趙敏華，劉 吉，葛晨輝，徐晨曦，蔡曉鋒，王小麗

（上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

菠菜（Spinacia oleraceaL.）屬于莧科藜亞科菠菜屬植物［1］，是世界性重要葉用蔬菜，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.菠菜的生長(zhǎng)需要充足的氮素供應(yīng)，尤其是硝態(tài)氮，但過(guò)量硝態(tài)氮會(huì)導(dǎo)致菠菜硝酸鹽積累，影響品質(zhì).生產(chǎn)上通常適當(dāng)配施銨態(tài)氮以提高品質(zhì)和產(chǎn)量，如SCHORTEMEYER等［2］發(fā)現(xiàn)，氮肥組合中銨態(tài)氮肥比例的增加，可顯著降低硝酸鹽和亞硝酸鹽在菠菜體內(nèi)的累積，提高菠菜莖葉中的氨基酸總量，同時(shí)獲取最大的生物量.因此研究菠菜對(duì)銨態(tài)氮的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用的機(jī)制，對(duì)于合理配施銨態(tài)氮肥，提高菠菜生產(chǎn)效能和品質(zhì)有重要指導(dǎo)意義.

植物對(duì)銨態(tài)氮的吸收及體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)都依賴(lài)銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AMT）.植物銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族屬于AMT/MEP/Rh家族，主要由兩個(gè)亞家族AMT1和AMT2構(gòu)成［3］.為適應(yīng)土壤中銨態(tài)氮供應(yīng)濃度的變化，植物進(jìn)化發(fā)展出低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（LATS）和高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（HATS），以充分吸收利用環(huán)境中的高、低銨態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)［4-6］.由于土壤中銨態(tài)氮含量較硝態(tài)氮低，植物銨態(tài)氮的吸收主要是由HATS構(gòu)成.目前已經(jīng)從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物中鑒定到不同數(shù)目的AMT蛋白（表1），并對(duì)部分AMT功能開(kāi)展了研究.此外，AMT不僅參與根部銨態(tài)氮的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)，還參與地上部分銨態(tài)氮的運(yùn)輸和再分配、種子銨態(tài)氮的儲(chǔ)存，以及銨態(tài)氮由共生菌向宿主植物的運(yùn)輸和根部發(fā)育等生理過(guò)程［7］.菠菜AMT研究尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道.本文作者通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選鑒定菠菜AMT編碼基因，并研究其對(duì)不同氮素形態(tài)配比的響應(yīng)模式，初步解析菠菜AMT基因家族在氮素響應(yīng)中的功能.

表1 部分植物AMT1和AMT2家族成員數(shù)目表

1 材料與方法

1.1 材料處理

選取飽滿一致的Sp75菠菜種子，經(jīng)75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精消毒后，播種于吸滿蒸餾水的工字孔育苗海綿中，待長(zhǎng)出2片子葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗定植于10 L水培箱中.水培營(yíng)養(yǎng)液采用1/2 Hoagland-Arnon配方.水培至兩葉一心期開(kāi)始氮處理實(shí)驗(yàn).共設(shè)置7個(gè)氮處理，包括：①缺氮（不含氮）；②硝銨比7.0∶0.5（7.0 mmol·L-1NO3--N+0.5 mmol·L-1NH4+-N）；③硝銨比7.5∶0（7.5 mmol·L-1NO3--N）；④硝銨比0∶0.5（0.5 mmol·L-1NH4+-N）；⑤硝銨比0∶7.5（7.5 mmol·L-1NH4+-N）；⑥硝銨比0.25∶0（0.25 mmol·L-1NO3--N）；⑦正常1/2 Hoagland-Arnon配方處理，硝銨比為7.0∶0.5.處理②～⑦前，均先缺氮預(yù)處理2 d.每個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù).采用CaCl2，K2SO4，KH2PO4調(diào)節(jié)不同處理中Ca，K，P的濃度，使它們保持一致，其余營(yíng)養(yǎng)由MgSO4·7H2O，NaFeEDTA，及Amon微量元素配方提供.調(diào)節(jié)水培營(yíng)養(yǎng)液pH值為6.0±0.2.處理全程在人工氣候室中完成，溫度為20℃/18℃（光照/黑暗），光周期為10 h/14 h（光照/黑暗），濕度控制在68%左右.分別于氮素處理0，0.5，2，24，48 h后取樣，-80℃保存，用于氮素響應(yīng)表達(dá)譜分析.同時(shí)采集正常供氮（1/2 Hoagland-Arnon）培養(yǎng)1周的幼苗葉片、葉柄及根樣品，-80℃保存，用于組織表達(dá)譜分析.

