)過CDCA干預(yù)后，大鼠的全身炎癥指標(biāo)均有明顯下降(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of serum IL-1β, IL-6, IL-18 and TNF-α expression levels in rats of each group

2.4 CDCA對(duì)大鼠腸道組織病理損傷觀察結(jié)果的比較 HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠小腸組織結(jié)構(gòu)正常，SAP 組大鼠的小腸結(jié)構(gòu)明顯破壞，小腸絨毛形態(tài)明顯異常，大量的腸絨毛上皮細(xì)胞脫落(綠色箭頭)，部分組織的腸絨毛相互融合、斷裂、脫落(藍(lán)色箭頭)，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黃色箭頭)，同時(shí)可見固有層裸露，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張；而經(jīng)過CDCA干預(yù)后大鼠的小腸病理損傷有明顯緩解，但仍可見少量的上皮細(xì)胞脫落(綠色箭頭)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黃色箭頭)，見圖2。

圖2 CDCA對(duì)大鼠小腸組織病理損傷觀察結(jié)果比較Figure 2 Comparison on the results of histopathological damage observed in the small intestine of rats by CDCA注：A.Sham組、SAP組以及CDCA組大鼠小腸組織HE染色(標(biāo)尺=100 μm)；B.各組大鼠小腸組織病理評(píng)分。與Sham組相比，①P<0.05；與SAP組相比，②P<0.05

2.5 CDCA對(duì)大鼠腸道組織的腸道損傷標(biāo)志物影響的比較 與Sham組相比，SAP 組大鼠的腸道組織損傷的特異性標(biāo)志物DAO、IFABP以及D-Lac水平較sham組有明顯升高(P<0.05)，經(jīng)CDCA干預(yù)后均下降(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腸道損傷標(biāo)志物血清DAO水平、IFABP、D-Lac水平表達(dá)比較Table 3 Comparison on expression of serum DAO, IFABP and D-Lac levels in rats in each group

2.6 CDCA對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡影響的觀察結(jié)果及凋亡率的比較 TUNEL法檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，SAP組大鼠的小腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)及凋亡率較Sham組明顯升高(P<0.05)；經(jīng)過CDCA干預(yù)后，小腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)及凋亡率較SAP組有明顯下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 CDCA對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡影響的觀察結(jié)果及凋亡率的比較 Figure 3 Observations on the effect of CDCA to the apoptosis of small intestinal mucosal epithelial cells and comparison of the apoptosis rate注：A.TUNEL 法檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡；B.各組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡率的比較。與Sham組比較，①P<0.05；與SAP組比較，②P<0.05

2.7 CDCA對(duì)小腸組織TGR5以及NLRP3蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)小腸組織的TGR5及NLRP3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，SAP造模后大鼠的小腸組織中TGR5蛋白的表達(dá)較Sham組明顯增多(P<0.05)；同時(shí)，小腸組織的NLRP3在進(jìn)行SAP造模后也明顯增多，而在進(jìn)行CDCA干預(yù)后表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 CDCA對(duì)小腸組織TGR5蛋白以及NLRP3表達(dá)影響的比較Figure 4 Comparison of the effects of CDCA on the expression of TGR5 protein and NLRP3 in small intestine tissues注：TGR5以及NLRP3蛋白表達(dá)；B.各組大鼠小腸組織TGR5及NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量。與 Sham組比較，①P<0.05；與 SAP 組比較，②P<0.05

3 討論

研究證實(shí)，腸道是人體內(nèi)最大的免疫器官，SAP并發(fā)胰外損傷時(shí)首當(dāng)其沖；在發(fā)生SAP時(shí)，腸黏膜屏障以及腸道免疫功能受損，導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌穿過受損的黏膜進(jìn)入腸外器官和血液循環(huán)，從而繼發(fā)SIRS和MODS[14]。因此，阻止腸道這一“扳機(jī)點(diǎn)”部位的損傷，不僅可以減輕SAP的嚴(yán)重程度, 還能改善疾病的預(yù)后，降低死亡率，使此研究具有了現(xiàn)實(shí)的臨床意義。

膽汁酸作為膽汁的主要成分，不僅可以促進(jìn)脂肪和脂溶性維生素的吸收[15],還能與膽汁酸受體相互作用來調(diào)節(jié)自身代謝和腸道功能穩(wěn)態(tài)[16]。在以往的研究中，主要聚焦于膽汁酸在肝膽疾病中的作用，直到最近幾年才將其影響逐步擴(kuò)展到肝膽以外：主要包括在腸道缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用[17]，對(duì)腸道干細(xì)胞的激活、促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生的作用[18]，對(duì)腸道免疫細(xì)胞群組成的調(diào)節(jié)[19]以及癌癥預(yù)防和治療的新方向等[20-21]。CDCA作為膽汁酸中的一種，口服后在腸道內(nèi)變成石膽酸(Lithocholic acid，LCA)， LCA又能在腸道內(nèi)代謝為3-oxoLCA 和 isoalloLCA，隨后被修飾成特定的免疫調(diào)節(jié)分子，進(jìn)而在腸道發(fā)揮促炎或抗炎的免疫調(diào)節(jié)作用[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)探究了CDCA在SAP大鼠的胰腺及腸道中是否也具有類似的效果。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過CDCA干預(yù)后再進(jìn)行SAP造模的大鼠胰腺組織病理損傷較Sham組有明顯的減輕，病理評(píng)分也顯著下降；同時(shí)，血清淀粉酶、脂肪酶以及全身炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α)的表達(dá)水平也明顯降低，使大鼠的全身炎癥反應(yīng)得到了有效的控制。研究顯示[23]，在進(jìn)行急性胰腺炎造模后，胰腺中膽汁酸受體TGR5的表達(dá)水平會(huì)明顯升高，作為保護(hù)性因素，被特異性激動(dòng)劑激活后，通過抑制活性氧等途徑來減輕胰腺損傷及全身炎癥反應(yīng)。 因此，探明CDCA在SAP腸道損傷中的作用，有助于為臨床治療SAP的胰腺外并發(fā)癥提供新的思路。

