車欣宇,林杭*,田丹*,韓明麗,徐夕雯,吳琛,楊文琪,潘國軍,肖娜**

連作丹參根際真菌的分離及拮抗菌RF15促生效應(yīng)

車欣宇1,林杭1*,田丹1*,韓明麗1,徐夕雯1,吳琛1,楊文琪1,潘國軍2**,肖娜1**

1. 山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 山東 泰安 271018 2. 山東第一醫(yī)科大學&山東省醫(yī)學科學院生命科學學院, 山東 泰安 271000

為探明連作丹參主要病原菌類型及篩選拮抗菌，本研究以連作2年的丹參根際土壤為材料，采用梯度稀釋涂布法進行根際土壤真菌的分離純化，并利用離體葉片接種法進行致病性測定，同時結(jié)合平板對峙法篩選有應(yīng)用價值的生防拮抗菌。結(jié)果表明，山東沂源縣連作丹參地塊中的主要土傳病原真菌為腐皮鐮刀菌（菌株編號RF3），在涂布丹參離體葉片5 d后，就表現(xiàn)出明顯的致病能力，葉片病斑面積達到66.196%，致病級數(shù)達到4級。以該病原菌為指示菌，篩選到3株有較強拮抗作用的真菌，抑制率均超過30%，其中，根際真菌RF15拮抗效果最好，抑制率為32.81%。盆栽試驗顯示，接種接抗菌RF15顯著促進了丹參幼苗株高和地上部生長，減少了須根數(shù)，經(jīng)拮抗菌RF15處理后丹參幼苗地上部鮮重、株高、干重均顯著高于未接菌對照，同時對病原菌抑制丹參幼苗生長有一定的改善效果?？梢姡H真菌RF15存在一定的拮抗效果且對丹參幼苗具有較好的促生效果，有望進一步研究開發(fā)成為微生物肥料生產(chǎn)菌種。

丹參; 真菌; 拮抗; 促生效應(yīng)

丹參（Bge.）又名紫丹參、赤參、紅根等，以根入藥，對心腦血管、腎功能不足等多種疾病有顯著療效，有極大的藥用價值和經(jīng)濟價值。丹參也是中藥學的研究熱點，是藥用植物研究中的主要模式植物[1]。近年來丹參產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，人工大面積栽培成為獲取丹參原料資源的主力方法，但丹參忌連作，連作障礙已成為制約丹參生產(chǎn)中的關(guān)鍵因素[2]。連作地塊中的丹參生長發(fā)育受限，土傳病害頻發(fā)，如根腐病、根結(jié)線蟲病、枯萎病等，嚴重影響丹參原材料的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。山東作為丹參種植主產(chǎn)區(qū)之一，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該主產(chǎn)區(qū)連續(xù)密集種植易使土壤中病原菌累積，影響丹參植株生長，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

目前，在我國中藥材農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，絕大部分根和根莖類藥材都存在不同程度的連作障礙，如人參、三七、地黃、丹參等，影響植物生長，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降。目前有關(guān)緩解丹參連作障礙的焦點主要集中在土壤環(huán)境及其理化性質(zhì)的改變、根系分泌物的化感自毒作用、土傳病害等方面，對丹參根際微生物的研究報道相對較少。根際微生物資源豐富，存在某些可用于防治土傳病害、改善土壤質(zhì)量、促進植物生長等有益微生物，是生防微生物篩選的重要來源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展中具有重要意義[4,5]。已有大量研究表示，將分離獲得的有益根際微生物接種到植物或土壤環(huán)境中，可以有效提高植物產(chǎn)量，避免使用化學藥劑污染環(huán)境、使病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題的出現(xiàn)，實現(xiàn)綠色安全農(nóng)業(yè)[6]?；尹S青霉菌CF3能夠顯著抑制附子根腐病病原菌尖孢鐮刀菌和齊整小核菌的生長[7]。健康林下參葉片中分離出一株球毛殼菌FS-01，F(xiàn)S-01能抑制立枯絲核菌的生長，抑制率為24.37%，對立枯絲核菌引發(fā)的人參立枯病有一定防治效果[8]。枸杞根腐病是其栽植區(qū)一種常見的土傳病害，從健康枸杞根際土壤中分離出的羅伯茨綠僵菌對根腐病的主要病原菌腐皮鐮刀菌的抑制效果明顯，抑菌率達39.80%[9]。從已有的研究基礎(chǔ)來看，分離篩選可培養(yǎng)的優(yōu)良拮抗根際微生物應(yīng)用前景廣闊，可進一步開發(fā)和利用。因此本研究以連作二年生丹參為研究對象，采用純培養(yǎng)法對丹參根際土壤進行根際真菌的分離，通過離體葉片接種法和平板對峙法確定連作丹參的病原菌和拮抗菌，并采用盆栽實驗對拮抗菌的促生效應(yīng)做進一步研究，為緩解丹參的連作障礙、根際真菌的功能開發(fā)及利用提供理論基礎(chǔ)，同時為藥用植物根際可培養(yǎng)微生物資源庫提供資源菌株。

