馬 萌，陶 婷，馬挺軍

北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206

苦蕎麥又名烏麥、蕎子、三角麥等，屬蓼科蕎麥屬雙子葉植物，最早起源于中國(guó)，是世界上最早種植的農(nóng)作物之一，也是我國(guó)特有的糧藥兼?zhèn)涞男∽诩Z食作物[1]?！侗静菥V目》中記載，苦蕎麥味苦、平、寒，具有降氣寬腸，續(xù)精神，行氣化瘀等作用[2]。已有研究證明從苦蕎麥籽粒及其蛋白水解得到的多肽粗提物具有多種生物活性，如降膽固醇[3]、防癌抗腫瘤[4]、預(yù)防高血脂[5]及抗氧化[6]等作用。

生物活性肽具有多種生物功能，這與其氨基酸組成和順序密切相關(guān)[7]，因此研究多肽功效的關(guān)鍵就是對(duì)多肽結(jié)構(gòu)的鑒定。分離純化是研究多肽結(jié)構(gòu)和功效關(guān)系的關(guān)鍵一步，常用的多肽分離純化技術(shù)主要有色譜、膜分離、電泳等，其中色譜技術(shù)應(yīng)用最為普遍[8,9]。由于蛋白水解物組成復(fù)雜，所以在分離純化時(shí)常采用多種方法聯(lián)合處理以實(shí)現(xiàn)多肽的分離和富集[10-12]。以往研究表明[13]，苦蕎蛋白或酶水解產(chǎn)物具有多種生物活性，但是其生物活性機(jī)制尚不十分清晰，關(guān)于苦蕎活性肽結(jié)構(gòu)解析及生物活性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。Ma等[14]從消化后的蕎麥蛋白中分離鑒定出4種抗氧化多肽(WPL、VPW、VFPW和PW)，比蕎麥蛋白質(zhì)混合物清除ABTS自由基能力更強(qiáng)。Luo[15]采用堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白得到了苦蕎清蛋白酶解液，經(jīng)過(guò)超濾分離、陰離子交換色譜、反向高效液相色譜成功分離出苦蕎活性肽組分，并得到其氨基酸序列為Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp。

本研究以苦蕎功能提取物廢渣為原料提取苦蕎粗蛋白輔以植物乳桿菌發(fā)酵法制備苦蕎多肽。得到的苦蕎多肽發(fā)酵液經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂、葡聚糖凝膠、液相色譜純化后測(cè)定抗氧化活性，對(duì)篩選出抗氧化活性強(qiáng)的部位進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，探究苦蕎多肽粗提液抗氧化活性的主要來(lái)源，以期為苦蕎多肽的進(jìn)一步研究和在功能食品及保健品中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

提取黃酮、酚酸等物質(zhì)后的苦蕎廢渣，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)提供，經(jīng)全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定蛋白含量為10.7%；ABTS自由基、DPPH自由基(Sigma公司)；葡聚糖凝膠Sephadex G-15(色譜級(jí)，北京慧德易科技有限責(zé)任公司)；四肽標(biāo)準(zhǔn)品(Gly-Gly-Tyr-Arg)、三氯乙酸(TCA)(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶活試劑盒(南京建成生物工程研究所)；三氟乙酸(TFA)、氫氧化鈉(NaOH)(色譜純，北京化工)；五水硫酸銅、氯化鈉(分析純，北京化工)；95%乙醇(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；堿性蛋白酶(生物試劑，酶活為200 U/mg，北京索寶來(lái)科技有限公司)；石油醚(沸程30～60 ℃，分析純，北京東方博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC 14917(中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)；酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；S-8型大孔吸附樹(shù)脂(分析純，上海源葉生物有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV765型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精科儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(jì)(北農(nóng)雨禾北京科技發(fā)展有限公司)；玻璃塑料層析柱(180 mm×500 mm、2 cm×40 cm，江陰市新輝層析設(shè)備有限公司)；LC-18N-50B型真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；HD-4型紫外檢測(cè)儀(青島圣瀚化工儀器設(shè)備股份公司)；BSZ-100型自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；LC-20AD型高效液相色譜儀、LCMS-8040型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)；KQ-700E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(邦西儀器科技有限公司)；SW-CJ-1D型單人單面垂直凈化工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；Blue Pard型生化培養(yǎng)箱(上海恒科技有限公司)；YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Milli-Q型超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦蕎粗蛋白的制備

參考Tao[16]的實(shí)驗(yàn)方法并修改，將苦蕎廢渣干燥后磨碎，過(guò)60目篩，將苦蕎渣粉按照料液比(1∶15，W/V)加入石油醚中，在室溫下攪拌24 h進(jìn)行脫脂，過(guò)濾，重復(fù)脫脂操作處理兩次。

