許均圖，陳德斌，陳 燕，唐春玲

（廣州華鑫檢測技術(shù)有限公司，廣東廣州 510663）

腹瀉性貝類毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是由原甲藻屬和有毒赤潮藻類鰭藻屬的藻類產(chǎn)生的脂溶性多環(huán)醚類生物活性毒素[1]。腹瀉性貝類毒素可在貝類、魚類等動物體內(nèi)富集，性質(zhì)穩(wěn)定。人類食用這些被污染的水產(chǎn)品時，會引起急性中毒，其中毒癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、腹痛等[2]。赤潮在我國沿岸海域均有發(fā)生，腹瀉性貝類毒素也是對我國具有最嚴(yán)重威脅的赤潮藻毒素之一，因此有必要加強(qiáng)貝類腹瀉性貝類毒素的監(jiān)測。

目前腹瀉性貝類毒素的檢測方法主要有小白鼠法、酶聯(lián)免疫法、酶活力抑制分析法、高效液相色譜法以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[3-7]，其中酶聯(lián)免疫法和酶活力抑制分析法簡單快速，但是容易出現(xiàn)假陽性，而且不能定性是哪一種毒素。小白鼠法需要使用大量的小白鼠，不具有特異性，且靈敏度較差。高效液相色譜法需要衍生，干擾較多，穩(wěn)定性較差。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是能高效分離和準(zhǔn)確定性定量的新型分析方法，具有高的特異性和高靈敏度，被廣泛應(yīng)用于獸殘、農(nóng)殘和毒素的分析檢測。本研究通過優(yōu)化檢測條件和前處理方法，建立了快速測定貝類樣品中3種腹瀉性貝素的分析方法，在8 min內(nèi)完成了3種腹瀉性貝類毒素的快速分離測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（液相系統(tǒng)：Waters UPLC，美國Waters公司；質(zhì)譜系統(tǒng)：TSQ Quantum， 美國賽默飛公司）；超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器（上海安譜EOAAHM-01）；氮?dú)獯蹈蓛x（北京八方世紀(jì)BF-2000）；高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西HR/T20MM）；電子天平（賽多利斯BSA822-CW），HLB固相萃取柱（60 mg/ 3 mL，安譜公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱 （200 mg/3 mL，安捷倫公司）。

甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，MREDA公司；超純水；其他試劑均為分析純。

大田軟海綿酸（OA）8.4 μg·mL-1、鰭藻毒素 -1（DTX-1）7.8 μg·mL-1、鰭藻毒素-2（DTX-2） 3.8 μg·mL-1，均購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所。上述標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇配制成1.0 μg·mL-1的儲備液，保存于-20 ℃冰箱中，用乙腈配制100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2 樣品前處理

稱?。?.00±0.01）g制備均勻的樣品，加入10 mL 80%乙腈溶液，振蕩5 min，超聲10 min，4 ℃下 10000 r·min-1離心5 min。準(zhǔn)確移取1 mL提取液，加入125 μL 2.5 mol·L-1NaOH溶液，置于恒溫箱中76 ℃下培育40 min，待冷卻至室溫后，加入125 μL 2.5 mol·L-1HCl溶液，所得溶液過Captiva EMR-Lipid小柱，并用1 mL 80%乙腈溶液淋洗，收集洗脫液于5 mL離心管中，混勻后過0.22 μm有機(jī)相濾膜后上機(jī)分析。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫RRHD Eclipse Plus C18（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；流動相為5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B），流速為0.2 mL·min-1，柱溫為35℃；梯度洗脫程序：0～1 min，70% B；1～ 3 min，70%～95% B；3～6 min，95% B；6.1～ 8.0 min，10% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；負(fù)離子模式；鞘氣壓力：35 aux， 輔助氣壓力：15 aux，毛細(xì)管溫度：350 ℃；噴霧電壓3500 V；SRM掃描模式；各個化合物經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱和流動相的選擇

2.1.1 色譜柱

分別比較了Agilent Eclipse Plus C18（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）和Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），結(jié)果如圖1所示。發(fā)現(xiàn)SB-C18的峰形拖尾嚴(yán)重，這可能是因?yàn)镾B-C18的填料未封端，而腹瀉性貝類毒素結(jié)構(gòu)多為帶多羥基的酸性化合物，和填料上的硅羥基作用導(dǎo)致拖尾。而Plus C18峰形良好，因此采用Plus C18作為分析柱。

2.1.2 流動相

分別比較了不同的流動相的分離效果，如圖2所示。結(jié)果表明采用5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸溶液+乙腈作為流動相時，3種腹瀉性貝類毒素的分離度、峰形和響應(yīng)最好。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

腹瀉性貝類毒素都是脂溶性的化合物，不溶于水，易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑[8]。本研究分別比較了甲醇、乙腈、80%甲醇溶液、80%乙腈溶液作為提取溶劑時的總體回收率，結(jié)果見表2。

表1 腹瀉性貝類毒素的質(zhì)譜檢測參數(shù)

圖1 不同色譜柱的色譜圖

圖2 不同流動相組成的色譜圖

表2 不同提取溶劑的總體回收率比較（單位：%）

結(jié)果表明，以80%乙腈作為提取溶劑，3種貝類毒素的總體提取效率最高。這可能是因?yàn)榧状既芙馍倭恐編牖|(zhì)干擾，而乙腈可以沉淀蛋白質(zhì)，從而降低了基質(zhì)效應(yīng)。

2.2.2 凈化方法的選擇

貝類樣品含有豐富的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，如果不經(jīng)過凈化直接上樣分析，很容易污染離子源，同時較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)也會降低待分析物的響應(yīng)，使得定量結(jié)果偏低，因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膬艋绞健１狙芯勘容^了HLB小柱和安捷倫Captival EMR-Lipid小柱凈化的效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不凈化、EMR柱凈化和HLB凈化的加標(biāo)樣品響應(yīng)值比較

結(jié)果表明，HLB小柱和Captival EMR-Lipid小柱均可以起到降低基質(zhì)效應(yīng)，提高響應(yīng)值的效果。但是HLB小柱凈化需要稀釋上樣，活化、淋洗、洗脫濃縮等步驟，前處理過程較為煩瑣，不利于大批量樣品同時處理。安捷倫Captiva EMR-Lipid小柱無需活化、能凈化樣品蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等干擾物，操作簡單。過柱后用1 mL提取液淋洗可以減少吸附，提高回收率。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇安捷倫Captiva EMRLipid小柱進(jìn)行凈化。

2.3 方法學(xué)確認(rèn)

2.3.1 線性范圍和檢出限

用無毒素檢出的貝類樣品處理后的提取液稀釋DSP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為0.5～20.0 ng·mL-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測定。3種腹瀉性貝類毒素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3倍信噪比法計(jì)算方法的檢出限，各個化合物的線性方程和檢出限如表3所示。

表3 檢出限、加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.2 方法的回收率

采用無毒素檢出的貝類樣品，添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 添加水平為5 μg·kg-1和20 μg·kg-1進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各個化合物的方法回收率，如表3所示。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定貝類樣品中3種腹瀉性貝類毒素的分析方法。該方法操作簡單、靈敏度高、回收率和精密度較好，適合應(yīng)用于貝類樣品樣品中腹瀉性貝類毒素的 監(jiān)測。