1.2 菠菜AMT基因家族成員的鑒定

將擬南芥AMT蛋白序列在菠菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www.spinachbase.org）中進(jìn)行同源比對(duì)搜索，并根據(jù)菠菜基因組注釋結(jié)果，剔除重復(fù)序列后獲得菠菜AMT候選序列.利用NCBI CDD在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測(cè)AMT結(jié)構(gòu)域，存在完整AMT結(jié)構(gòu)域的，則認(rèn)定為菠菜AMT家族候選蛋白.利用ExPaSy（http：//web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)候選蛋白各項(xiàng)理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、脂溶系數(shù)等.利用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.hgc.jp/）和TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分別對(duì)候選蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè).

1.3 基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化分析

基因結(jié)構(gòu)使用TBtools工具進(jìn)行分析，并進(jìn)行可視化操作［23］.利用MEME Suite（http：//meme.sdsc.edu/meme/memeintro.html/）進(jìn)行蛋白質(zhì)保守基序（motif）分析，最大保守序列鑒定數(shù)目設(shè)置為10，TBtools工具進(jìn)行基序模式可視化.利用MEGA-X軟件，采用鄰接（NJ）法構(gòu)建菠菜AMT基因家族進(jìn)化樹(shù)及其與多物種之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)bootstrap設(shè)置為1 000，其余均為默認(rèn)參數(shù).同時(shí)選取基因家族起始密碼子上游2 000 bp啟動(dòng)子片段，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件分析，用TBtools工具可視化.

1.4 基因表達(dá)譜分析

采用Trizol法提取菠菜總核糖核酸（RNA），通過(guò)PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（complementary DNA）.使用Primer Premier 5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）引物設(shè)計(jì)（表2），Tm值控制在57～61℃.最后使用TaKaRa TB Green TM Premix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）試劑盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀器上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng).采用18s rRNA作為內(nèi)參，以2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，用Sigma Plot 7.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖.采用TBtools工具繪制基因表達(dá)量熱圖，數(shù)據(jù)作log2轉(zhuǎn)換后以行為單位均一化，采用Euclidean法聚類(lèi).

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜SoAMT基因家族成員鑒定

在菠菜Sp75基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（2018），Monoe-Viroflay基因組庫(kù)（2021）中共獲得同源性較高的候選蛋白序列6條，其中5個(gè)候選蛋白在兩個(gè)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中完全相同，只有SoAMT1A（Spo21031）僅在Sp75基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（2018）中被鑒定到（表3）.使用在線網(wǎng)站NCBI CCD-search進(jìn)行逐條驗(yàn)證，結(jié)果顯示：5個(gè)候選蛋白包含amt保守結(jié)構(gòu)域，1個(gè)候選蛋白包含AmtB結(jié)構(gòu)域.序列分析表明，6個(gè)SoAMT基因分布在4條染色體上（第1，4，5，6條染色體），編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)度在1 443～1 506 bp之間，編碼的6個(gè)AMT蛋白氨基酸數(shù)目為462～501個(gè)，其中SoAMT1B、SoAMT1D包含501個(gè)氨基酸；而SoAMT2氨基酸數(shù)目最少（480個(gè)）.候選蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)范圍分別為377.829～632.678 ku和5.59～7.64.SoAMT1A預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)最低（5.59），SoAMT1B預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)最高（7.64）；6個(gè)SoAMT蛋白的平均親水系數(shù)均為正值，表明它們均為疏水性蛋白.SoAMT蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示定位于質(zhì)膜上，且含有9～11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域.

表3 菠菜SoAMTs基因家族基因數(shù)據(jù)庫(kù)信息

2.2 AMT進(jìn)化樹(shù)、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)擬南芥（6個(gè)）、黃瓜（5個(gè)）、大豆（9個(gè)）、苜蓿（7個(gè)）、水稻（3個(gè)）、玉米（8個(gè)）、百脈根（5個(gè)）及菠菜（6個(gè)）共49個(gè)AMT蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果如圖1所示.49個(gè)AMT蛋白聚成兩類(lèi)：AMT1亞家族和AMT2亞家族.菠菜SoAMT2（Spo20483）與擬南芥、苜蓿、百脈根等分組到AMT2亞家族的分支上，其余5個(gè)菠菜AMT與其他物種均屬于AMT1亞家族分支.

圖1 菠菜與其他植物AMT進(jìn)化樹(shù)分析.