用去離子水與脫脂后的苦蕎粉按照1∶1比例混合，攪拌10 min，用5%NaOH調(diào)節(jié)pH至10，放置于46 ℃水浴鍋中。向容器中添加40 U/g堿性蛋白酶，酶解反應(yīng)20 min，加熱煮沸5 min。待溫度降至常溫，9 000 r/min離心12 min，倒出上清液，調(diào)節(jié)溶液pH至中性，得到苦蕎蛋白粗提液。調(diào)節(jié)苦蕎蛋白粗提液pH值至等電點(diǎn)4.5，5 000 r/min，4 ℃下離心30 min,得到沉淀，沉淀物用去離子水多次沖洗后調(diào)節(jié)其pH值為7.0，-70 ℃真空冷凍干燥24 h得到苦蕎粗蛋白固體粉末。

1.3.2 苦蕎多肽粗提液的制備

采用發(fā)酵法制備苦蕎多肽發(fā)酵液，參考唐田園[17]的方法，將植物乳桿菌培養(yǎng)到活菌數(shù)在log7.0 CFU/mL左右，按13%(V/V)的接種量接種到自制苦蕎粗蛋白培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵2 d，在100 ℃下滅酶10 min，6 000 r/min離心22 min，去除殘?jiān)∩锨逡?，得到苦蕎多肽發(fā)酵液。

1.3.3 S-8型大孔吸附樹(shù)脂分離純化苦蕎活性肽

將S-8型大孔吸附樹(shù)脂置于95%乙醇溶液中浸泡20 h，雙重水清洗至沒(méi)有乙醇味。用5% HCl清洗樹(shù)脂3 h，過(guò)濾保留樹(shù)脂，洗滌沉淀至溶液為中性，用3～5倍大孔吸附樹(shù)脂體積的NaOH(體積分?jǐn)?shù)6%)通柱3 h，過(guò)濾保留樹(shù)脂，洗滌沉淀至大孔吸附樹(shù)脂pH值為7左右待用。

取10 g上述處理之后的樹(shù)脂，加入適量雙重水，使大孔吸附樹(shù)脂保持濕潤(rùn)的狀態(tài)，灌裝到玻璃柱中，然后用雙重水沖洗柱子1 h，調(diào)節(jié)上樣溶液(即苦蕎多肽發(fā)酵液)pH值為5，以1.5 mL/min的速度開(kāi)始上樣，上樣結(jié)束后，用雙重水沖洗直至流出溶液為無(wú)色，然后使用乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

1.3.4 葡聚糖凝膠分離純化苦蕎活性肽

稱(chēng)取20 g的葡聚糖凝膠Sephadex G-15，濕法灌裝凝膠柱，柱子型號(hào)：2 cm×40 cm。將經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂部分純化后苦蕎多肽液，用雙重水溶解配制上樣液(濃度為5 mg/mL)，經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取濾液5 mL加入凝膠層析柱，設(shè)定洗脫速度0.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，用雙重水進(jìn)行洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)并以抗氧化活性為指標(biāo)，收集合并組分。

1.3.5 液相色譜分離純化苦蕎活性肽

選取經(jīng)Sephadex G-15葡聚糖凝膠分離后的抗氧化活性能力最佳的洗脫組分，采用反相液相色譜進(jìn)行分離。采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：水(0.1% TFA)，流動(dòng)相B：乙腈(0.1% TFA)，進(jìn)行線性洗脫，洗脫條件：乙腈(0%→75%，0～30 min)，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。根據(jù)監(jiān)測(cè)圖譜收集多肽并測(cè)定抗氧化活性以及鑒定多肽序列。

1.3.6 上清液中多肽含量測(cè)定、脫鹽處理

根據(jù)雙縮脲法[18]測(cè)定苦蕎多肽粗提液、大孔樹(shù)脂分離純化后、葡聚糖凝膠分離純化后、液相色譜分離純化后的上清液中苦蕎多肽含量。分別取10 mg/mL的多肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于潔凈的試管中，用雙重水補(bǔ)充至1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，震蕩混合，靜置30 min，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.056 1x-0.001 1(R2= 0.999 4)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多肽的含量。

用C18柱對(duì)純化后的苦蕎多肽進(jìn)行脫鹽處理，先用1 mL甲醇活化色譜柱，選用雙重水為洗脫液(0.1% TFA)對(duì)色譜柱進(jìn)行洗脫平衡，收集樣品后凍干，使用1 mL雙重水(0.1% TFA)再次溶解樣品之后進(jìn)樣，加入1 mL雙重水(0.1% TFA)進(jìn)行去雜，最后使用500 μL 80%乙腈(0.1% TFA)洗脫，收集洗脫液，凍干后待用。

