雒曉芳，徐開慧，王迎菲，王婉瑩，許 瑾，張禹晗，陳麗華*

1西北民族大學(xué)實驗教學(xué)部；2西北民族大學(xué)化工學(xué)院；3西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030

阿維菌素是一類典型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常用作獸藥在畜牧業(yè)中發(fā)揮重要作用。隨著畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展，人類對抗生素的需求量也日益增加。目前我國每年生產(chǎn)使用抗生素約為18.9萬噸，其中較大部分被應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，其中獸藥抗生素的使用量大約占到畜牧業(yè)使用抗生素總量的一半以上[1]。在2010年，我國的獸藥原料和使用量超過日本和美國，成為世界第一獸藥原料使用大國[2]。但大量使用的抗生素可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，獸藥抗生素進(jìn)入生物體后一部分被吸收，而另一部分抗生素超出了受藥牲畜的承受范圍而被排出體內(nèi)，借助遷移作用，抗生素隨之轉(zhuǎn)移到不同的生態(tài)系統(tǒng)中[3]，從而在水和土壤中不斷累積，這會影響環(huán)境中生物的正常生命運(yùn)轉(zhuǎn)[4]。因此，高效簡便地處理目前環(huán)境中殘留的抗生素，防止其對生物造成進(jìn)一步傷害成為了人們研究的熱點。

目前抗生素的處理方法主要有物理吸附法、高級氧化法和微生物降解法[5]。由于人們環(huán)保意識不斷加強(qiáng)，微生物降解法成為研究者青睞的技術(shù)[6]?，F(xiàn)今，已報道的可降解阿維菌素的微生物主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[7]、不動桿菌(Acinetobacterlwoffi)[8]、志賀氏菌(Shigella)[9]、白腐真菌[10]等，它們通常利用新陳代謝作用產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類降解酶對阿維菌素進(jìn)行降解，但大多數(shù)研究僅簡單通過單因素實驗研究微生物對阿維菌素的降解特性，沒有利用正交法或響應(yīng)面法進(jìn)一步分析，無法準(zhǔn)確得出最優(yōu)降解條件。故本實驗以阿維菌素為代表抗生素，利用高效液相色譜法[11]測得不同溫度、pH、裝樣量、菌種液量、培養(yǎng)時間條件下枯草芽孢桿菌、志賀氏菌對阿維菌素的降解特性，并利用響應(yīng)面法[12]分析降解特性以得到該微生物菌株降解阿維菌素的最佳條件，以期為微生物降解阿維菌素乃至其余獸藥抗生素的實際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%阿維菌素原藥(成都華夏試劑廠，20190327)；無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NH4Cl 1.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蛋白胨0.2 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.0[13])；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、牛肉浸出粉3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；枯草芽孢桿菌、志賀氏菌(蘭州市黃河段河水中分離篩選)。

1.2 儀器

Aglient1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；超凈工作臺(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)；高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；分析天平(梅特勒-托利多公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.1 液相色譜儀工作條件

選擇測定波長244 nm、流動相為甲醇-水、流動相比例為95∶5、流量1 min/mL、柱溫28 ℃、進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱量100 mg阿維菌素，放入100 mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度線，配制成1 000 mg/L的阿維菌素母液，搖勻，放入冰箱備用。

分別移取阿維菌素母液加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中稀釋至20、40、60、80、100 mg/L。然后從不同濃度阿維菌素溶液中分別移取2 mL至試管中，加入4 mL乙腈及0.5 g NaCl，將試管于振蕩器上振蕩1 min，靜置30 min[14]。取上層清液通過0.45 μm的濾膜過濾。用高效液相色譜儀測得其峰面積，根據(jù)結(jié)果繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 單因素實驗設(shè)計

將溫度、pH、裝樣量、菌種液量、培養(yǎng)時間作為影響因素，測得其對各菌株降解能力的影響，篩選出影響最顯著的三組因素進(jìn)行多因素實驗。

菌種液的制備：通過無機(jī)鹽培養(yǎng)基在50 mL三角瓶中以35 ℃、pH為7、120 r/min震蕩通氣條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和志賀氏菌。通過血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，稀釋菌種液的菌濃至約1×108CFU/mL

