周麗倩，黃 瑤，魯 艷，葉姿妤，劉欣嵐，丁 祥，侯怡鈴*

1西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，南充 637009

羊肚菌(Morchellaesculenta)也被俗稱為“羊肚菜”“羊肚子”等，是低溫腐生型蕈菌，屬于子囊菌亞門盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬，是世界上珍貴稀有的食藥用大型真菌之一，在我國(guó)分布廣泛，主要分布在我國(guó)云貴川、東三省以及西北部的新疆、西藏等地區(qū)[7]。羊肚菌多糖是從羊肚菌子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵提取液中提取的天然活性產(chǎn)物，是羊肚菌的有效活性成分之一。天然多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等功能[7]。目前四川小金縣的野生羊肚菌多糖的結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤活性尚未見報(bào)道。本研究通過熱水浸提法從四川小金縣野生羊肚菌中提取到多糖(Morchellaesculentapolysaccharide，ME-P)，利用傅里葉紅外光譜、高效液相色譜、氣相質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振波譜等技術(shù)進(jìn)行ME-P一級(jí)結(jié)構(gòu)的解析。同時(shí)選取貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)檢測(cè)其藥物毒性，并以結(jié)腸癌細(xì)胞(CT26.WT)和胃癌細(xì)胞(MFC)為例對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。擬為四川小金縣羊肚菌資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與設(shè)備

羊肚菌購(gòu)自四川省小金縣；ME-P經(jīng)熱水浸提及純化獲得[8]；巨噬細(xì)胞株RAW 264.7、結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT、胃癌細(xì)胞MFC(上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)；重水D2O；碘甲烷(批號(hào)2020040601，分析純)；六甲基二硅烷胺(批號(hào)20111017，分析純)；三甲基氯硅烷(生工科技有限公司，批號(hào)2020040801，分析純)；吡啶(上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)P816288，分析純)；溴化鉀KBr(分析純)；三氟乙酸TFA(世貿(mào)化工有限公司，貨號(hào)LK60S11，色譜級(jí))；乙腈(美國(guó)Thermo Fisher，色譜級(jí))；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號(hào)11835055)；胎牛血清(Gibco公司，貨號(hào)16140071)；CCK-8 A cell counting kit(上海碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號(hào)C0038)。

HWS28 恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ST40離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；TΜ-1901/1900系列傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；1260高效液相儀、7890A GC-MS儀(美國(guó)Agilent公司)；Bruker DRX-600(300)超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；Epoch酶標(biāo)儀(Wultiskam Go，Gene有限公司)。

1.1 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析

稱取2 mg 冷凍干燥后的ME-P和200 mg KBr于研缽中，研磨充分后用壓片機(jī)制片，將片置于傅里葉紅外光譜儀中，在波數(shù)500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[9]。

1.3 ME-P的高效液相色譜(HPLC)分析

稱取20 mg ME-P，加入摩爾濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液5 mL，封瓶后水浴(100 ℃)水解6 h，12 000 r/min 離心5 min棄沉淀，將三氟乙酸揮發(fā)除盡后干燥得到水解后的多糖。以75%乙腈作為溶劑分別將完全水解后的多糖ME-P和單糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為5 μg/mL的待測(cè)樣品，經(jīng)HPLC測(cè)定后，與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比對(duì)，對(duì)ME-P的單糖組分及比例進(jìn)行判定。

HPLC條件：RID檢測(cè)器；1.4 mL/min流速；上樣體積10 μL；柱溫恒定35 ℃；流動(dòng)相為75%乙腈。

1.4 ME-P的氣相質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析

對(duì)ME-P進(jìn)行甲基化處理后，用三氟乙酸水解，2 mL的無水嘧啶復(fù)溶，加入2 mL六甲基二硅烷胺、1 mL三甲基氯硅烷進(jìn)行硅烷化衍生，50 ℃水浴20 min后12 000 r/min離心取上清進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析測(cè)定[10]。

色譜條件為：Dionex ICS-3000離子色譜儀；電導(dǎo)檢測(cè)器；30 m×0.25 nm×0.25 μm的石英毛細(xì)管柱(DB-5MS)；載氣為高純氦；升溫程序?yàn)槌跏贾鶞?0 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 ME-P的核磁共振(NMR)分析

