王 璐，黃新明，章 杰，彭 成

碳青霉烯類抗菌藥物通常用來治療多重耐藥腸桿菌目細(xì)菌(如產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶、AmpC酶等)造成的感染。但隨著該類藥物的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯腸桿菌目細(xì)菌逐漸增多。腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因是產(chǎn)生水解碳青霉烯類藥物的酶[1]，從而導(dǎo)致藥物失活。這些酶中最常見是Ambler分類中的A類酶(以KPC為主)和B類酶(又稱金屬酶，如NDM、IMP等)[2]。 這兩類酶不僅能夠水解碳青霉烯類藥物，引起治療失敗，同時(shí)還能夠編碼在轉(zhuǎn)座子和/或整合子上傳播給其他腸桿目細(xì)菌，引起流行爆發(fā)。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室迫切需要采取便捷、準(zhǔn)確的試驗(yàn)方法以了解腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥機(jī)制，從而及時(shí)采取相應(yīng)防治措施。本研究以 PCR 方法檢測(cè)耐藥基因結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估A類酶抑制劑及B類酶抑制劑用于碳青霉烯酶型別檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)作報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集六安市人民醫(yī)院2020-2021年臨床送檢標(biāo)本中，經(jīng)VITEK 2 Copmact儀鑒定為腸桿菌目并且初步判斷為耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的共227株菌株。剔除同一病人重復(fù)分離菌株。其中肺炎克雷伯菌179株，大腸埃希菌20株，陰溝腸桿菌14株，弗氏枸櫞酸桿菌4株，黏質(zhì)沙雷菌3株，植生拉烏爾菌2株，產(chǎn)氣腸桿菌2株，布氏枸櫞酸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌及潘氏變形桿菌各1株。儀器鑒定質(zhì)控菌株為霍氏腸桿菌ACTT 700323，藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，KPC陽性菌株為經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證菌株[3]，NDM、IMP、OXA-48陽性對(duì)照及非產(chǎn)碳青霉烯酶陰性對(duì)照肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706系浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀和革蘭陰性菌鑒定藥敏卡(GN和GN334)均購自法國梅里埃公司，PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司，PCR試劑購自日本Takara公司，引物交由生工生物工程有限公司合成。厄他培南、亞胺培南及美羅培南藥物紙片(10 μg)均購自英國OXOID公司。BP平板、MAC平板及MH平板購自上?？片敿喂?。乙二胺四乙酸鹽(EDTA)溶液購自上海生工公司，硼酸(PBA)購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定與藥敏復(fù)核試驗(yàn) 采用VITEK 2 Copmact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀與配套鑒定藥敏卡(GN和GN334)進(jìn)行鑒定，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)厄他培南、亞胺培南及美羅培南藥敏結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(CLSI-M100-30)進(jìn)行試驗(yàn)操作及折點(diǎn)判斷。

1.3.2 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)A類和B類碳青霉烯酶 依據(jù)CLSI文件中紙片擴(kuò)散法進(jìn)行試驗(yàn)。將血平板上過夜培養(yǎng)的菌落制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，均勻涂布于MH平板上，之后貼4片亞胺培南紙片。一片滴加EDTA溶液10 μL，一片紙片滴加PBA溶液10 μL，第3片同時(shí)滴加EDTA溶液和PBA溶液各10 μL，第4片不加任何溶液。35 ℃過夜孵育后量取紙片的抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：(1)滴加EDTA溶液的亞胺培南紙片與單藥紙片相比抑菌圈直徑之差≥5 mm，即該菌株產(chǎn)B類酶；(2)滴加PBA溶液的亞胺培南紙片與單藥紙片相比抑菌圈直徑之差≥5 mm ，即判斷為該菌株產(chǎn)A類酶；(3)如滴加EDTA或PBA的亞胺培南紙片與單藥紙片相比抑菌圈直徑相差均<5 mm，則判斷該菌株不產(chǎn)A類或B類酶；(4)如同時(shí)滴加EDTA和PBA的亞胺培南紙片與單藥紙片相比抑菌圈直徑相差≥5 mm，則判斷同時(shí)產(chǎn)A類和B類酶。

1.3.3 PCR試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶基因 采用煮沸法提取待測(cè)菌株的基因組DNA作為模板。擴(kuò)增基因包括：KPC、NDM、IMP、VIM及OXA-48。引物合成及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行(見表1)。部分陽性擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表1 碳青酶烯酶基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以 PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)A類酶和B類酶的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，分別與基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，計(jì)算Kappa值：Kappa 值>0.75，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好；Kappa 值在0.40～0.75，說明一致性一般；Kappa值<0.40，說明一致性較差。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRE菌株標(biāo)本及科室 分布 227株CRE菌株中，標(biāo)本來源分別為：痰液157株(69.2%)，尿液34株(15.0%)，血液13株(5.7%)，膿液9株(4.0%)，腹水、導(dǎo)管及穿刺液各3株(1.3%)，支氣管肺泡灌洗液、直腸拭子各2株(0.9%)，胸水1株(0.4%)。菌株來源科室分布：重癥監(jiān)護(hù)室88株(38.8%)，神經(jīng)外科28株(12.3%)，呼吸內(nèi)科18株(7.9%)，急診科15株(6.6%)，普外科11株(4.8%)，腎臟內(nèi)科10株(4.4%)，其余科室57株(25.2%)。

2.2 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 CRE對(duì)替加環(huán)素耐藥率低，為5.3%，對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明耐藥率分別為31.7%、52.4%。對(duì)其他抗菌藥物耐藥率均>80%(見表2)。

表2 CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率(n=227)