1 材料與方法

1.1 材料來源

丹參根際土壤樣品于2020年9月采自山東淄博沂源丹參種植試驗基地（117°54'～118°31'E，35°55'～36°23'N）。樣品部分為連作種植二年生丹參根際10 cm深土壤，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料處理

將整個丹參根系挖出，輕輕抖動根系，將較大的土塊和根系附著不緊密的土壤顆粒去除，用毛刷掃下黏附在丹參根系上的根際土壤，混合裝入無菌自封袋進行收集，做好標記。土壤樣品轉(zhuǎn)移至實驗室后使用2 mm網(wǎng)篩除去較大顆粒和雜物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法

1.3.1 根際真菌的分離純化采用梯度稀釋涂布平板法。稱取連作種植二年生丹參根際土壤10 g，加入裝有玻璃珠的90 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃，160 r/min，震蕩15～20 min，使其充分混勻，此時土壤懸浮液濃度已稀釋10倍；吸取土壤懸浮液1 mL加入9 mL無菌水的離心管中，搖晃均勻，得到稀釋倍數(shù)為10-2的懸浮液，按照此方法將土壤懸浮液依次稀釋至10-4為止。分別吸取10-2、10-3、10-4三個梯度的土壤懸浮液100 μL涂布到孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d。待菌落特征明顯后，挑取形態(tài)較大的菌落，采用三點接種法接種至PDA平板上進行純培養(yǎng)，純化培養(yǎng)多次，確定為無雜菌的單菌株為止。

1.3.2 致病性測定采用離體葉片接種法。選用溫室盆栽中健康新鮮的丹參葉片，先用蒸餾水沖洗干凈，再用75%酒精噴灑葉片進行消毒，待水分揮干后備用。將分離純化的菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d，取菌餅置于PDB中，28 ℃，120 r/min搖床振蕩發(fā)酵5～7 d，發(fā)酵好的培養(yǎng)基經(jīng)雙層無菌紗布過濾，制成發(fā)酵濾液，濃度調(diào)整為1.0×107cfu/mL，以空白PDB培養(yǎng)基為對照。用無菌接種針將葉片刺傷，形成小傷口，吸取500 μL真菌發(fā)酵濾液均勻涂布在有微傷口的丹參葉片上，每個處理涂布3片葉，3次重復(fù)。滅菌濾紙用無菌水潤濕，包扎好以保持一定的濕度，25 ℃恒溫培養(yǎng)，處理組除第一次涂布真菌發(fā)酵濾液之外，每天同對照組噴無菌水保持濕潤，觀察記錄離體葉片情況。7 d后計算病斑相對面積。

病斑相對面積=葉片發(fā)病面積/葉片總面積×100%

1.3.3 拮抗菌的篩選采用平板對峙法。以鑒定出的連作丹參強病原菌腐皮鐮刀菌為指示菌株，將病原菌和待測非致病菌分別接入PDA平板中，兩菌塊相距4 cm，設(shè)置僅接種病原菌的平板為對照，將病原菌接種于培養(yǎng)皿中心十字交叉處，每個處理設(shè)3次重復(fù)，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)，觀察病原菌的生長情況，5 d后采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算抑制率。

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.3.4 拮抗菌對丹參幼苗生長的影響丹參種子育苗生長至3-4片真葉后，開始移栽，每盆栽植3株大小形態(tài)基本一致的幼苗，設(shè)置清水（CK）、拮抗菌、病原菌（NC）和拮抗菌+病原菌四個處理，每個處理設(shè)置5個重復(fù)，處理組各澆灌200 mL對應(yīng)菌發(fā)酵液，對照組澆灌等量無菌水。25 ℃光照16 h與黑暗8 h交替，其中菌株發(fā)酵液處理組只第一次用菌株發(fā)酵液澆灌，后期管理與對照組一樣，用無菌水澆灌。40 d后測定生長指標：測量幼苗植株株高（cm）、根長（cm）、地上部和根鮮重（g），45 ℃烘干2 d測定地上部和根干重（g）。