菠菜AMT家族基因編碼蛋白的序列分析表明，除SoAMT2（Spo20483）外，菠菜AMT基因具有類(lèi)似的編碼區(qū)和核苷酸長(zhǎng)度，如圖2（a）所示，但不同基因間，內(nèi)含子數(shù)差異較大，SoAMT1C（Spo24676），SoAMT1B（Spo24677）不含有內(nèi)含子，SoAMT2（Spo20483）含有2個(gè)內(nèi)含子，其余3個(gè)菠菜AMT基因含有1個(gè)內(nèi)含子.SoAMT2與其余5個(gè)SoAMT1蛋白保守基序有較大差異，在SoAMT1結(jié)構(gòu)域內(nèi)鑒定到10個(gè)Motif，而SoAMT2只 有4個(gè)Motif，如 圖2（b）所示.6個(gè)SoAMT蛋白均具有共同的Motif 6，如圖2（c）所 示，尤其是Motif 6中 的DFAGSGVVHLVGGIAGLWGSIIEGPR（SoAMT1亞家族）和DYSGGYVIHV SSGIAGFTAAYWVGPR（SoAMT2亞家族），與已報(bào)道的AMT保守基序D-［FYWS］-［AS］-G-［GSC］-x（2）-［IV］-x（3）-［SAG］（2）-x（2）-［SAG］-［LIVMF］-x（3）-［LIVMFYWA］（2）-x-［GK］-x-R［24］，以及D204FAGSGMVHMVGGIAGLWGAFIESPR229［25］一致.

圖2 菠菜SoAMT家族的（a）基因結(jié)構(gòu)、（b）保守基序、（c）Motif

3.3 SoAMT基因家族順式作用元件分析

SoAMT啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控元件分析發(fā)現(xiàn)，除了典型的核心啟動(dòng)子TATA-Box外，這些序列還具有光響應(yīng)、無(wú)氧響應(yīng)以及脅迫相關(guān)的順式元件，包括缺氧脅迫元件（ARE）、ABA響應(yīng)元件（ABA，ABRE）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（Auxin，TGA-element/AuxRE）、干旱誘導(dǎo)元件（Drought，MBS）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（MeJA，CGTCA-motif）、水楊酸響應(yīng)元件（SA，TCA-element）以及赤霉素響應(yīng)元件（GA，TATC-box）等（圖3）.不同成員順式作用元件數(shù)目和種類(lèi)存在差異，SoAMT1A（Spo21031）含有較多ABA響應(yīng)元件，SoAMT1B（Spo24677）不含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，而其余成員均有該元件.SoAMT2（Spo20483）含有的ARE響應(yīng)元件數(shù)量明顯多于SoAMT1亞家族成員.

圖3 SoAMTs順式作用元件分析

2.4 AMT基因的組織表達(dá)分析

SoAMT基因在菠菜不同組織部位中的表達(dá)有差異，如圖4所示：SoAMT1A（Spo21031），SoAMT1B（Spo24677），SoAMT1D（Spo05791）在地上部分的表達(dá)量明顯高于根的，而SoAMT1C（Spo24676）在根中表達(dá)量較高，SoAMT1E（Spo16971）在葉柄中表達(dá)量明顯低于葉片和根.SoAMT2（Spo20483）在根和柄中的表達(dá)量明顯高于葉片的.供試6個(gè)SoAMT基因中，SoAMT1C在葉片、柄及根中的表達(dá)量均顯著高于其他AMT基因.

圖4 SoAMT基因組織表達(dá)量分析.注：柱頭不同小寫(xiě)字母表示同一基因組織間差異顯著，下同

2.5 SoAMT基因響應(yīng)氮源供應(yīng)的表達(dá)分析

缺氮處理對(duì)不同SoAMT基因表達(dá)量影響不同（圖5）.除SoAMT1D（Spo05791）表達(dá)量受缺氮處理影響不顯著外，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其余4個(gè)SoAMT1表達(dá)模式基本呈上調(diào)趨勢(shì).SoAMT1E（Spo16971），SoAMT1C（Spo24676）及SoAMT1B（Spo24677）表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量增加，缺氮處理48 h時(shí)表達(dá)量最大，分別為對(duì)照的12.76，8.36，15.04倍，受長(zhǎng)期缺氮處理的誘導(dǎo)影響顯著.SoAMT1A（Spo21031）表達(dá)量在處理0.5 h時(shí)無(wú)顯著變化，處理2，24，48 h時(shí)顯著上調(diào)，平均為對(duì)照的4.46倍.

圖5 缺氮處理下SoAMT基因表達(dá)譜

與SoAMT1表達(dá)模式不同，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SoAMT2（Spo20483）表達(dá)量先增加后下降，處理24 h 時(shí)與對(duì)照組（7.5 mmol·L-1NO3--N+0.5 mmol·L-1NH4+-N）差異不大，48 h時(shí)甚至低于正常供氮對(duì)照組.