1.3.7 苦蕎多肽純度測(cè)定

收集不同濃度乙醇洗脫液，按式(1)計(jì)算苦蕎多肽純度。

(1)

1.3.8 HPLC-MS/MS分析鑒定苦蕎麥活性肽分子量分布

使用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置一級(jí)掃描范圍為200～2 000 Da，溫度為320 ℃，電噴霧電壓為2.0 kV，不設(shè)置目標(biāo)肽段進(jìn)行自動(dòng)分析，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和質(zhì)譜軟件聯(lián)合分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的多肽研究，確定有效的多肽序列。

1.3.9 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.9.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定方法

參考Ma等[19]方法。樣品在3 000 r/min離心處理15 min后，取2 mL上清液于玻璃管中，添加2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，充分震蕩，在黑暗條件下靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度，用無(wú)水乙醇進(jìn)行調(diào)零，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。按式(2)計(jì)算DPPH自由基抑制率。

(2)

式中：Ac為2 mL無(wú)水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光值；Ai為2 mL樣品加2 mL DPPH溶液的吸光值；Aj為2 mL樣品加2 mL無(wú)水乙醇的吸光值。

1.3.9.2 清除ABTS自由基測(cè)定方法

參考Marino[20]的方法并修改。取4 mL ABTS溶液，加入40 μL苦蕎多肽上清液，混勻30 s，避光處理30 min，在波長(zhǎng)為734 nm處進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)三次平行。按式(3)計(jì)算抑制率公式。

(3)

式中：Ac為40 μL磷酸鹽緩沖液加4.0 mL ABTS溶液的吸光值；Ai為40 μL苦蕎多肽加4.0 mL ABTS溶液的吸光值；Aj為40 μL苦蕎多肽加4.0 mL磷酸鹽緩沖液的吸光值。

1.3.9.3 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的測(cè)定

參照南京建成生物公司SOD試劑盒法說(shuō)明書(shū)測(cè)定苦蕎多肽液中SOD活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂分離純化苦蕎多肽

苦蕎多肽粗提液經(jīng)過(guò)S-8型大孔吸附樹(shù)脂純化后，在上樣濃度為5 mg/mL，洗脫流速為1.5 mL/min，乙醇濃度為55%條件下，苦蕎多肽的純度由粗提液的22.18%提高到了70%。

2.2 葡聚糖凝膠分離純化苦蕎多肽

凝膠可以根據(jù)截留分子量的大小不同從而實(shí)現(xiàn)分離，葡聚糖凝膠由于分離條件溫和，對(duì)樣品活性影響較小并且可再生廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的分離，尤其是蛋白和多肽[21,22]。由圖1可知，將經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂富集、純化處理的苦蕎多肽液繼續(xù)使用Sephadex G-15進(jìn)行分離純化，獲得連續(xù)的五個(gè)峰，共分離出5個(gè)分子質(zhì)量大小不同的組分，分子質(zhì)量小在凝膠柱中保留時(shí)間長(zhǎng)，分子質(zhì)量較大，在凝膠柱中保留時(shí)間短，五個(gè)組分均在80 min內(nèi)洗脫出來(lái)，說(shuō)明五個(gè)組分分子量差別不大。由于微生物發(fā)酵使苦蕎蛋白分解成為分子量大小不等的多肽化合物，還有可能存在少數(shù)苦蕎蛋白未被水解現(xiàn)象，故多肽分子量是連續(xù)的。

圖1 苦蕎多肽紫外吸收?qǐng)DFig.1 UV absorption of tartary buckwheat peptide

經(jīng)葡聚糖凝膠分離得到的T-1、T-2、T-3、T-4、T-5各組分凍干進(jìn)行SOD酶活、DPPH以及ABTS等自由基清除實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抗氧化能力。由圖2可知，在幾種抗氧化能力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中，5個(gè)組分表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-2部分的SOD酶活明顯高于其他4個(gè)組分(P<0.05)；DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，各組分存在一定的差異(P<0.05)，清除能力依次為T(mén)-5 > T-4 > T-3 > T-2 > T-1；ABTS清除實(shí)驗(yàn)中，T-3、T-4、T-5均有較高的清除能力，抗氧化能力較強(qiáng)。T-3組分在ABTS和DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，且SOD酶活力大于T-4、T-5兩組分，因T-4、T-5組分純化獲得數(shù)量極少，綜合考慮，選取T-3組分進(jìn)行之后的純化及物質(zhì)鑒定。

圖2 不同組分抗氧化活性比較Fig.2 Comparison of antioxidant activity of different components 注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05)