將50 mg ME-P充分溶于600 μL重水(D2O)，高速(12 000 r/min)離心10 min，取上清置于干燥核磁管中，以內(nèi)參四甲基硅烷(TMS)測(cè)定得到1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HMQC譜圖，用MestReNova 9.0軟件進(jìn)行分析。

1.6 ME-P的藥物毒性檢測(cè)及對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞(巨噬細(xì)胞株RAW 264.7、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26.WT、小鼠胃癌細(xì)胞株MFC)消化后稀釋至密度為1×105個(gè)/mL后分別加入96孔板中，每孔100 μL，為避免邊緣效應(yīng)在邊緣孔加入200 μL PBS緩沖液。在37 ℃、5% CO2孵箱中恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞已完全貼壁且狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)及抗腫瘤活性檢測(cè)。

藥物毒性檢測(cè)：按100 μL/孔的加樣量依次加入不同質(zhì)量濃度(1.25、5、10、20 μg/mL)的ME-P溶液作實(shí)驗(yàn)組；巨噬細(xì)胞陽性對(duì)照組加入100 μL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的脂多糖(LPS)溶液、空白對(duì)照組(CK)加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔。恒溫培養(yǎng)24、48 h后，向每孔分別加入5 μL CCK-8試劑，再繼續(xù)培養(yǎng)3 h檢測(cè)其在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值。

抗腫瘤活性檢測(cè)：按100 μL/孔的加樣量依次加入不同質(zhì)量濃度(1.25、5、10、20 μg/mL)的ME-P溶液作實(shí)驗(yàn)組，腫瘤細(xì)胞陽性對(duì)照組加入100 μL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的甘露聚糖肽(MAN)溶液，空白對(duì)照組(CK)加入等體積的培養(yǎng)基，每組三個(gè)重復(fù)。腫瘤細(xì)胞恒溫培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8檢測(cè)其細(xì)胞活力。

上述檢測(cè)結(jié)果按下式計(jì)算細(xì)胞(增殖)抑制率。

式中：p為細(xì)胞(增殖)抑制率；A1為空白對(duì)照組孔的吸光度值；A2為實(shí)驗(yàn)組孔、陽性對(duì)照組孔的吸光度值。

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析處理，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用平均標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪圖采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜

ME-P的FTIR(見圖1)在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)有明顯信號(hào)峰。在1 250～500 cm-1的指紋峰區(qū)域，1 114 cm-1處、1 187 cm-1處的信號(hào)峰分別為吡喃糖環(huán)上C-O-C和C-OH的伸縮振動(dòng)峰[11]。在4 000～1 250 cm-1的特征區(qū)，指定1 399 cm-1處信號(hào)峰為C-H的變角振動(dòng)峰；1 634 cm-1處的信號(hào)峰歸屬為C=O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；3 138 cm-1處的信號(hào)峰是糖環(huán)上次甲基C-H的伸縮振動(dòng)峰；3 432 cm-1處信號(hào)峰為ME-P的O-H的伸縮振動(dòng)峰[12]。以上特征吸收峰表明ME-P是含吡喃糖環(huán)的多糖。

圖1 ME-P的紅外光譜Fig.1 Fourier transform infrared spectra of ME-P

2.2 高效液相分析

高效液相色譜結(jié)果如圖2 所示，單糖標(biāo)準(zhǔn)品(見圖2a)的保留時(shí)間顯示葡萄糖保留時(shí)間為14.214 min、半乳糖為16.704 min、甘露糖為18.614 min，ME-P(見圖2b)水解單糖的組分保留時(shí)間分別為14.194、16.693、18.608 min，與單糖標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后顯示ME-P的單糖組分為葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)三種，根據(jù)各水解單糖的峰面積(見表1)提示Man、Glc、Gal含量比為4∶4∶1。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品(a)及ME-P(b)的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of standards(a) and ME-P(b)

表1 ME-P水解單糖的保留時(shí)間Table 1 Retention time of hydrolyzed monosaccharide from ME-P