腸道損傷的轉(zhuǎn)歸也是影響SAP進(jìn)展和預(yù)后的重要因素，腸道的損傷不僅能刺激機(jī)體進(jìn)一步產(chǎn)生炎性因子，腸黏膜屏障的破壞還能導(dǎo)致細(xì)菌入血造成全身感染而進(jìn)一步加重SAP。因此，接下來我們研究了CDCA對(duì)腸道本身的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，CDCA干預(yù)后可以顯著減輕腸道損傷的嚴(yán)重程度，表現(xiàn)為小腸的病理評(píng)分以及腸道上皮細(xì)胞的凋亡率顯著降低；同時(shí)，腸道損傷的特異性血清標(biāo)志物DAO、IFABP和D-Lac的水平較SAP組也有明顯下降。對(duì)于CDCA減輕腸道損傷的作用機(jī)制，在其他疾病模型中已有研究，主要是通過激活腸道膽汁酸受體——法尼酯X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)來發(fā)揮作用。肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light-chain kinase，MLCK)是一種能夠影響腸道連接蛋白表達(dá)，進(jìn)而改變腸黏膜屏障通透性和完整性的蛋白激酶。Song等[24]研究發(fā)現(xiàn) CDCA可以通過FXR-MLCK途徑在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腸上皮損傷中發(fā)揮保護(hù)作用；同時(shí)，在腸道的缺血再灌注損傷中，CDCA也能通過促進(jìn)腸道連接蛋白的表達(dá)，維持腸黏膜屏障的完整，以發(fā)揮保護(hù)腸道的作用[17]。但是，同為膽汁酸受體的TGR5在腸道中的影響目前報(bào)道鮮少，前文已述，TGR5受體的激活對(duì)于胰腺具有一定保護(hù)作用，對(duì)于全身炎癥反應(yīng)也有一定的抑制作用[25]；而在腸道組織中也廣泛表達(dá)的TGR5受體是否在CDCA的激活下發(fā)揮其作用，值得探究。因此本研究中我們推測(cè)膽汁酸CDCA減輕SAP大鼠胰腺和腸道損傷的作用機(jī)制,可能與激活腸道特異性的膽汁酸受體TGR5有關(guān)。

TGR5受體作為G蛋白偶聯(lián)受體家族(G protein-coupled receptors，GPCRs)中的一種，在人類的多種組織器官如胰腺、腸道中廣泛表達(dá)[26]。本研究用Western blot試驗(yàn)證實(shí)了小腸組織的TGR5受體在進(jìn)行SAP造模后表達(dá)會(huì)明顯升高；而CDCA作為TGR5受體的強(qiáng)激動(dòng)劑，在激活TGR5受體后可以通過TGR5-cAMP-PKA軸來抑制NLRP3的表達(dá)[27]。NLRP3是多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，其表達(dá)增高提示炎性小體的激活增多，能夠調(diào)節(jié)胱冬肽酶-1的活化，促使前體IL-1β和前體IL-18的成熟及分泌。IL-1β是早期炎癥擴(kuò)散和無菌性炎癥的重要細(xì)胞因子，而IL-18也在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮促炎效果，兩者的分泌增多會(huì)導(dǎo)致炎細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重組織的損傷[28]；另外，NLRP3還介導(dǎo)了急性胰腺炎中胰腺的炎癥和損害[29]。在本文中，由于SAP造模后血清炎癥因子IL- 1β和IL-18分泌增多，因此我們將目光聚焦于NLRP3炎性小體上，通過Western blot實(shí)驗(yàn)表明NLRP3在SAP大鼠的小腸組織中表達(dá)升高，而在CDCA干預(yù)后的小腸組織中NLRP3的表達(dá)降低。以上結(jié)果提示了膽汁酸受體TGR5和NLRP3炎性小體參與了SAP大鼠中胰腺及腸道損傷的過程。推測(cè)SAP造模后，TGR5受體作為保護(hù)性因素在腸道組織中的表達(dá)升高，經(jīng)過CDCA干預(yù)后TGR5受體激活，通過抑制腸道NLRP3的表達(dá)，從而抑制了全身的炎癥反應(yīng)，減輕了胰腺及腸道的損傷。

4 結(jié)論

膽汁酸CDCA可能通過激活SAP大鼠腸道組織的TGR5蛋白，從而抑制NLRP3的表達(dá)及炎性小體的激活，減輕大鼠全身的炎性反應(yīng)，緩解胰腺和小腸損傷的嚴(yán)重程度，在SAP中發(fā)揮了一定的保護(hù)作用。本研究為SAP早期胰外并發(fā)癥的治療提供了新的方向，但具體的作用機(jī)制還需要更深一步的研究證實(shí)。