以缺氮處理為對(duì)照，考察SoAMT基因?qū)Σ煌@態(tài)氮濃度的響應(yīng)，結(jié)果如圖6～7所示，單獨(dú)供應(yīng)銨態(tài)氮時(shí)，5個(gè)SoAMT1表達(dá)量均在處理0.5～24 h后無(wú)顯著變化，48 h后表達(dá)量上調(diào)；其中SoAMT1A（Spo21031）和SoAMT1B（Spo24677）表達(dá)量在高濃度銨態(tài)氮（7.5 mmol·L-1）與低濃度銨態(tài)氮（0.5 mmol·L-1）處理下無(wú)顯著差異.不同的是，SoAMT1D（Spo05791）和SoAMT1C（Spo24676）表達(dá)量顯著受低銨態(tài)氮誘導(dǎo)，而SoAMT1E（Spo16971）表達(dá)量顯著受高銨態(tài)氮誘導(dǎo).單獨(dú)銨態(tài)氮供應(yīng)下，SoAMT2表達(dá)量變化趨勢(shì)與SoAMT1正好相反，其表達(dá)量受銨態(tài)氮抑制，供試時(shí)間內(nèi)表達(dá)量均低于缺氮對(duì)照組.

圖6 不同銨態(tài)氮濃度處理下菠菜根SoAMT基因表達(dá)譜.

實(shí)驗(yàn)同時(shí)比較了不同硝態(tài)氮濃度及銨硝配比對(duì)SoAMT基因表達(dá)量的影響（圖7～8），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)供應(yīng)硝態(tài)氮也能不同程度地誘導(dǎo)SoAMT1基因的表達(dá)，SoAMT1A（Spo21031）對(duì)高低硝態(tài)氮濃度響應(yīng)差異不顯著，處理48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值；SoAMT1D（Spo05791）和SoAMT1B（Spo24677）表達(dá)量分別在低硝態(tài)氮處理0.5 h和高硝態(tài)氮處理48 h時(shí)顯著上調(diào)，其余處理時(shí)間下變化不大.SoAMT1C（Spo24676）和SoAMT1E（Spo16971）在低硝態(tài)氮處理0.5，2，48 h后的表達(dá)量均顯著高于缺氮對(duì)照，且在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高.硝銨物質(zhì)的量濃度配比為7.0∶0.5時(shí)，不同SoAMT1基因表達(dá)模式不同，如SoAMT1B基因在硝銨混合處理48 h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大值，與其在高硝處理下的表達(dá)譜更相似；硝銨混合處理下的SoAMT1D的表達(dá)譜與低銨態(tài)氮處理相似，48 h達(dá)到峰值，而SoAMT1E的硝銨混合氮響應(yīng)表達(dá)譜與其在低硝態(tài)氮處理更相似，均在2 h和48 h有明顯的上調(diào).SoAMT2氮響應(yīng)表達(dá)模式與SoAMT1不同，除高硝態(tài)氮處理48 h后，其表達(dá)量顯著上調(diào)外，其余氮處理均抑制了SoAMT2的表達(dá).硝銨混合處理下，SoAMT2表達(dá)同樣受到抑制，低于缺氮對(duì)照組.

圖7 不同氮處理?xiàng)l件下SoAMT基因表達(dá)譜比較.

綜上，缺氮（除SoAMT1D外）、銨態(tài)氮及硝態(tài)氮供應(yīng)均能不同程度地提高5個(gè)SoAMT1基因的表達(dá)量，大部分基因在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值；銨態(tài)氮或硝態(tài)氮供應(yīng)對(duì)SoAMT1A（Spo21031）的表達(dá)的作用不受供氮濃度的影響；低氮（銨態(tài)氮或硝態(tài)氮）顯著誘導(dǎo)SoAMT1C（Spo24676）和SoAMT1D（Spo05791）的表達(dá)，而SoAMT1E（Spo16971）僅受高銨和低硝顯著誘導(dǎo)；高濃度硝態(tài)氮誘導(dǎo)SoAMT1B（Spo24677）表達(dá)，而銨態(tài)氮濃度對(duì)其影響差異不大.與SoAMT1相反，SoAMT2基因表達(dá)量?jī)H受短期缺氮和長(zhǎng)期高濃度硝態(tài)氮誘導(dǎo)，在銨態(tài)氮存在或低硝態(tài)氮濃度處理下，其表達(dá)量受抑制.

圖8 不同硝銨濃度處理下菠菜根SoAMT基因表達(dá)譜.