1.3.5 菌株鑒定將純化后的病原菌和拮抗菌菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，觀察記錄菌落特征。記錄菌落正面、背面顏色、菌落邊緣形狀、均勻度，菌落質(zhì)地，待平板中長出子實體后，用挑針挑取少許，制作臨時玻片，在光學顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。菌株由青島睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序，在GenBank上提交測序結(jié)果，登錄NCBI網(wǎng)站使用BLAST分析工具與已知同源性真菌菌株進行比較，構(gòu)建發(fā)育樹，找出最相似種屬，確定為該菌株的鑒定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 22軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，LSD法進行多重比較，判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際真菌的分離純化

共分離純化出53株根際真菌，根據(jù)真菌的外觀形態(tài)及微特征觀察發(fā)現(xiàn)，初步分為8屬，見表1。其中，曲霉屬（sp.）、青霉屬（sp.）、根霉屬（sp.）、鐮孢菌屬（sp.）為優(yōu)勢菌群。

表 1 不同屬丹參根際真菌

2.2 分離真菌致病性測定

采用離體葉片接種法，涂布真菌發(fā)酵液7 d后，接種的丹參離體葉片中有14組處理對丹參葉片存在致病性，見表2，能引起葉片褐化、腐爛，形成病斑，其中病斑相對面積在60%以上的根際真菌有2株，分別為RF3和RF37。病原菌RF3發(fā)酵液涂布丹參葉片后，7 d后，病斑完全覆蓋葉片表面且葉片明顯失黃。涂布病原菌RF37發(fā)酵液至第7 d，病斑迅速擴散顏色逐漸變深，葉片萎蔫且出現(xiàn)發(fā)霉癥狀（如圖1）。

表 2 不同根際真菌處理病斑相對面積

“-”表示無致病性

“-” Indicates non-pathogenicity

圖 1 致病性試驗

2.3 病原菌形態(tài)特征觀察

菌株RF3在PDA培養(yǎng)基28 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)5 d后，菌株生長較快，基本長滿培養(yǎng)皿，菌落白色，邊緣整齊，氣生菌絲較發(fā)達，菌落呈絨毛狀，不產(chǎn)色素；菌株RF37在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，邊緣整齊，菌絲發(fā)達初為白色，菌落呈絮狀，背面呈黃褐色，表面稀疏（如圖2）。其菌落形態(tài)特征、孢子形狀符合鐮孢菌屬特征描述。

圖2 病原菌菌落形態(tài)

2.4 病原菌分子鑒定結(jié)果

將獲得的RF3和RF37菌株分別與20株Fusarium參考菌株的ITS基因序列進行比對，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。Blast序列分析表明，RF3與腐皮鐮刀菌strain FJCE（登錄號KY013237.1）和腐皮鐮刀菌isolate CEL40（登錄號MN173137.1）的菌株節(jié)點處bootstrap值為97。菌株RF37與腐皮鐮刀菌XHL13041501 （登錄號KJ696540.1）和腐皮鐮刀菌ALAL-1（登錄號MW923790.1）菌株序列的同源性為99%（圖3）。

因此根據(jù)形態(tài)學和分子生物學分析，病原菌株RF3和RF37均為腐皮鐮刀菌（）的成員。

圖 3 菌株RF37和菌株RF3基于rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 菌株RF15對腐皮鐮刀菌的抑制作用

從丹參根際土壤中共分離出3株對腐皮鐮刀菌具有拮抗作用的真菌，其中菌株RF15的拮抗效果最好，能夠明顯抑制腐皮鐮刀菌菌落的生長，經(jīng)計算，菌株RF15對腐皮鐮刀菌的抑菌率達32.81±0.68%，表現(xiàn)出較強的抑制能力（見圖4）。

圖 4 菌株RF15對腐皮鐮刀菌的拮抗作用

A：腐皮鐮刀菌對照；B：菌株RF15與腐皮鐮刀菌的平板對峙

A：The control of；B：Inhibition of strain RF15 against.