2.3 氣相質(zhì)譜聯(lián)用分析

氣相質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果顯示(見表2、圖3)，ME-P中有兩種類型的甘露糖(Man)殘基碎片離子峰，分別為1,2,3,4,6-五-O-三甲基硅基-D-吡喃甘露糖及1-O-甲基-2,3,4,6-四-O-三甲基硅基-D-吡喃甘露糖，提示在ME-P中甘露糖(Man)殘基分別以1,2,3,4,6-方式及2,3,4,6-方式連接(見圖3a、3b)。在ME-P中葡萄糖(Glc)的碎片離子峰有2,3,4-三-O-甲基-1,6-二-O-三甲基硅基-D-吡喃葡萄糖和1,2,3,6-四-O-甲基-4-O-三甲基硅基-D-吡喃葡萄糖兩種，提示葡萄糖(Glc)在羊肚菌多糖中分別以1,6-方式和4-方式連接(見圖3c、3d)。而半乳糖(Gal)殘基在ME-P中則只存在1種，碎片離子峰為3,4-二-O-甲基-1,2,6-三-O-三甲基硅基-D-吡喃半乳糖(見圖3e)，提示半乳糖(Gal)以1,2,6-方式連接。

表2 ME-P中單糖殘基的連接位點(diǎn)Table 2 Linkage sites of monosaccharides in ME-P

圖3 ME-P氣質(zhì)聯(lián)用碎片離子峰Fig.3 Fragment ion peak of ME-P by GC-MS

綜上，ME-P由1,2,3,4,6-D-Manp、2,3,4,6-D-Manp、1,6-D-Glcp、4-D-Glcp、1,2,6-D-Galp殘基組成，各單糖殘基的含量顯示甘露糖為44.3%，葡萄糖44.7%，半乳糖11.0%，其Man∶Glc∶Gal摩爾比為4∶4∶1。其中，葡萄糖的2種殘基1,6-D-Glcp、4-D-Glcp的含量分別為33.8%和10.9%，摩爾比為3∶1。

2.4 核磁共振分析

ME-P的1H NMR譜如圖4所示，異頭質(zhì)子區(qū)δ4.5～5.5范圍內(nèi)有9個(gè)共振信號(hào)峰，化學(xué)位移分別為δ5.22、5.19、5.11、5.06、5.03、5.01、4.98、4.90、4.85。各異頭質(zhì)子信號(hào)峰的積分比為1.13∶1.76∶1.25∶1.16∶1.57∶1.74∶1.00∶0.31∶0.47。位于δ3.00～4.50區(qū)域內(nèi)的信號(hào)峰為ME-P單糖糖環(huán)上C2～C6的氫原子信號(hào)重疊。

圖4 羊肚菌多糖(ME-P)的1H NMR圖譜Fig.4 The 1H NMR spectrum of ME-P

ME-P的13C NMR譜(見圖5)可以看出在δ90～110共振區(qū)域有9個(gè)異頭碳的共振峰，化學(xué)位移分別為：δ109.2、108.1、104.8、104.2、102.2、100.6、99.4、98.2、97.8。δ60～81共振區(qū)域?yàn)槎嗵菤埢鵆2～C6信號(hào)位移的重疊。在δ82～88區(qū)域內(nèi)無吸收信號(hào)，表明ME-P均由吡喃糖構(gòu)成[13]。在范圍為δ67～70有信號(hào)，提示ME-P中存在(1→6)糖苷鍵，而δ80～83的信號(hào)則表明ME-P中存在(1→3/4)糖苷鍵[14]。

圖5 ME-P 的13 C NMR圖譜Fig.5 The 13C NMR spectrum of ME-P

1H-1H COSY譜反映氫原子之間的位移關(guān)系，根據(jù)ME-P的1H-1H COSY譜(見圖6)可解析所有單糖殘基氫的化學(xué)位移。A～I(xiàn)峰為異頭氫與相鄰碳上的氫之間的化學(xué)信號(hào)，以A峰(δ5.22/δ3.42)為例：其異頭氫化學(xué)位移為δ5.22，對(duì)應(yīng)的鄰位氫化學(xué)位移為δ3.42，則位于δ5.22/δ3.42的信號(hào)峰歸屬為1,6-D-Glcp殘基H1與H2的共振耦合信號(hào)，并依次將B峰(δ5.19/δ3.97)、C峰(δ5.11/δ3.91)、D峰(δ5.06/δ3.83)、E峰(δ5.03/δ3.93)、F峰(δ5.01/δ4.01)、G峰(δ4.98/δ3.77)、H峰(δ4.90/δ3.88)、I峰(δ4.85/δ3.65)分別歸屬于1,6-D-Glcp、1,6-D-Glcp、2,3,4,6-D-Manp、2,3,4,6-D-Manp、1,2,3,4,6-D-Manp、1,2,6-D-Galp、4-D-Glcp、1,2,3,4,6-D-Manp殘基上H1與H2的共振耦合信號(hào)。綜上，每個(gè)單糖殘基上H1～H6的信號(hào)位移歸屬見表3。根據(jù)氫譜中積分曲線結(jié)果顯示，羊肚菌中各單糖殘基摩爾比為Man∶Glc∶Gal為4∶4∶1，該結(jié)果與高效液相結(jié)果一致。