1.4.1 溫度對降解性能的影響

根據(jù)一般細(xì)菌的生長溫度范圍為5～60 ℃，同時中性細(xì)菌的最適溫度一般為37 ℃，設(shè)計溫度梯度為25、30、35、40、45 ℃。固定實驗條件裝樣量80 mL(250 mL三角瓶)、菌種液1 mL、pH 7.0、120 r/min震蕩通氣培養(yǎng)6 d，研究溫度對微生物菌株降解阿維菌素的影響。

1.4.2 pH對降解性能的影響

根據(jù)本實驗所用菌株最適pH范圍均為7.2～7.6，設(shè)計pH梯度為5、6、7、8、9，通過向培養(yǎng)基中加入適量鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至所需值。固定實驗條件溫度35 ℃、裝樣量80 mL、菌種液1 mL、培養(yǎng)時間6 d，研究pH對微生物菌株降解阿維菌素的影響。

1.4.3 裝樣量對降解性能的影響

設(shè)計裝樣量梯度為40、60、80、100、120 mL，通過加入不同體積的無機(jī)鹽培養(yǎng)基達(dá)到所需裝樣量。固定實驗條件溫度35 ℃、裝樣量80 mL、菌種液1 mL、培養(yǎng)時間6 d，研究pH對微生物菌株降解阿維菌素的影響。

1.4.4 菌種液量對降解性能的影響

設(shè)計菌種液量梯度為0.625%、1.25%、2.5%、3.75%、5%(加入適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基對菌種液量為1×108CFU/mL的菌懸浮液進(jìn)行稀釋以達(dá)到目標(biāo)濃度)。固定實驗條件溫度35 ℃、裝樣量80 mL、培養(yǎng)時間6 d，研究菌種液量對微生物菌株降解阿維菌素的影響。

1.4.5 培養(yǎng)時間對降解性能的影響

設(shè)計培養(yǎng)時間梯度為1、2、3、4、5、6 d。固定實驗條件溫度35 ℃、裝樣量80 mL、菌種液量1.25%，研究培養(yǎng)時間對微生物菌株降解阿維菌素的影響。

1.5 多因素實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，將溫度、裝樣量、菌種液量作為自變量，降解率為響應(yīng)值，利用Design-Expert中的Box-Behnken 模塊設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面實驗。每組實驗重復(fù)3次。根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行模型的建立及響應(yīng)面分析。響應(yīng)面設(shè)計因素與水平如表1、表2。

表1 枯草芽孢桿菌響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization design of Bacillus subtilis

表2 志賀氏菌響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface optimization design of Shigella

利用Design-Expert對阿維菌素的降解實驗進(jìn)行設(shè)計，可得出枯草芽孢桿菌及志賀氏菌對阿維菌素的理論最大降解率及此時的降解條件。將降解條件固定，利用最佳降解條件對阿維菌素進(jìn)行降解，以驗證優(yōu)化后方案的準(zhǔn)確性及可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

由圖1可知，阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.9973，說明在20～100 mg/L范圍內(nèi)該曲線線性關(guān)系良好，可用于實驗數(shù)據(jù)分析。

圖1 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of avermectin

2.2 初篩實驗結(jié)果分析

根據(jù)實驗結(jié)果可知，在1 d的培養(yǎng)時間內(nèi)，枯草芽孢桿菌對阿維菌素的降解率為(21.76±0.88)%，志賀氏菌對阿維菌素的降解率為(17.91±0.66)%，即說明分離篩選獲得的兩株細(xì)菌均有較好的阿維菌素降解能力，可進(jìn)一步優(yōu)化研究其對阿維菌素的降解性能。

