劉金杰 賀 偉 彭心如 劉若萱 史 萌

河北北方學院中醫(yī)學院，張家口，075000，中國

《難經·十四難》認為“損其心者，調其營衛(wèi)”。后世宗《難經》之旨確立了“調和營衛(wèi)、健脾益氣”的缺血性心臟病治則，組方芍藥甘草湯。芍藥甘草湯源自張仲景《傷寒論》，由芍藥和甘草兩味藥材組成，具有益營合血、調和肝脾、柔筋止痛的功效。依“謹守病機，異病同治”原則，該方臨床應用廣泛，對多種疾病療效較好。現代藥理研究表明，芍藥甘草湯具有抗氧化、抗炎、止痛、抗心律失常、抗心肌缺血之功效［1-3］，但目前其在抗心肌缺血的作用機制研究并未明確。心肌缺血時會產生大量自由基，造成心肌細胞氧化損傷，誘發(fā)炎癥反應，但目前尚不清楚芍藥甘草湯提取物（SYG）對心肌細胞的保護作用是否與其抗氧化及抗炎作用有關。本研究擬采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導心肌細胞氧化損傷，從細胞及分子水平探究SYG 對心肌細胞氧化應激損傷及炎癥反應的保護作用，為進一步完善芍藥甘草湯的藥理作用及指導臨床合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

新生1～2 d 的Wistar 大鼠心肌細胞。

1.1.2 藥品與試劑

芍藥、炙甘草中藥飲片，購于河北北方學院附屬校醫(yī)院；過氧化氫（H2O2），購自美國Hyclone；DMEM-H 液體培養(yǎng)基，購自美國Hyclone；新生胎牛血清，購自美國Gibco；0.25%胰蛋白酶溶液，購自美國Difco；四甲基偶氮唑鹽（MTT），購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒，均購于南京建成生物科技有限公司；反轉錄試劑盒，購自美國Sigma；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）引物，合成于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.1.3 儀器

RE-52AA 旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050 型真空干燥箱，寧波江南儀器廠；CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo；倒置熒光顯微鏡，Olympus；RT-PCR 測定儀，Therm7500；Nanodrop2000c 超微量分光光度計，Thermo。

1.2 實驗方法

1.2.1 芍藥甘草湯提取物的制備

稱取芍藥、炙甘草飲片各50 g，按照料液比為1∶7的比例采用70%乙醇進行提取，每次提取1 h，共提取3 次，收集3 次的提取液，采用旋轉蒸發(fā)儀將提取液濃縮為浸膏，并最終得到干粉20.3 g，提取率為20.3%。

1.2.2 心肌細胞原代培養(yǎng)

取新生1～2 d 的Wistar 大鼠心室肌組織，剪碎，用含0.25%胰蛋白酶的Hank’s 液分別消化5、15、20 min，之后將三次細胞懸液混合在一起。預培養(yǎng)90 min 后，以3×105個·mL-1置入培養(yǎng)瓶內，在37℃、5% CO2和95% 空氣的二氧化碳孵箱內進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM（含15%胎牛血清）［4］，本實驗所有檢測在心肌細胞培養(yǎng)4 d 細胞達融合狀態(tài)后進行。

1.2.3 H2O2致心肌細胞氧化應激損傷模型的建立

參照文獻［5］選取對數生長期大鼠心肌細胞，用0.25%胰蛋白酶Hank’s 液消化細胞，加入培養(yǎng)基制備細胞懸液，調整細胞密度為5×105個·mL-1，按照每孔100 μL的密度接種于96 孔板，采用終濃度為200 μmol·L-1H2O2誘導心肌細胞2 h，作為模型對照組。

1.2.4 分組與給藥

將長勢狀態(tài)良好的細胞分成5 組：正常對照組、模型對照組、SYG 高、中、低劑量組。正常組為正常培養(yǎng)的心肌細胞；模型組為心肌細胞培養(yǎng)液中添加終濃度為200 μmol·L-1H2O2誘導大鼠心肌細胞2 h；SYG 高、中、低劑量組分別為采用150、100、50 μg·mL-1的SYG培養(yǎng)24 h 后，添加終濃度為200 μmol·L-1H2O2處理2 h。

1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖能力

選取各組對數生長期心肌細胞接種于96 孔板（5×105個·mL-1），每組設置3 個復孔，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，室溫避光振蕩孵育5 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀在490 nm 處測定吸光度（absorbance，A）值。實驗重復3 次。

各組細胞存活率按照如下公式計算：

細胞存活率（%）=（A 處理組-A 空白組）/（A 對照組-A 空白組）×100%，此方法用于細胞毒性實驗的測定。

1.2.6 紫外分光光度法檢測心肌細胞SOD、MDA、CAT、LDH 的含量

收集各組細胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書，分別測定各組心肌細胞上清液中SOD、MDA、CAT、LDH相關氧化應激指標的含量。

1.2.7 RT-PCR 法檢測心肌細胞中COX-2、iNOS、TNF-α、NF-κB 的含量

根據NCBI 公布的大鼠基因序列，設計上下游引物，如Tab.1 所示。

Tab.1 Gene name and sequence

培養(yǎng)24 h 后棄去細胞上清液，將細胞裂解，收集各組心肌細胞，采用Trizol 法提取心肌細胞中的總RNA，用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度。參照反轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR 反應，反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水補足體系至20 μL；反應條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 次循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以mean±SD 表示，多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用t檢驗法，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞存活率測定結果