圖6 ME-P的1H-1H COSY圖譜Fig.6 1H-1H COSY spectrum of ME-P

表3 ME-P 的H原子的化學(xué)位移Table 3 Chemical shift of H atom of ME-P

HMQC能反映直接相連的碳?xì)潢P(guān)系，根據(jù)異頭氫與異頭碳的共振耦合信號(hào)，可以將其進(jìn)行歸屬，例如A峰H1/C1(δ5.22/δ108.1)即歸屬為1,6-D-Glcp的H1與C1的共振耦合信號(hào)，并依次指定B峰H1/C1(δ5.19/δ99.4)、C峰H1/C1(δ5.11/δ100.6)、D峰H1/C1(δ5.06/δ109.2)、E峰H1/C1(δ5.03/δ104.8)、F峰H1/C1(δ5.01/δ104.2)、G峰H1/C1(δ4.98/δ98.2)、H峰H1/C1(δ4.90/δ102.2)、I峰H1/C1(δ4.85/δ97.8)分別為1,6-D-Glcp、1,6-D-Glcp、2,3,4,6-D-Manp、2,3,4,6-D-Manp、1,2,3,4,6-D-Manp、1,2,6-D-Galp、4-D-Glcp、1,2,3,4,6-D-Manp的H1與C1的耦合信號(hào)，分別與1H-1H COSY譜中A～I(xiàn)峰相對(duì)應(yīng)(見圖7)。根據(jù)各單糖殘基質(zhì)子信號(hào)的位移依次歸屬C2～C6信號(hào)位移，結(jié)果見表4。

圖7 ME-P的HMQC圖譜Fig.7 HMQC spectrum of polysaccharide ME-P

表4 ME-P 的C原子的化學(xué)位移Table 4 Chemical shift of C atom of ME-P

綜合以上HPLC、FT-IR、GC-MS和NMR的結(jié)果顯示，ME-P由甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)組成，比例為4∶4∶1；其一級(jí)結(jié)構(gòu)是以1,2,3,4,6-D-Manp與2,3,4,6-D-Manp交替連接為骨架，1,6-D-Glcp、1,2,6-D-Galp作為支鏈，4-D-Glcp與1,2,6-D-Galp連接作為末端糖的重復(fù)單位，經(jīng)Scifinder查新結(jié)果顯示，ME-P為一種結(jié)構(gòu)新穎的多糖(見圖8)。

圖8 ME-P的一級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Primary structure of ME-P注：a、e為1,2,3,4,6-D-吡喃甘露糖；b、f為2,3,4,6-D-吡喃甘露糖；c、d、g為1,6-D-吡喃葡萄糖；i為4-D-吡喃葡萄糖；h為1,2,6-D-吡喃半乳糖。Note: a,e are 2,3,4,6-D-mannopyranose;b,f are 2,3,4,6-D-mannopyranose;c,d,g are 1,6-D-glucopyranose;i is 4-D-glucopyranose;h is 1,2,6-D-galactopyranose.

2.5 ME-P的藥物毒性檢測(cè)

與空白對(duì)照組相比，ME-P刺激巨噬細(xì)胞24 h后顯示極顯著(P<0.01)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，在1.25 μg/mL濃度的細(xì)胞活力最佳，增殖率可高達(dá)79.5%。在ME-P刺激巨噬細(xì)胞48 h的結(jié)果中，藥物組均能極顯著(P<0.01)提高細(xì)胞增殖活力，在濃度為10 μg/mL，增殖率可達(dá)53%(見圖9)。以上結(jié)果表明ME-P對(duì)正常免疫細(xì)胞無藥物毒性，且有顯著的增殖作用。

圖9 不同濃度ME-P處理RAW 264.7細(xì)胞24 h(左)、48 h(右)后的增殖率Fig.9 Proliferation rate of RAW 264.7 cells treated with different concentrations of ME-P for 24 h (left) and 48 h (right)注：CK為空白對(duì)照組，LPS(脂多糖)為陽性對(duì)照組。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note: CK is blank control group,and LPS (Lipopolysaccharide) is positive control group.Compared with blank control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.6 ME-P對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