2.3 單因素實驗分析

2.3.1 溫度單因素條件下微生物菌株對阿維菌素降解率的影響

溫度是影響細(xì)菌生長的重要因素，而細(xì)菌的生長量能夠間接反應(yīng)出其對抗生素的降解性能。由圖2可知，隨著溫度的升高，枯草芽孢桿菌的降解率在30～35 ℃時呈現(xiàn)上升趨勢，在35 ℃時達(dá)到峰值，超過35 ℃則下降較明顯，說明枯草芽孢桿菌的生長和對阿維菌素降解性能與溫度關(guān)系密切。志賀氏菌的降解率在30 ℃時達(dá)到最大值，高于30 ℃呈下降趨勢。當(dāng)溫度不為最適降解值時，細(xì)胞的生長均會受到影響，過高的溫度會抑制細(xì)菌體內(nèi)酶的活性，從而影響細(xì)菌正常生長，而過低溫度會抑制細(xì)菌的代謝活力。此外，在不同溫度下，枯草芽孢桿菌對阿維菌素的降解率均高于志賀氏菌。因此，35 ℃是枯草芽孢桿菌的最適降解溫度，30 ℃是志賀氏菌的最適降解溫度。

圖2 不同溫度下阿維菌素的降解率Fig.2 Degradation rate of avermectin at different temperatures

2.3.2 裝樣量單因素條件下微生物菌株對阿維菌素降解率的影響

由圖3可知，當(dāng)影響因素為裝樣量時，兩種菌株對阿維菌素降解率的變化趨勢基本一致，在40～60 mL時呈上升趨勢，在裝樣量為60 mL時降解率達(dá)到峰值，大于60 mL時呈下降趨勢。當(dāng)裝樣量大于60 mL時，體積較大的無機(jī)鹽培養(yǎng)基會抑制細(xì)菌的呼吸作用，從而阻礙細(xì)菌的生長；當(dāng)裝樣量較小時，無機(jī)鹽培養(yǎng)基無法給細(xì)菌提供充足的營養(yǎng)，較少的生存空間也會進(jìn)一步阻礙細(xì)菌生長。此外，細(xì)菌代謝會產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，過少的裝樣量會限制有害物質(zhì)的擴(kuò)散，繼而影響細(xì)菌生長。因此，60 mL為兩種菌株的最適裝樣量。

圖3 不同裝樣量條件下阿維菌素的降解率Fig.3 Degradation rate of avermectin at different sample loadings

2.3.3 初始菌種液量單因素條件微生物菌株對阿維菌素降解率的影響

由圖4可知，隨著菌種液量的增加，枯草芽孢桿菌和志賀氏菌對阿維菌素的降解率均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。枯草芽孢桿菌對阿維菌素的降解率在0.625%～2.5%快速增大，在菌種液量為2.5%時達(dá)到峰值，初始菌濃高于2.5%～5%降解率則呈下降趨勢。志賀氏菌對阿維菌素的降解率在0.625%～3.75%時逐漸增加，在菌種液量為3.75%時達(dá)到最大降解率，在3.75%～5%之間呈下降趨勢。當(dāng)菌種液量過大時，培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)量較多，營養(yǎng)物質(zhì)無法維持細(xì)菌的進(jìn)一步繁殖，從而使降解率下降。當(dāng)菌種液量過小時，細(xì)菌生長需要一定時間，在3 d內(nèi)難以達(dá)到理想的降解濃度。同時，不同菌株的生長速率不同，從而影響其降解性能。因此，2.5%是枯草芽孢桿菌的最適菌種液量，3.75%是志賀氏菌的最適菌種液量。

圖4 不同菌種液量下阿維菌素的降解率Fig.4 Degradation rate of avermectin at different bacterial concentrations

2.4 多因素實驗設(shè)計2.4.1 枯草芽孢桿菌響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇溫度30、35、40 ℃，裝樣量40、60、80 mL，菌種液量2.5%、3.75%、5%作為三因素三水平，利用Box-Behnken設(shè)計實驗如表3。

表3 枯草芽孢桿菌響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 3 Response surface test design and result analysis of Bacillus subtilis

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.4.2 枯草芽孢桿菌降解阿維菌素模型的建立及顯著性檢驗與方差分析

根據(jù)Box-Behnken中設(shè)計結(jié)果可知，該二次模型P=0.008 8<0.01，表明該模型是顯著的，具有統(tǒng)計學(xué)意義。而失擬項P=0.074 6>0.05，表明該模型失擬項不顯著，沒有失擬因素存在。該模型回歸方程為：