2.3 227株CRE碳青霉烯酶基因檢測(cè) 經(jīng) PCR 擴(kuò)增、測(cè)序后比對(duì)，產(chǎn)KPC 164株，產(chǎn)NDM 51株，產(chǎn)IMP 2株，產(chǎn)OXA-48 1株，同時(shí)產(chǎn)KPC和NDM 1株。8 株未檢出常見碳青霉烯酶基因。部分電泳結(jié)果見圖1～3。

2.4 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn) 單產(chǎn)A類酶菌株有167株，單產(chǎn)B類酶菌株有53株，1株同時(shí)產(chǎn)A類酶和B類酶。5株肺炎克雷伯菌和1株產(chǎn)氣腸桿菌未檢出，5株陰性肺炎克雷伯菌中，PCR結(jié)果顯示有4株未檢測(cè)到常見耐藥基因，1株產(chǎn)OXA-48酶；1株產(chǎn)氣腸桿菌未檢測(cè)出常見耐藥基因(見圖4)。碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)對(duì)于單獨(dú)產(chǎn) KPC 碳青霉烯酶的檢測(cè)，靈敏度為100.0%(164/164)，特異度為 95.2%(60/63)，陽性預(yù)測(cè)值為 98.2%(164/167)，陰性預(yù)測(cè)值為100.0%(60/60)，Kappa 值為 0.967(P<0.01)，兩種檢測(cè)方法之間一致性高。對(duì)于單獨(dú)產(chǎn) B 類碳青霉烯酶的檢測(cè)，靈敏度和特異度均為 100.0%，陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均為 100.0%，Kappa 值為 1.000(P<0.01)，兩種檢測(cè)方法之間一致性高(見表3～5)。

表3 兩種方法檢測(cè)單產(chǎn)A類碳青霉烯酶菌株結(jié)果比較(株)

表4 兩種方法檢測(cè)單產(chǎn)B類碳青霉烯酶菌株結(jié)果比較(株)

表5 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶性能評(píng)價(jià)

3 討論

我國臨床分離的腸桿菌目細(xì)菌以產(chǎn)KPC和NDM為主[5-6]，腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)KPC和NDM是導(dǎo)致臨床采用β-內(nèi)酰胺類藥物治療失敗的主要原因之一。一直以來，KPC酶和B類酶在全球各國獨(dú)立傳播流行，但有報(bào)道[2]稱發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶KPC酶和B類酶的肺炎克雷伯菌株[2]，二者同時(shí)存在可增強(qiáng)菌株對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的水解活性，擴(kuò)大菌株耐藥譜范圍，還可能共同在醫(yī)院或社區(qū)中傳播。同時(shí)，治療CRE感染的新型抗菌藥物對(duì)不同碳青霉烯酶型菌株的抗菌活性不同，治療效果不同，例如頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)產(chǎn)KPC酶和D類酶(OXA-48)菌株具有較好的抗菌活性[7]，但對(duì)產(chǎn)B類酶菌株無效，體外研究認(rèn)為對(duì)于后者，往往需要聯(lián)合應(yīng)用氨曲南[8]。因此快速準(zhǔn)確獲得菌株碳青霉烯酶型別對(duì)臨床治療、感染控制都是至關(guān)重要的。過去實(shí)驗(yàn)室通常采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，但成本高、操作復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員和設(shè)備。本研究采用新型碳青霉烯酶檢測(cè)技術(shù)，操作便捷，成本較低，對(duì)技術(shù)含量要求不高，結(jié)果易判讀，對(duì)于臨床治療和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，亞胺培南聯(lián)合PBA檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌單獨(dú)產(chǎn)KPC酶，與PCR方法相比，靈敏度可達(dá)到100.0%。有3株菌，PBA抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果為陽性，但未檢測(cè)到KPC酶，考慮菌株可能產(chǎn)生其他少見類型的A類酶，如GES、SIM等，此外有研究[9]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)AmpC酶合并膜孔蛋白缺失時(shí)，PBA抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果同樣可出現(xiàn)陽性。后續(xù)我們可以采取擴(kuò)增相應(yīng)基因或全基因組測(cè)序的方法加以驗(yàn)證。

對(duì)于單獨(dú)產(chǎn)B類酶的檢測(cè)，EDTA抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)靈敏度和特異度均為100%，PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，53株B類酶中，51株產(chǎn)NDM，2株產(chǎn)IMP，亞胺培南聯(lián)合EDTA均可以檢測(cè)出，與其他研究[10-11]結(jié)果相同。但采用EDTA檢測(cè)肺炎克雷伯菌產(chǎn)B類酶的特異性與吡啶二羧酸相比較低，考慮可能與本研究納入產(chǎn)B類酶菌株數(shù)量、種類有限相關(guān)，因此該結(jié)果有待進(jìn)步一驗(yàn)證。

同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同時(shí)產(chǎn)KPC和NDM的菌株，使用亞胺培南單獨(dú)聯(lián)合PBA或EDTA檢測(cè)結(jié)果均為陰性。而在紙片上同時(shí)滴加PBA及EDTA時(shí)，相較于亞胺培南紙片，抑菌圈有明顯擴(kuò)大，與其他研究者研究結(jié)果相同[12]。可能任何一種抑制劑單獨(dú)作用均不足以全部抑制KPC和NDM對(duì)亞胺培南的水解活性，只有兩種抑制劑同時(shí)存在情況下，才能夠完全抑制。但該方法無法檢出產(chǎn)OXA-48的菌株，有報(bào)道[12]稱可利用大腸埃希菌ACTT 25922、亞胺培南紙片、PBA及EDTA，采用的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作區(qū)分產(chǎn)OXA-48菌株。后續(xù)我們將繼續(xù)收集產(chǎn)OXA-48菌株并加以驗(yàn)證。

綜上所述，采用PBA和EDTA進(jìn)行碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易判讀、準(zhǔn)確性較高及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。