張曉杰 范 磊 潘妍婷

1 河北北方學院研究生院，張家口，075000，中國

2 河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經內科，張家口，075000，中國

3 張家口市第一醫(yī)院，張家口，075000，中國

目前中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）感染性疾病的病原學診斷主要依靠腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）涂片鏡檢、病原體培養(yǎng)、抗原抗體檢測、PCR 檢測，但其陽性率低［1-2］。近年來，二代測序以其“高通量優(yōu)勢”在臨床中廣泛應用，宏基因二代測序法（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）在中樞神經系統(tǒng)感染性疾病病原學檢出率及診斷水平提高中發(fā)揮重要作用。與常規(guī)檢測方法相比，mNGS技術的陽性百分比、一致性顯著增加，同時提高病原體的識別率［3］。本研究收集我院診斷中樞神經系統(tǒng)感染的60 例患者，分析腦脊液培養(yǎng)與mNGS 方法的敏感性，探討mNGS 技術在中樞神經系統(tǒng)感染患者腦脊液中提供病原學證據的效能差異及臨床診治中的指導意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧分析河北北方學院附屬第一醫(yī)院2019 年5月～2021 年5 月神經內科住院且臨床確診為中樞神經系統(tǒng)感染患者60 例。

1.2 研究方案

收集同期臨床確診的中樞神經系統(tǒng)感染的患者60例，疾病納入標準［4］參考王維治主編的《神經病學》中樞神經系統(tǒng)感染的臨床診斷標準排除標準，包括：①年齡≤28 d；②腦脊液細胞學證實腦膜惡性腫瘤；③損傷所致明顯血性腦脊液；④已經確診自身免疫性腦炎的病例；⑤HIV、梅毒感染或者拒絕簽署知情同意書。將每個組別的腦脊液同期進行腦脊液傳統(tǒng)檢驗和mNGS檢測，觀察mNGS 方法的陽性檢出率及指導臨床選用抗菌素的治療效果。本研究通過河北北方學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 CSF 標本的收集

患者入組后盡早留取CSF，需注意嚴格無菌操作，避免損傷性出血導致溶血，控制顱內高壓患者的放液速度，避免腦疝形成；經引流管道采集時，排去管腔內約3～5 mL 的潴留液體，盡可能收集新鮮CSF。標本收集后立即分裝至無菌、干燥、潔凈的凍存試管內，每一標本的留取量應≥1.5 mL。

1.4 檢驗方法

試管內標本同時行mNGS 及微生物培養(yǎng)檢測。微生物培養(yǎng)方法：在無菌條件下，將CSF 標本或其離心沉淀物分別接種于血平板、巧克力平板、麥康凱平板，5.5%CO2：，35℃條件下，培養(yǎng)18～48 h，獲取菌株后進行鑒定。mNGS 由廣州金域醫(yī)學檢驗集團股份有限公司完成，CNS 感染特征確定參考數(shù)據庫，所用數(shù)據庫包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體或衣原體。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0 及MedCalc15.2.2 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。分類變量以例數(shù)（百分率）表示，近似服從正態(tài)分布的連續(xù)性變量以均數(shù)±標準差表示。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算曲線下面積（areaunder the curve，AUC），以AUC=0.5 為診斷參考線，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

分析的中樞神經系統(tǒng)感染的60 例患者中，有慢性病史者9 例（15.0%），送檢化驗前使用抗生素6 例（10.0%），影像檢查伴有腦膿腫患者5例（8.33%），脊髓膿腫2 例（3.33%）。按不同感染源進行分組（Tab.1），細菌感染42 例（70%）；病毒感染16 例（26.67%）；寄生蟲感染2 例（3.33%）。

Tab.1 mNGS results of 60 patients with central nervous system infection

2.2 mNGS 結果

總體陽性例數(shù)為52 例（86.67%），對細菌感染的陽性例數(shù)為40 例（95.24%），病毒感染陽性11 例（68.75%），寄生蟲感染陽性1 例（50%）。mNGS 對細菌和病毒的陽性率進行卡方檢驗，P＜0.05（P=0.004），提示差異有統(tǒng)計學意義（Tab.2）。