R=58.81+0.98A-4.65B+0.27C-4.67AB-0.58AC-8.46BC-8.88A2-23.40B2-7.75C2

由表4可知，方程中A2項和B2項P<0.05，表明A2和B2項對R值影響顯著。根據(jù)分析結(jié)果，影響阿維菌素降解率的影響因子主次順序為裝樣量>溫度>菌種液量。

表4 枯草芽孢桿菌回歸方程方差分析Table 4 Results of variance analysis of regression model of Bacillus subtilis

2.4.3 枯草芽孢桿菌降解阿維菌素模型的響應(yīng)面交互分析

根據(jù)枯草芽孢桿菌的回歸模型，選擇將溫度固定在一定水平，裝樣量和菌種液量交互影響作用的響應(yīng)面圖及等高線圖進(jìn)行分析。由圖5可知，等高線呈現(xiàn)橢圓形，具有較好的顯著性。在溫度為35 ℃、裝樣量為60 mL、菌種液量為3.75%時，可從3D建模中得到阿維菌素最大降解率為53.52%。

圖5 菌種液量和裝樣量交互影響降解率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of the effects of bacterial concentration and sample loading on degradation rate

根據(jù)Design Expert中Box-Behnken design中的優(yōu)化功能，得到枯草芽孢桿菌降解阿維菌素的優(yōu)化條件為溫度為35.43 ℃、裝樣量57.56 mL、菌種液量為3.85%，此時理論降解率為59.15%。

2.4.4 志賀氏菌響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇溫度25、30、35 ℃，裝樣量40、60、80 mL，菌種液量2.5%、3.75%、5%作為三因素三水平，利用Box-Behnken 設(shè)計實驗如表5。

表5 志賀氏菌響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 5 Response surface test design and result analysis of Shigella

2.4.5 志賀氏菌降解阿維菌素模型的建立及顯著性檢驗與方差分析

根據(jù)Box-Behnken中設(shè)計結(jié)果可知，該二次模型P=0.000 4<0.01，表明該模型是顯著的，具有統(tǒng)計學(xué)意義。而失擬值P=0.091 8>0.05，表明該模型失擬項不顯著，沒有失擬因素存在，即說明建立所得模型可靠性高，可進(jìn)行優(yōu)化分析。該模型回歸方程為：

R=65.30+11.14A+0.25B+3.36-1.70AB+0.30AC+0.96BC-27.82A2-14.10B2-10.41C2

為進(jìn)一步驗證所得方程的可靠性，采用回歸方程方差分析。分析可知，方程決定系數(shù)R2為96.00%，說明該模型的擬合性較好，僅有總變異的4.00%不能用該模型解釋，可用來為志賀氏菌降解阿維菌素進(jìn)一步分析提供依據(jù)。根據(jù)表6可知，方程中A2項、B2項、C2項P<0.05，表明A2、B2、C2項對R值影響顯著，其余均為不顯著，即P>0.05。由F值分析可知，影響阿維菌素降解率的影響因子主次順序為A溫度>C菌種液量>B裝樣量。

表6 志賀氏菌回歸方程方差分析Table 6 Results of variance analysis of regression model of Shigella

2.4.6 志賀氏菌降解阿維菌素模型的響應(yīng)面交互分析

根據(jù)志賀氏菌的回歸模型，選擇將菌種液量固定在一定水平，裝樣量和溫度交互影響作用的響應(yīng)面圖及等高線圖進(jìn)行分析。根據(jù)圖6可知，等高線呈現(xiàn)橢圓形，具有較好的顯著性。在溫度為30 ℃、裝樣量為60 mL、菌種液量為3.75%時，可從3D建模中得到最大降解率為53.63%。

圖6 溫度和裝樣量交互影響降解率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of the effects of temperature and sample loading on degradation rate

根據(jù)Design Expert 中Box-Behnken design中的優(yōu)化設(shè)計，得到志賀氏菌降解阿維菌素的優(yōu)化條件為溫度為30.45 ℃、裝樣量60.24 mL、菌種液量3.56%，此時理論降解率為65.34%。