2.6 菌株RF15發(fā)酵液對丹參幼苗生長的影響

2.6.1 菌株RF15發(fā)酵液對丹參幼苗長勢的影響菌株發(fā)酵液灌根處理40 d后，觀察丹參幼苗植株，從整株幼苗形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，不同處理對丹參幼苗地上部及須根數(shù)影響較為明顯。與清水對照（CK）相比，菌株RF15處理（NC）丹參幼苗可以促進株高和地上部生長，減少須根數(shù)；經(jīng)病原菌腐皮鐮刀菌處理（PT）后，抑制了丹參幼苗的生長，丹參幼苗地上部弱小，根系細小，表現(xiàn)出一定的抑制作用，這與致病性測定結(jié)果一致；而將拮抗菌與病原菌混合（NC+PT）施入后明顯改善（圖5）。

圖 5 不同菌發(fā)酵液對丹參幼苗長勢的影響

CK：清水對照；NC：菌株RF15；PT：病原菌；NC+PT：菌株RF15+病原菌

CK：The control of water；NC：The treatment of strain RF15；PT：The treatment of pathogen；NC+PT：The mixture of strain RF15 and pathogen

2.6.2 菌株RF15對丹參幼苗生物量的影響不同發(fā)酵液灌根處理對丹參幼苗根長和根鮮重的影響并不明顯，而株高、地上部鮮重和干重卻有明顯差，見表3。菌株RF15（NC）處理下的株高、地上部鮮重和干重最高，分別為CK的18.27%、58.98%、23.79%和19.43%，差異達到顯著水平，表明NC處理對丹參幼苗生長存在一定的促進效應(yīng)。施加病原菌發(fā)酵液（PT）40 d后，丹參幼苗生物量低于清水對照，抑制了丹參幼苗的生長，而將菌株RF15和病原菌混合處理后（NC+PT），丹參幼苗的生物量均與PT組差異顯著，對病原菌造成的抑制作用存在一定的改善效果。

表 3 不同菌發(fā)酵液對丹參幼苗生物量的影響

注：表中不同小寫字母表示不同處理間的差異（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the table indicate the difference between different treatments (<0.05).

2.7 菌株RF15分子生物學鑒定結(jié)果

通過對拮抗菌RF15的ITS保守序列擴增產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果，在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，搜索同源菌株序列，比對分析后選定20個參考菌株構(gòu)建進化樹，見圖6。Blast序列分析表明，菌株RF15與棘孢曲霉s srain M9（登錄號JQ670921.1）的同源性達到99%，可確定該菌株是一株棘孢曲霉（）。

圖 6 菌株RF15基于rDNA –ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 結(jié)論與討論

本實驗對山東沂源縣連作丹參根際土壤采樣，分離純化培養(yǎng)根際真菌，通過離體葉片進行致病性測定，結(jié)合形態(tài)特征、分子生物學鑒定，確定分離獲得的菌株RF3為腐皮鐮刀菌（）。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，連作地塊中丹參易發(fā)生土傳病害，如根腐病、枯萎病、葉斑病等。Yang J等報道層出鐮刀菌（）是河南省丹參種植主產(chǎn)區(qū)根腐病的主要病原菌[10]；在山東臨沂丹參主產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)一種苗枯病，Yi JL等研究發(fā)現(xiàn)該病害的病原菌為立枯絲核菌（AG1 – IA）[11]；丁遠杰等從自然感染丹參病毒病原植株上分離得到一株病毒分離物，經(jīng)生物學接種、電鏡觀察及序列分析后發(fā)現(xiàn)丹參病毒病的病原為黃瓜花葉病毒[12]。鐮刀菌屬是非常龐大的一個屬，是根腐病、枯萎病等多種土傳病害的病原真菌，分布廣泛，種類繁多，存在多個?；?，而且不同鐮刀菌種間差異微小。目前有關(guān)丹參連作地的病原菌分離鑒定的研究較少，研究熱點主要集中于因連作障礙引發(fā)的多種土傳病害，如根腐病是丹參連作地中的最重要病害，全國各主產(chǎn)區(qū)根腐病的病原物有所差異，山東和四川丹參種植基地的根腐病病原主要為腐皮鐮刀菌（），也有病原菌報道為木賊鐮刀菌（（Corda）Sacc.）?？菸∈堑⑸a(chǎn)的第二大病害，其主要病原菌為尖孢鐮刀菌Schlecht[13-15]。