2.6.1 ME-P對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT的抑制作用

ME-P對(duì)CT26.WT細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。與空白組相比，在1.25～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，ME-P對(duì)CT26.WT細(xì)胞的增殖有抑制作用，其中，在ME-P質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時(shí)，有顯著(P<0.05)抑制作用，且抑制率最高，為28.20%。

圖10 不同濃度ME-P處理CT26.WT細(xì)胞后的抑制率Fig.10 Inhibition rate of CT26.WT cells treated with different concentrations of ME-P注：CK為空白對(duì)照組；MAN(甘露聚糖肽)為陽性對(duì)照組。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note: CK is blank control group,and MAN (mannan peptide) is positive control group.Compared with blank control group,*P<0.05,**P<0.01.

Yang等[15]研究表明裂褶菌多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有抑制作用，抑制率可高達(dá)45.32%；Guo等[16]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞也有顯著抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，濃度為10 mg/mL時(shí)抑制率可達(dá)99.43%。我們的結(jié)果顯示，低濃度的羊肚菌多糖對(duì)體外培養(yǎng)的CT26.WT細(xì)胞增殖顯著抑制作用。

2.6.2 ME-P對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞MFC的抑制作用

ME-P對(duì)MFC細(xì)胞的處理結(jié)果如圖11所示。ME-P處理組抑制率在濃度范圍內(nèi)，隨著濃度升高，多糖的抑制作用減弱。在ME-P質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL和5 μg/mL時(shí)，其抑制效果均為極顯著(P<0.01)，而當(dāng)ME-P的質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時(shí)，抑制效果最佳，抑制率為34.23%。Lv等[17]發(fā)現(xiàn)黃精多糖能夠顯著抑制MFC細(xì)胞，且對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路有顯著影響。我們的結(jié)果表明低濃度的羊肚菌多糖對(duì)MFC細(xì)胞有極顯著抑制作用。

圖11 不同濃度ME-P處理MFC細(xì)胞后的抑制率Fig.11 Inhibition rate of MFC cells treated with different concentrations of ME-P注：CK為空白對(duì)照組，MAN(甘露聚糖肽)為陽性對(duì)照組。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note: CK is blank control group,and MAN (mannan peptide) is positive control group.Compared with blank control group,*P<0.05,**P<0.01.

值得注意的是，在本實(shí)驗(yàn)中，ME-P的抑瘤率并不呈濃度依賴性增長(zhǎng)，He等[18]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛圓球莖多糖對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞H22的抑瘤率隨著多糖濃度升高而降低。Gan等[19]則發(fā)現(xiàn)枸杞多糖對(duì)S180腫瘤的抑瘤效果低濃度(5 mg/kg)多糖抑瘤率高于高濃度(20 mg/kg)枸杞多糖。同時(shí)，多糖抗腫瘤機(jī)制不同，顯示出不同的劑量依賴關(guān)系。如Guo等[20]發(fā)現(xiàn)仿刺參多糖對(duì)HepG-2細(xì)胞直接殺傷作用，抑制率呈劑量依賴型，對(duì)Hca-F肝癌細(xì)胞的抑制則是通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抑制率并不呈劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)中羊肚菌多糖(ME-P)的抗腫瘤細(xì)胞結(jié)果顯示低濃度效果優(yōu)于高濃度，其相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

羊肚菌作為名貴野生食藥用真菌，其多糖的生物活性及其分子機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，不同羊肚菌所含多糖的組分比例有差異。He等[21]通過酶輔助法提取的梯棱羊肚菌多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖三種單糖組成，摩爾比為0.64∶0.55∶0.27，Xiong等[22]從六妹羊肚菌提取的多糖MSP由甘露糖，葡萄糖及半乳糖組成，各占比約為9∶1∶6。Peng等[23]提取到的梯棱羊肚菌多糖由木糖、葡萄糖、半乳糖以及少量的巖藻糖組成，比例為9.21∶8.59∶3.73∶1.00。以上研究表明羊肚菌多糖中甘露糖與葡萄糖含量較高，半乳糖含量較少，同時(shí)有少量巖藻糖、木糖。而本實(shí)驗(yàn)中采用熱水浸提法從四川小金縣羊肚菌中提取的ME-P，經(jīng)HPLC、FT-IR、GC-MS和NMR測(cè)定后顯示ME-P由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，各自比例約為4∶4∶1，單糖均為吡喃構(gòu)型，且單糖含量符合以往研究規(guī)律。