2.5 驗證實驗

為確定優(yōu)化后得到的方案的準(zhǔn)確性，我們利用優(yōu)化后的方案對阿維菌素進(jìn)行降解實驗。固定降解條件，令枯草芽孢桿菌和志賀氏菌分別對阿維菌素進(jìn)行降解，進(jìn)行3組平行實驗。由表7可知，優(yōu)化后，枯草芽孢桿菌對阿維菌素的降解率達(dá)到58.59%，與其理論值較為接近，誤差僅為0.28%，同時比3D模型中得到的最大降解率高3%左右；志賀氏菌對阿維菌素的降解率達(dá)到66.47%，與其理論值較為接近，誤差僅為0.57%，同時比3D模型中得到的最大降解率高18%左右。說明優(yōu)化后方案顯著提高了其降解效率，建立的模型擬合性較好，同時能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測各因素對最終降解率的影響，即響應(yīng)面法能有效對降解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表7 模型驗證Table 7 Regression validation

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著綠色工業(yè)的逐步發(fā)展，在處理環(huán)境污染物方面，利用微生物菌株進(jìn)行降解逐漸成為研究者青睞的課題。由于阿維菌素水溶性較差，因此其在微生物降解法中周期較四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類抗生素更長，通常在15 d以上才能達(dá)到80%以上的降解效果。研究表明，僅有少部分菌株能夠更加高效地降解阿維菌素，如伯克霍爾德氏菌能夠在48 h內(nèi)降解80%左右的阿維菌素[15]、嗜熱脂肪芽孢桿菌在72 h對阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品的降解率可達(dá)到77.6%[16]。故研究并篩選出特定菌株有利于微生物降解法的進(jìn)一步發(fā)展。

細(xì)菌一般通過代謝產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素滅活轉(zhuǎn)移酶對該類物質(zhì)進(jìn)行降解，這些滅活轉(zhuǎn)移酶主要可以分為大環(huán)內(nèi)酯酯酶、2′-糖基磷酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)移酶mph1、糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶，它們能夠促使抗生素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生磷酸化、糖基化，從而使抗生素失去其原有性質(zhì)[17]。但目前常用于抗生素處理的菌株的降解機(jī)理仍未被完全探究，這也是現(xiàn)今研究者需要解決的難題。同時，近來研究也報道了一些能夠產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類滅活酶菌株，但并沒有進(jìn)行后續(xù)的降解性能測試，如肺炎支原體[18]、豬鏈球菌[19]、假單胞菌[20]等。

綜合研究現(xiàn)狀和存在問題，細(xì)菌降解阿維菌素的發(fā)展方向可分為以下幾點：①對微生物菌株降解阿維菌素的機(jī)理進(jìn)一步研究，為降解菌株的篩選提供依據(jù)。②通過篩選和組合不同種微生物菌株來達(dá)到更好的降解效果。③降低生產(chǎn)成本，選用價格適宜的培養(yǎng)基，培育生產(chǎn)周期短的菌種。④篩選出綠色環(huán)保、無二次污染的菌株能夠有效避免對環(huán)境造成次生污染。

在菌株篩選實驗中，枯草芽孢桿菌對阿維菌素的降解率較高，為21.76%；志賀氏菌的降解率較枯草芽孢桿菌略低，為17.91%。這說明枯草芽孢桿菌和志賀氏菌對阿維菌素有較強(qiáng)降解能力。進(jìn)一步對這兩株細(xì)菌的降解性能進(jìn)行探究，在優(yōu)化后條件下，枯草芽孢菌和志賀氏菌在實際降解中均有較好作用，但相對枯草芽孢桿菌，志賀氏菌的最佳降解溫度較低，有利于減少實際降解中能量的消耗。然而志賀氏菌為常見致病菌，在處理環(huán)境中阿維菌素殘留時可能會造成二次污染；枯草芽孢桿菌為非致病菌，對環(huán)境和人體不產(chǎn)生較大的影響，故能直接投入處理構(gòu)筑物中，無需進(jìn)行消毒處理，更為安全、環(huán)保，適合實際應(yīng)用。