常允康,賈瑩瑩,王麗華,王涵,樊惠原,居潤成,徐娜

一株好氧反硝化芽孢桿菌的篩選鑒定及脫氮特性研究

常允康,賈瑩瑩,王麗華,王涵,樊惠原,居潤成,徐娜*

濟寧醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院, 山東 日照 276800

為獲得高效的生物脫氮細菌，從某黑臭河道水體中分離得到一株好氧反硝化細菌，通過對好氧反硝化和異養(yǎng)硝化兩個過程中的菌體生物量、總氮、硝酸鹽氮以及氨氮的濃度進行監(jiān)測，研究其脫氮特性。并且，進一步研究了碳源種類、碳氮比、溫度、轉(zhuǎn)速、鹽度等外界因素對其好氧反硝化性能的影響。結(jié)果表明：分離得到的好氧反硝化細菌經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬，記為sp. N-1。分別以硝酸鉀和硫酸銨作為初始唯一氮源，截至24 h，對硝酸鹽氮和氨氮的去除率分別為86.14%和86.20%，去除速率分別為1.79 mg/(L·h)和1.82 mg/(L·h)，證明了菌株sp. N-1在具有優(yōu)異的好氧反硝化能力的同時具備較強的異養(yǎng)硝化能力。另外，好氧反硝化過程的影響因素分析表明，當(dāng)以丁二酸鈉或者檸檬酸鈉為碳源，碳氮比在15～25之間，溫度在25～35 ℃之間，轉(zhuǎn)速在200～250 rpm之間，鹽度在1%以內(nèi)時，該菌株對硝酸鹽氮的去除率均能保持在70%以上，在廢水的生物脫氮處理中具備很好的應(yīng)用前景。

芽孢桿菌; 鑒定; 生物脫氮

我國生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《2020年中國生態(tài)環(huán)境統(tǒng)計年報》指出，2020年全國廢水中氨氮排放量為98.4萬t，總氮排放量為322.3萬t。自2016年以來，氨氮和總氮的排放情況一直是廢水污染物評價的重要指標(biāo)，且隨著國家對廢水中氮素的排放要求越來越嚴格，廢水的脫氮處理已成為近年研究熱點之一[1]。

生物脫氮因其經(jīng)濟效益高、脫氮效果好而備受關(guān)注[2]。傳統(tǒng)的生物脫氮要經(jīng)過好氧硝化和厭氧反硝化兩個過程，首先通過好氧硝化菌作用把氨氮轉(zhuǎn)變?yōu)橄醯?，繼而在厭氧環(huán)境下通過反硝化菌作用把硝氮轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨鈴亩_到氮素的去除[3]。由于硝化和反硝化兩個過程的生態(tài)位差較大，故需要在兩個獨立的反應(yīng)器中進行。但是，好氧反硝化微生物的發(fā)現(xiàn)，使得硝化和反硝化兩個過程可以一個反應(yīng)器中同步進行，大大減少了投資費用和運行成本。因此，好氧反硝化脫氮技術(shù)憑借其獨特的優(yōu)勢，自提出以來便受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。

本研究擬從黑臭河道水體中篩選高效的好氧反硝化細菌，并對其進行鑒定及脫氮特性的研究，為好氧反硝化細菌在廢水脫氮處理中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集樣品取自山東省日照市東港區(qū)某黑臭河道水體。

1.1.2 主要培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.00，酵母提取物5.00，氯化鈉10.00，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

好氧反硝化培養(yǎng)基（DM、g/L）：KNO30.36，Na2HPO4·12H2O 10.55，KH2PO41.50，MgSO4·7H2O 0.10，檸檬酸鈉2.70，0.2%（體積比）微量元素溶液。微量元素溶液：EDTA-Na230.00，ZnSO42.20，CaCl25.50，MnCl2·4H2O 5.06，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.00，CuSO4·5H2O 1.57，CoCl2·6H2O 1.61，pH調(diào)至7.0～7.5，121 ℃高溫滅菌20 min。

顯色培養(yǎng)基（GN、g/L）：MgSO4·7H2O 1.00，L-天冬酰胺1.00，KNO3l.00，檸檬酸鈉8.50，KH2PO41.00，CaCl2·6H2O 0.20，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05，0.1%（體積比）的1%（質(zhì)量比）的溴百里酚藍（BTB），調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。在液體顯色培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂制備成固體顯色培養(yǎng)基，121 ℃高溫滅菌20 min。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（NM、g/L）：(NH4)2SO40.24，檸檬酸鈉2.70，0.05%（體積比）微量元素溶液。微量元素溶液：NaCl 2.50，MgSO4·7H2O 2.50，K2HPO4·3H2O 6.50，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.04，pH調(diào)至7.0～7.5，121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 好氧反硝化細菌的篩選將采集的樣品以10%（體積比）的接種量接種至已滅菌的LB培養(yǎng)基后放至搖床30 ℃、200 rpm進行富集培養(yǎng)48 h后（第24 h補加10%體積的已滅菌的新鮮LB培養(yǎng)基），按照10%（體積比）的接種量接種至已滅菌的DM培養(yǎng)基中，每24 h更換10%體積的新滅菌的DM培養(yǎng)基，繼續(xù)搖床培養(yǎng)30 d。