Tab.2 Analysis of mNGS results

2.3 mNGS 對入組中樞神經系統(tǒng)感染患者的診斷效能評價結果

ROC 曲線分析顯示（Fig.1），mNGS 的AUC 為0.705，診斷價值中等，與AUC=0.5 的診斷參考線比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

Fig.1 Receiver operating characteristic（ROC）curve for mNGS diagnosis of CNS infection（n=60）

2.4 實驗室檢查結果

所有病例均完善血細胞分析、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、肝功能、腎功能、電解質及腦脊液常規(guī)、生化等基礎檢驗項目，60 例病人C-反應蛋白、降鈣素原、腦脊液中白細胞、腦脊液壓力出現(xiàn)不同程度增高（Tab.3）。

Tab.3 Laboratory tests were positive in 60 patients with CNS infections

2.5 影像資料

病毒感染組核磁結果平掃陽性例數(shù)13 例，細菌感染組核磁平掃結果陽性例數(shù)30 例，其中5 例伴有腦膿腫，2 例脊髓膿腫患者以及2 例寄生蟲感染者，均由增強核磁進一步明確診斷。

3 討論

有統(tǒng)計數(shù)據顯示，腦炎患者中約63%的病例是病原體診斷不明［5］。對于腦炎而言，明確其是自身免疫因素還是感染性疾病導致的炎癥，對于其后續(xù)的診治方案選擇具有重要意義，這更加彰顯出明確病原體的重要 性［6］。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，mNGS 技術在中樞神經系統(tǒng)感染性疾病病原學的診斷與其他傳統(tǒng)診斷方法比較有一定的優(yōu)越性［7］。有文獻提示腦脊液常見的病毒、細菌、寄生蟲感染中mNGS 技術較傳統(tǒng)檢驗方法有較高的敏感性及特異性［8］。本組患者分析結果提示，腦脊液mNGS技術對中樞神經系統(tǒng)感染的總的陽性率為95.24%，與文獻報道類似［9］。mNGS 技術提高病因檢測陽性率，尤其在傳統(tǒng)病原菌檢測陰性時，可有效輔助臨床診斷。

通過mNGS 結果分析，可進一步提示細菌的種屬信息，為臨床工作提供精準的治療信息。本組中1 例患者mNGS 檢查結果，細菌種屬提示為革蘭陰性普雷沃菌系口腔細菌，給予奧硝唑治療，臨床癥狀明顯好轉。另外2 例脊髓膿腫患者，經強化磁共振證實診斷，但多次送檢常規(guī)腦脊液化驗均為陰性，而送檢二代測序提示布氏桿菌感染，目前相關文獻并無布氏桿菌導致脊髓膿腫病例報道。因此對于慢性及不明原因感染患者與傳統(tǒng)檢驗方法相比，mNGS 技術可作為更有效的檢測手段［10］，并可有效縮短疾病的診斷及治療時間。

mNGS 對病毒、真菌等非細菌類病原體的檢出存在著其固有優(yōu)勢。微生物培養(yǎng)的檢測閾值僅為100～1 000 CFU·mL-1，mNGS 的檢測閾值在0.01～ 130.00 CFU·mL-1［11］。其次，mNGS 的檢測對象是病原體基因序列，不區(qū)分病原體活性，對已接受廣譜抗生素經驗治療的患者，其CSF 中病原體仍可在mNGS 中檢出。但mNGS 技術作為新型的病原微生物檢測技術，檢測技術昂貴，無法同步提供藥敏結果?？傊?，腦脊液mNGS 雖然還有待進一步完善與標準化，但為中樞神經系統(tǒng)感染病因精準診療帶來了顯著的進步。這種診斷方法顯著縮短診斷、治療時長，能夠識別新出現(xiàn)的感染病原體和新發(fā)感染性疾病。在病原體診斷技術相對落后的基層醫(yī)院和臨床實踐中如何合理應用mNGS，并與傳統(tǒng)微生物檢測方法相結合，以提高神經感染性疾病的診治水平。

綜上所述，在中樞神經系統(tǒng)感染診療中，mNGS 較傳統(tǒng)檢驗具有更好的診斷效能，可以作為微生物培養(yǎng)等常規(guī)診斷技術的必要補充，進一步為中樞神經系統(tǒng)感染提供精準治療依據。