目前對于緩解丹參連作障礙，防治土傳病害頻發(fā)等防治措施大多停留在農(nóng)業(yè)措施和化學防治階段。采取化學藥劑防治措施不但污染環(huán)境而且易造成抗藥性增加等問題，利用有效的生防拮抗菌株會解決許多由于不當?shù)幕瘜W防治帶來的環(huán)境問題，而且恰當使用更能夠省時省力[16]。本研究以連作丹參病原菌腐皮鐮刀菌為靶標進行高效拮抗菌的篩選，得到一株拮抗效果好的真菌菌株RF15，并進行了丹參幼苗盆栽促生試驗和分子生物學鑒定。結(jié)果顯示，該菌株為棘孢曲霉（），接種菌株RF15發(fā)酵液后對丹參幼苗具有一定的促生作用，同時對病原菌抑制幼苗生長存在一定的改善效果。棘孢曲霉作為生防菌已見報道，如胡小加等在油菜土壤中分離出的棘孢曲霉對油菜核盤菌菌核的致死率可達到83.3%，盆栽試驗表明，其對油菜菌核的萌發(fā)率可降低18.3%[17]。棘孢曲霉亦可用于防治蟲害，將棘孢曲霉分生孢子懸浮液接種到柑桔木虱成蟲體表后，發(fā)現(xiàn)隨著分生孢子濃度增加，成蟲死亡率會逐漸增加[18]。植物的生長離不開激素的調(diào)節(jié)作用，研究表明，棘孢曲霉真菌可通過促進植物產(chǎn)生生長素，從而影響植物的生長發(fā)育[19]。本課題在后期的實驗中也將開展相應(yīng)的丹參整株成長期盆栽及大田實驗，以進一步驗證添加菌株RF15后生防制劑對丹參病害的生防效果。

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Isolation of Rhizosphere Fungi fromBge and the Growth-promoting Effect of Antagonist RF15

CHE Xin-yu1, LIN Hang1*, TIAN Dan1*, HAN Ming-li1, XU Xi-wen1, WU Chen1, YANG Wen-qi1, PAN Guo-jun2**, XIAO Na1**

1.271018,2.271000,

In order to find out the main pathogenic bacteria types of continuous croppingand screen antagonistic bacteria, this study used the rhizosphere soil of continuous croppingfor two years as the material, separated and purified rhizosphere soil fungi by gradient dilution coating method, determined the pathogenicity by in vitro leaf inoculation method, and screened the biocontrol antagonistic bacteria with application value in combination with the flat-plate confrontation method. The results showed that(strain number RF 3) was the main soil-borne pathogenic fungus in continuous cropping ofBunge in Yiyuan County, Shandong Province, which showed obvious pathogenicity after smearingBunge leaves in vitro for 5 days, with the leaf lesion area of 66.196% and the pathogenicity grade of 4. Taking the pathogenic bacteria as indicator bacteria, three strains of fungi with strong antagonistic effect were screened out, and their bacteriostatic rates were all over 30%. Among them, rhizosphere fungus RF 15 had the best antagonistic effect, with an inhibition rate of 32.81%. Pot experiment showed that inoculation with antibiotic RF 15 significantly promoted the plant height and the growth of aerial parts ofseedlings, and reduced the number of fibrous roots. The aboveground fresh weight, plant height and dry weight ofseedlings treated with antagonistic bacterium RF 15 were significantly higher than those of the uninfected control, and it could improve the pathogenic bacteria that inhibited the growth ofseedlings. Therefore, rhizosphere fungus RF 15 has certain antagonism and good growth promoting effect onseedlings, and it is expected to be further researched and developed into a microbial fertilizer production strain.

Bge; fungi; antagonism; growth promoting effect

R282.71/S154.3

A

1000-2324(2022)06-0832-07

2022-03-04

2022-05-25

山東省自然科學基金面上基金(ZR2021MB087);國家自然科學基金青年基金(82004014);山東省中醫(yī)藥科技計劃(2021Q083)

車欣宇(1998-),女,碩士研究生,主要研究方向作物栽培與耕作學.E-mail:091303cxy@126.com

林杭(1998-),男,碩士研究生,主要研究方向藥用植物微生物資源與利用. E-mail:2710156647@qq.com

田丹(1998-),女,碩士研究生,主要研究方向作物栽培與耕作學. E-mail:1336525402@qq.com

Author for correspondence. E-mail:15650096678@126.com; xiaona198707@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.003