取上述初篩樣品0.5 mL均勻涂布于固體GN顯色培養(yǎng)基中進行復(fù)篩，30 ℃培養(yǎng)，挑選能使培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色的單克隆，接種至液體GN顯色培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)進行驗證，將能使液體顯色培養(yǎng)基變藍的菌株接種至DM培養(yǎng)基中，30 ℃、200 rpm培養(yǎng)72 h后，測定硝酸鹽氮的濃度，選取脫氮效率最高的菌株作為后續(xù)研究的目標(biāo)菌株，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌株的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：觀察目標(biāo)菌株單菌落的外觀形態(tài)，并進行革蘭氏染色。

分子生物學(xué)鑒定：按照細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN, DP302）提供的方法提取目標(biāo)菌株的基因組DNA，利用細菌通用引物27F（5′-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1387R（5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′）對其16S rDNA進行擴增后（擴增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，然后以95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)28次，然后72 ℃終延伸7 min）送至金唯智公司測序。將測得序列提交至NCBI進行BLAST比對分析后，利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3脫氮特性研究將目標(biāo)菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后接種至DM培養(yǎng)基中，以研究其好氧反硝化過程的脫氮特性。具體方法如下：取20 mL對數(shù)期種子液（10%接種量）以5000 rpm離心5 min，用PBS緩沖液漂洗兩遍，再用DM培養(yǎng)基將菌體懸浮后接種至裝有200 mL DM培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、200 rpm培養(yǎng)。每8 h取樣，按照國家環(huán)境保護標(biāo)準中規(guī)定的方法測定總氮（TN, HJ 636-2012）、硝酸鹽氮（NO- 3-N, HJ/T 346-2007）和氨氮（NH+ 4-N, HJ 535-2009）的濃度。

另外，多數(shù)具有好氧反硝化能力的細菌同時具備異養(yǎng)硝化的能力，進而使得硝化和反硝化作用可以同步進行。故將菌株接種至以硫酸銨為初始唯一氮源，檸檬酸鈉為碳源的NM培養(yǎng)基中，驗證其是否能進行異養(yǎng)硝化作用，并研究異養(yǎng)硝化過程的脫氮特性。

1.2.4好氧反硝化性能影響因素分析按照1.2.3中的方法，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種接種至DM培養(yǎng)基中，默認培養(yǎng)條件：檸檬酸鈉作為碳源，碳氮比（C/N）15，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 rpm，不添加NaCl。按照表1中的變量設(shè)置，依次改變各個單因素環(huán)境因子，培養(yǎng)24 h后測定硝酸鹽氮的濃度，計算其去除效率，以探究外界因素對該菌株好氧反硝化性能的影響。

表 1 好氧反硝化性能影響因素

1.2.5統(tǒng)計分析利用SPSS 26.0進行單因素方差分析，組間比較采用Duncan’s檢驗法，<0.05代表統(tǒng)計學(xué)意義上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧反硝化細菌的分離鑒定

經(jīng)過初篩、復(fù)篩，結(jié)合不同菌株對硝酸鹽氮的降解效率，將1株反硝化性能最強的菌株作為后續(xù)研究的目標(biāo)菌株，標(biāo)記為N-1。由圖1可知，菌株N-1在光學(xué)顯微鏡下呈細桿狀，為革蘭氏陽性菌。LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為乳白色圓球狀，表面光滑，邊緣呈細微鋸齒狀。

圖 1 菌株N-1的革蘭氏染色及菌落形態(tài)

注：A為革蘭氏染色，B為菌落形態(tài)

Note: A is Gram staining result, B is colony morphology result

通過對其16S rDNA基因測序結(jié)果進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株N-1與芽孢桿菌屬的多個不同種的菌株相似度均達100%。結(jié)合其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以確定菌株N-1為芽孢桿菌屬，故將其命名為sp. N-1。利用MEGA7軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖 2 菌株N-1系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig 2 The phylogenetic tree of strain N-1

2.2 好氧反硝化過程的脫氮特性

利用硝酸鉀為初始唯一氮源，研究菌株sp. N-1的好氧反硝化脫氮特性。由圖3可知，菌株在接種后能迅速適應(yīng)環(huán)境，延滯期較短，在第8 h即進入對數(shù)生長期，截至24 h，菌株生長基本達到穩(wěn)定期，此時，硝酸鹽氮濃度顯著下降至6.91 mg/L，去除率達到86.14%，去除速率為1.79 mg/(L·h)。截至48 h，硝酸鹽氮濃度降至3.86 mg/L，去除率達到92.26%；總氮濃度降至11.35 mg/L，去除率達到77.36%（見圖4），表現(xiàn)出很好的好氧反硝化性能。