不同結(jié)構(gòu)的多糖顯示出不同的體外抗腫瘤活性，在單糖組分中含有甘露糖和葡萄糖的多糖一般具有抗癌活性[13]，同時(shí)以β-(1→3)，α-(1→4)連接的葡聚糖主鏈，側(cè)鏈以β-(1→6)作為分支點(diǎn)的多糖則抗腫瘤活性強(qiáng)[1]。Zhu等[24]從橙蓋鵝膏分離出一種是以α-(1→4)-D-葡萄糖和α-(1→3)-D-葡萄糖為骨架，α-(1→3)-D-葡萄糖6-C上連接一個(gè)→1)-α-D-來蘇糖為側(cè)鏈的多糖(AC-1)，并發(fā)現(xiàn)AC-1對(duì)MFC細(xì)胞有抑制作用，當(dāng)AC-1濃度為20 μg /mL時(shí)抑制率高達(dá)30.09%。Liu等[25]從羊肚菌中提取的多糖MEPN-B-II鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，摩爾比10.6∶13.1∶3.2∶29.8∶43.3；形成重復(fù)單元以→1)-α-D-Galp-(4→和→1)-β-D-Glcp-(4→連接構(gòu)成主鏈，→1)-α-D-Manp-(2→為分支連接→1)-α-D-Glcp-(4→為非還原性末端的多糖結(jié)構(gòu)，該多糖能夠體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)且抑制率可高達(dá)87%，最適濃度為1 000 μg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ME-P是具有以1,2,3,4,6-D-甘露糖、2,3,4,6-D-甘露糖交替連接為骨架，1,6-D-葡萄糖、1,2,6-D-半乳糖作為支鏈，4-D-葡萄糖與1,2,6-D-半乳糖連接作為末端糖的重復(fù)單位的多糖，在ME-P為1.25 μg/mL濃度時(shí)，對(duì)MFC和CT26.WT的抑制率分別為34.23%和28.20%。同一多糖對(duì)不同癌細(xì)胞效果不一，一般以甘露糖，葡萄糖，半乳糖占比大的多糖抗腫瘤效果好。同時(shí)不同骨架的多糖對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞的抑制效果亦有差異，例如以葡萄糖為主骨架、分支少的多糖比以甘露糖為主鏈、葡萄糖為支鏈的多糖對(duì)胃癌細(xì)胞(MFC)抑制率低，而以半乳糖為主鏈、甘露糖為支鏈的多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效果很明顯。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)榆耳多糖中單糖組成為半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖的GI1-3比只含葡萄糖、甘露糖和木糖的GI1-4b抑瘤效果好。巨噬細(xì)胞有對(duì)甘露糖和葡萄糖具有高度專一性的受體，使得含葡萄糖、甘露糖的多糖體內(nèi)通過免疫系統(tǒng)達(dá)到抑癌作用的效果明顯[13]。我們?cè)跈z測(cè)藥物毒性時(shí)亦發(fā)現(xiàn)含有較大比例甘露糖和葡萄糖的ME-P對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7有極顯著(P<0.01)增殖作用。

綜上所述，本研究利用傅里葉紅外、核磁共振、氣相質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)解析了四川小金縣羊肚菌多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)，ME-P由甘露糖、葡萄糖、半乳糖以4∶4∶1的比例組成，是以1,2,3,4,6-D-甘露糖 與2,3,4,6-D-甘露糖為主鏈，1,6-D-葡萄糖和1,2,6-D-半乳糖作為支鏈，4-D-葡萄糖與1,2,6-D-半乳糖連接作為末端糖的重復(fù)單位的結(jié)構(gòu)新穎的多糖。藥物毒性檢測(cè)顯示ME-P對(duì)巨噬細(xì)胞無毒害作用，且能極顯著提高細(xì)胞增殖活力，增殖率可達(dá)79.5%。體外抗腫瘤活性顯示ME-P對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞均有抑制作用，在質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時(shí)，對(duì)CT26.WT結(jié)腸癌細(xì)胞和MFC胃癌細(xì)胞的抑制率分別為28.20%和34.23%。以上研究結(jié)果表明ME-P的結(jié)構(gòu)新穎，無毒副作用并具有一定的抗腫瘤活性，該結(jié)果為羊肚菌多糖的開發(fā)與應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。