實驗結果顯示，與正常對照組比較，終濃度為200 μmol·L-1的H2O2處理后心肌細胞存活率顯著降低（P＜0.01，Fig.1）。

Fig.1 Effects of SYG and H2O2 on cardiomyocyte proliferation

2.2 心肌細胞上清液中SOD、MDA、CAT 和LDH 測定結果

SOD、MDA、CAT 和LDH 含量能夠反應心肌細胞氧化應激損傷程度，實驗結果顯示，與正常對照組相比，模型組能夠顯著降低心肌細胞上清液中SOD 和CAT 的含量（P＜0.01），SYG 各劑量組能夠不同程度改善上述狀況，且與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。與正常對照組相比，H2O2模 型組能夠顯著性升高心肌細胞上清液中MDA 及LDH 的含量（P＜0.001），SYG 各劑量組干預后能夠顯著性降低心肌細胞上清液中MDA、LDH 的含量，且與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，Fig.2）。

Fig.2 Effect of SYG on the contents of LDH，SOD，MDA and CAT in the supernatant of H2O2-induced cardiomyocytes

2.3 心肌細胞中TNF-α、COX-2、iNOS、NF-κB 含量測定結果

TNF-α、COX-2、iNOS、NF-κB 是重要的炎癥因子與炎癥介質，其含量的高低與炎癥程度成正相關。實驗結果顯示，相對于正常組，模型組心肌細胞組織中TNF-α、NF-κB、COX-2 和iNOS 炎癥因子mRNA 含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），SYG 高、中、低劑量組能使COX-2 和iNOS mRNA 表達量降低（P＜0.05，P＜0.01），SYG 高、中劑量組能使TNF-α mRNA 表達量降低（P＜0.05），SYG 中、低劑量組能使NF-κB mRNA 表達量降低（P＜0.05，Fig.3）。

Fig.3 Effects of SYG on the expression of inflammatory factors TNF-α，COX-2，iNOS and NF-κB in H2O2-induced cardiomyocytes

3 討論

大量研究證實心肌缺血時會產生大量自由基，造成心肌細胞氧化損傷，誘發(fā)炎癥反應［6］。在正常生理狀態(tài)下，機體內的氧化劑與抗氧劑之間存在著動態(tài)平衡，維持機體的正常生理功能，一旦心肌細胞受損會使機體內氧化劑與抗氧劑之間的動態(tài)平衡被破壞，使得心肌細胞內產生大量的自由基，誘發(fā)氧化應激，進而發(fā)生一系列的炎癥反應，影響機體的各項功能［7］。在氧化應激反應中，H2O2作為一種重要的活性氧，在體內氧化代謝起著非常重要的作用，其可以誘發(fā)機體內的核酸、蛋白等發(fā)生不同形式的氧化反應，引發(fā)炎癥反應或細胞死亡［8］。本研究以H2O2誘導心肌細胞模擬心肌缺血后引發(fā)的系列氧化應激及炎癥反應，用以評價SYG 對心肌缺血的影響。

氧化應激反應與心肌細胞損傷密切相關，是缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素［9］。氧化應激包括氧化產物生成的增加和抗氧化酶活性的降低。SOD 作為機體內的一種抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），減輕氧化應激反應［10］。MDA 是細胞膜脂質過氧化過程中穩(wěn)定的代謝終產物之一，其含量的高低能夠反應體內脂質過氧化的程度，從而反應體內ROS 的水平。CAT 作為H2O2分解的催化酶能夠使得H2O2快速轉化為其他無害或較小毒性物質，減輕其對機體的危害［11］；LDH 在機體內的各個細胞中都有存在，是催化乳酸進行氧化反應的催化酶，其漏出量的增加，往往標志著心肌細胞受到了不可逆的損傷［12］。本實驗結果顯示，經過SYG 干預后，各劑量組能夠不同程度的增加H2O2誘導所致的SOD、CAT 的降低，能夠降低H2O2誘導所致的MDA、LDH 的增加，在一定程度上顯示出較強的抗氧化應激的作用。

TNF-α作為一種促炎因子其可以激活經典的NF-κB 信號通路。NF-κB 信號通路在免疫、炎癥、應激反應中均起到了重要的作用，其可以被促炎因子、脂多糖、生長因子等物質激活，由細胞質進入到細胞核，進而誘發(fā)炎癥因子如：iNOS、COX-2 等的表達［13-15］，從而誘發(fā)炎癥反應。本實驗結果顯示，SYG 能夠顯著性降低H2O2誘導后心肌細胞內TNF-α、iNOS、COX-2 及NF-κB mRNA 的表達，顯示出一定的抗炎作用。

綜上所述，SYG 能夠抑制H2O2誘導后心肌細胞的氧化應激反應及炎癥反應，對心肌缺血有一定的保護作用，根據實驗結果推測其抗炎作用機制可能為抑制TNF-α激活NF-κB 信號通路，從而抑制iNOS 及COX-2 的表達，但具體作用機制仍需進一步明確。課題組在后期的研究中將繼續(xù)深入研究SYG 對氧化應激及炎癥反應的保護作用機制，力求全面闡釋SYG 對心肌缺血保護作用，為芍藥甘草湯的臨床應用提供可借鑒的實驗依據。