圖 3 好氧反硝化過程菌株的生長及氮素濃度

圖 4 好氧反硝化過程的脫氮效率

2.3 異養(yǎng)硝化過程的脫氮特性

利用硫酸銨為初始唯一氮源，檸檬酸鈉為碳源，研究菌株sp. N-1的異養(yǎng)硝化脫氮特性。由圖5可知，菌株能迅速適應(yīng)該體系，延滯期較短，截至24 h，菌株生長基本達到穩(wěn)定期，此時，氨氮濃度顯著下降至6.99 mg/L，去除率高達86.20%，去除速率為1.82 mg/(L·h)，表現(xiàn)出很好的異養(yǎng)硝化性能。由圖6可知，截至48 h，氨氮濃度降至6.63 mg/L，去除率達到86.92%；總氮濃度降至16.29 mg/L，去除率達到67.75%，表現(xiàn)出較好的脫氮效果。

圖 5 異養(yǎng)硝化過程菌株的生長及氮素濃度

圖 6 異養(yǎng)硝化過程的脫氮效率

2.4 好氧反硝化性能影響因素分析

2.4.1 碳源種類對好氧反硝化性能的影響碳源是影響菌株好氧反硝化性能的重要因素，對碳源的差異性利用可能意味著不同的脫氮機制[5]。由圖7-A可知，當(dāng)碳源為丁二酸鈉或者檸檬酸鈉時，菌株sp. N-1的好氧反硝化性能明顯優(yōu)于其它幾種碳源，對硝酸鹽氮的去除率分別為87.68%和86.33%，與楊婷[6]、高雅娟[7]等篩選的好氧反硝化細菌的碳源利用結(jié)果類似，說明丁二酸鈉和檸檬酸鈉更適合作為該菌株的碳源，用于好氧反硝化脫氮過程。

圖 7 不同因素對好氧反硝化性能的影響

2.4.2 碳氮比對好氧反硝化性能的影響由圖7-B所示，在一定范圍內(nèi)，菌株sp. N-1對硝酸鹽氮的去除率隨著碳氮比的提高而不斷增加，可能是由于較低的碳氮比不能滿足菌株快速生長對碳源的需求[8]。當(dāng)碳氮比為20時，對硝酸鹽氮的去除率最高，達到90.25%，表現(xiàn)出較強的好氧反硝化性能。當(dāng)碳氮比在15～25之間，菌株對硝酸鹽氮的去除率均在85%以上，說明該菌株在好氧反硝化過程中適合較高的碳氮比。但碳氮比并不是越高越好，過高的碳氮比同樣可能抑制菌株的生長[9,10]。

2.4.3 溫度對好氧反硝化性能的影響溫度是影響細菌好氧反硝化性能的重要因素之一，由圖7-C所示，溫度對菌株sp. N-1好氧反硝化性能的影響較大，可能由于低溫限制了菌株的生長和相關(guān)酶的活性[11,12]，從而導(dǎo)致了較低的脫氮效率。隨著溫度的升高，菌株的好氧反硝化性能不斷增加，當(dāng)溫度為35 ℃時，菌株對硝酸鹽氮的去除率達到88.44%。

2.4.4 轉(zhuǎn)速對好氧反硝化性能的影響轉(zhuǎn)速主要影響體系的溶氧水平，而溶氧水平是影響好氧細菌生長和代謝的關(guān)鍵因素[13]。通常來說，在一定范圍內(nèi)，隨著溶氧水平的提高，好氧反硝化細菌的脫氮性能會得到增強。如圖7-D所示，隨著轉(zhuǎn)速的不斷提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 rpm時，菌株sp. N-1對硝酸鹽氮的去除率升至最高，達到85.42%。但是，當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)提高到250 rpm時，菌株的好氧反硝化性能卻有所下降，對硝酸鹽氮的去除率降至82.67%，說明溶氧水平對該菌株的影響存在閾值，溶氧過高可能抑制了好氧反硝化相關(guān)基因的表達，從而降低了其對硝酸鹽氮的去除效率[14]。

2.4.5 鹽度對好氧反硝化性能的影響鹽度作為細菌生長的限制性因素，通常會抑制菌株的正常代謝和酶的活性，對好氧反硝化過程產(chǎn)生不利的影響[15]。由圖7-E可知，隨著鹽度的不斷增加，菌株sp. N-1對硝酸鹽氮的去除率在不斷下降。但是，當(dāng)鹽度為1%時，該菌株對硝酸鹽氮的去除率仍能達到75.37%，說明該菌株在一定的鹽度范圍內(nèi)，仍能保持較強的好氧反硝化性能，為其應(yīng)用的廣泛性奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