2.3 液相色譜分離純化苦蕎多肽

由圖3可知，通過(guò)液相色譜分離得到的T-3組分紫外吸收?qǐng)D中，出現(xiàn)了一個(gè)響應(yīng)值較高的物質(zhì)峰，同時(shí)還伴隨著一些小雜峰，將響應(yīng)值較高的組分命名為T(mén)-3-1，收集濃縮后進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定。

圖3 T-3液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of T-3

2.4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)通過(guò)液相色譜分離得到的T-3-1組分進(jìn)行物質(zhì)鑒定，結(jié)果如圖4所示，從苦蕎多肽發(fā)酵液T-3-1組分中共鑒定出蛋白249種，多肽2 324條，Chen等[23]用乳酸菌發(fā)酵制備牛乳飲料中檢測(cè)到蛋白數(shù)量110種，多肽1 601條。由圖5可知，鑒定到的多肽長(zhǎng)度大多由10 ～ 15個(gè)氨基酸組成，屬于生物活性肽的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。

圖4 T-3-1的鑒定信息Fig.4 Identification of T-3-1

圖5 多肽長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Peptide length chart

大多數(shù)植物動(dòng)物蛋白中分離得到抗氧化活性肽，并且多肽序列以PYY、RWY、WY、RW、PWY、VYPF等結(jié)尾或開(kāi)頭的，一般都具有抗氧化活性[24]。通過(guò)對(duì)液相色譜分離得到組分T-3-1進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，從圖6結(jié)果中篩選得到氨基酸序列為酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Tyr-Leu-Pro-Phe，YLPF)和苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸(Phe-Pro-Tyr，F(xiàn)PY)，由此可以得出以苯丙氨酸和酪氨酸結(jié)尾的小段氨基酸序列抗氧化活性較顯著，這與Xie[25]研究得到的結(jié)論一致。

圖6 二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 Secondary MS spectrum

2.5 不同純度苦蕎多肽抗氧化活性測(cè)定

抗氧化基團(tuán)的暴露決定了抗氧化活性的大小[26,27]，由圖7可得，不同純度苦蕎多肽表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，其中，苦蕎多肽粗提液中可以檢測(cè)到少量的苦蕎多肽，可能是在酶提法提取苦蕎蛋白的過(guò)程中產(chǎn)生，由于苦蕎蛋白和多肽的共同存在，表現(xiàn)出一定的抗氧化作用；相對(duì)于苦蕎多肽粗提液和發(fā)酵液，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后的苦蕎多肽液對(duì)DPPH和ABTS抑制率顯著提高，分別為95%和82%；而經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠分離純化后的多肽組分T-3的DPPH抑制率稍有提高但幅度不大，達(dá)到了96%，其中ABTS抑制率升高到94%。

圖7 苦蕎多肽純度及抗氧化活性大小Fig.7 Purity and antioxidant of peptide at separation positions注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05).

有趣的是，通過(guò)液相色譜進(jìn)一步分離純化后得到的組分T-3-1多肽純度雖然達(dá)到了98%，但是對(duì)DPPH和ABTS抑制率不再增強(qiáng)，反而稍有下降，抑制率分別為89%和90%，這可能是由于苦蕎蛋白自身具有抗氧化活性，當(dāng)苦蕎蛋白與多肽混合物聚集在一起，表現(xiàn)出比更高純度苦蕎的多肽更強(qiáng)的抗氧化作用。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)Sephadex G-15葡聚糖凝膠分離純化，T-3組分的ABTS和DPPH自由基清除能力最優(yōu)，清除率分別為96%、94%。經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后的苦蕎多肽對(duì)DPPH和ABTS抑制作用較強(qiáng)，與凝膠分離純化得到的T-3組分相近，均表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。

對(duì)通過(guò)液相色譜分離得到的T-3-1組分進(jìn)行物質(zhì)鑒定，從T-3-1組分中共鑒定出蛋白249種，多肽2 324條，鑒定到的多肽長(zhǎng)度大多由10 ～ 15個(gè)氨基酸組成，屬于生物活性肽的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。由T-3-1組分質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析得到，主要抗氧化肽的氨基酸序列為苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸(Phe-Pro-Tyr，F(xiàn)PY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Tyr-Leu-Pro-Phe，YLPF)。

純度不同的苦蕎多肽抗氧化能力也不同，通過(guò)液相色譜進(jìn)一步分離純化T-3組分后得到的組分T-3-1，苦蕎多肽純度雖然達(dá)到了98%，但是對(duì)DPPH和ABTS抑制率不再增強(qiáng)，反而稍有下降，抑制率分別為89%和90%。說(shuō)明發(fā)酵法制備得到的苦蕎多肽可能抗氧化活性并沒(méi)有完全與多肽純度呈正相關(guān)，當(dāng)純度提高到一定程度后，多肽抗氧化活性反而下降。