菌株sp. N-1的脫氮效率與已報道的其它芽孢桿菌相比，在好氧反硝化和異養(yǎng)硝化兩方面均具有明顯的優(yōu)勢[16]。另外，在好氧反硝化過程中，通過對氨氮的監(jiān)測數(shù)據(jù)可知，后期出現(xiàn)少量氨氮的積累（見圖3）。究其原因，可能在培養(yǎng)末期部分菌體自溶導(dǎo)致胞內(nèi)的氨氮被釋放出來；另外，一些衰亡的細胞中的有機氮也可能被轉(zhuǎn)化成氨氮，從而導(dǎo)致體系中的氨氮含量有所增加[17,18]。在異養(yǎng)硝化過程中，通過對硝酸鹽氮的監(jiān)測數(shù)據(jù)可知，整個過程沒有明顯的硝酸鹽氮的積累（見圖5），推測其原因，一是可能由于菌株具備較強的反硝化能力，能將硝化過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物迅速利用進行反硝化作用，故檢測不到硝酸鹽氮的明顯積累[3]；二是可能在氨單加氧酶（AMO）的作用下將氨氮氧化為羥胺（NH2OH）后又通過羥胺氧化酶（HAO）的作用將其轉(zhuǎn)化為N2O和N2等氣體，從而達到脫氮的效果[19]。

好氧反硝化過程的影響因素研究結(jié)果表明，當(dāng)以丁二酸鈉或者檸檬酸鈉為碳源，碳氮比在15～25之間，溫度在25～35 ℃之間，轉(zhuǎn)速在200～250 rpm之間，鹽度在1%以內(nèi)時，該菌株對硝酸鹽氮的去除率均能保持在70%以上（見圖7），表現(xiàn)出不錯的環(huán)境適應(yīng)性，為其在不同環(huán)境下的生物脫氮應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從黑臭河道水體篩選的好氧反硝化細菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定為芽孢桿菌屬，將其命名為sp. N-1。分別以硝酸鉀和硫酸銨作為初始唯一氮源，證明了菌株sp. N-1在具有優(yōu)異的好氧反硝化能力的同時具備較強的異養(yǎng)硝化能力。另外，sp. N-1在好氧反硝化過程中表現(xiàn)出不錯的環(huán)境適應(yīng)性，并且能耐受一定的鹽度，在廢水的生物脫氮處理中具備很好的應(yīng)用前景。

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Screening and Identification of an Aerobic DenitrificationStrain and Its Nitrogen Removal Characteristics

CHANG Yun-kang, JIA Ying-ying, WANG Li-hua, WANG Han, FAN Hui-yuan, JU Run-cheng, XU Na*

276800,

In order to obtain efficient bacteria for nitrogen removal, an aerobic denitrification bacteria was isolated from a black-odor river. The biomass and the concentrations of the total nitrogen, nitrate nitrogen and ammonia nitrogen during aerobic denitrification and heterotrophic nitrification processes were monitored to study its nitrogen removal characteristics. Moreover, the influence of external factors such as carbon source type, C/N ratio, temperature, rotate speed and salinity on the aerobic denitrification performance were further studied. The results showed that the aerobic denitrification bacteria was identified asstrain, and was recorded assp. N-1. With potassium nitrate and ammonium sulfate as the initial single nitrogen source, the removal efficiency of nitrate nitrogen and ammonia nitrogen was 86.14% and 86.20% under 24 hours, respectively, and the removal rate was 1.79 mg/(L·h) and 1.82 mg/(L·h), respectively, which showed thatsp. N-1 had excellent aerobic denitrification and heterotrophic nitrification performance. In addition, the analysis of factors which affecting the aerobic denitrification process showed that when sodium succinate or sodium citrate was used as carbon source, the ratio of C/N was between 15 and 25, the temperature was between 25 and 35 ℃, the rotate speed was between 200 and 250 rpm, and the salinity was within 1%, the nitrate nitrogen removal efficiency could still stay above 70%, which showed good application prospect in biological denitrification treatment of wastewater.

Aerobic denitrification; identification; bioremoval of nitrogen

Q939.9

A

1000-2324(2022)06-0819-06

2022-07-13

2022-07-28

濟寧醫(yī)學(xué)院教師科研扶持基金(JYFC2019KJ016);山東省中醫(yī)藥科技項目(Q-2022148);濟寧醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(cx2020104);國家自然科學(xué)基金(31700211);山東省自然科學(xué)基金(ZR2017BC081);作物生物學(xué)國家重點實驗室開放項目(2017KF08)

常允康(1987-),男,碩士,研究方向為生物資源與環(huán)境. E-mail:changyunkang@163.com

Author for correspondence. E-mail:xuna828@163.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.001