3 討論

本文作者在菠菜基因組數(shù)據(jù)中共鑒定得到6個(gè)AMT家族基因，其數(shù)量與已報(bào)道的作物，如擬南芥（6個(gè)）、番茄（4個(gè)）、菜苔（5個(gè)），黃瓜（6個(gè)）等植物AMT數(shù)目大致相近，說(shuō)明菠菜AMT家族基因不存在明顯的基因重復(fù)和縮減現(xiàn)象，AMT家族數(shù)目保守性較高.同源系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，SoAMT分屬AMT1和AMT2兩個(gè)亞家族，且AMT2成員只有1個(gè).與水稻、楊樹(shù)、大豆等作物具有較多AMT2成員相比，菠菜AMT2成員數(shù)量明顯少于AMT1，不同植物中AMT1和AMT2成員數(shù)目的不同可能與其氮素吸收偏好、真菌共生及生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，喜銨（水稻、楊樹(shù)）、固氮（大豆）等作物通常具有更多的AMT2［22，26］.

與其他物種（如玉米、擬南芥、水稻等）AMT蛋白相比，SoAMT蛋白在結(jié)構(gòu)上與其高度相似，具有與擬南芥、番茄等類(lèi)似的編碼區(qū)和核苷酸長(zhǎng)度，含有AMT蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)和保守基序，外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)也與其他許多植物物種的分析結(jié)果相類(lèi)似［4］，證明了AMT蛋白結(jié)構(gòu)和基因組成的保守性.順式作用元件分析顯示，SoAMT可能參與多個(gè)激素及逆境途徑的調(diào)控，其生物學(xué)功能可能不僅局限于銨態(tài)氮的吸收與運(yùn)轉(zhuǎn)，還參與逆境脅迫的響應(yīng)途徑等.

擬南芥AMT1亞家族主要存在于根部，而AMT2亞家族則廣泛分布于植物主要器官中［6］.菠菜SoAMT基因的組織表達(dá)譜具有特異性，除SoAMT1D在根中表達(dá)量很低外，其余在根和地上部分中均有較高表達(dá)，與其他植物的組織表達(dá)譜存在差異，可能與其獨(dú)特的生物學(xué)功能相關(guān).

已有研究表明，AMT轉(zhuǎn)錄水平受植物氮濃度及氮素形式的影響，在缺氮條件下大多數(shù)AMT基因的表達(dá)會(huì)受到缺氮誘導(dǎo)而大幅提高［9］，這與本實(shí)驗(yàn)中SoAMT基因受缺氮脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致.缺氮一周后恢復(fù)供氮，不同濃度的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮處理?xiàng)l件下各基因表達(dá)譜有差異.SoAMT1A在根、葉、柄中均有較高表達(dá)量，其根部表達(dá)量受缺氮誘導(dǎo)，但對(duì)銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度的變化響應(yīng)差異不明顯，與擬南芥、水稻等模式植物的AMT基因同源性較小，推測(cè)SoAMT1A可能是一個(gè)組成型銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或者不參與氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)，具體結(jié)論還有待進(jìn)一步研究證實(shí).

SoAMT1B和SoAMT1C序列同源性較高，均在根、葉、柄中具有較高的表達(dá)量，根中表達(dá)量均受缺氮和高濃度硝態(tài)氮的誘導(dǎo).不同的是，SoAMT1B對(duì)銨態(tài)氮濃度不敏感，在長(zhǎng)期高濃度和低濃度的銨態(tài)氮作用下均被誘導(dǎo)上調(diào)；而SoAMT1C受低濃度的銨態(tài)氮誘導(dǎo)，在煙草NtAMT1.3中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似氮響應(yīng)表達(dá)譜，氮饑餓和供應(yīng)NH4+、硝酸鹽的條件下，NtAMT1.3表達(dá)顯著上調(diào)，且NtAMT1.3過(guò)表達(dá)促進(jìn)了植株根對(duì)NH4+的吸收，及葉片氮素的積累，本文作者推測(cè)NtAMT1.3在煙草NH4+的獲取和利用中發(fā)揮著重要作用［27］.因此，SoAMT1B和SoAMT1C可能也具有類(lèi)似的銨態(tài)氮吸收運(yùn)轉(zhuǎn)功能，結(jié)合菠菜組織表達(dá)譜，SoAMT1B更可能參與菠菜地上部分銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是在硝態(tài)氮供應(yīng)充足條件下（其表達(dá)水平受高硝誘導(dǎo)），負(fù)責(zé)地上部分硝態(tài)氮還原產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)和分配；SoAMT1C在根組織中表達(dá)水平最高，更可能是一個(gè)根部的銨態(tài)氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，SoAMT1C與AtAMT1.2也具有較高的同源性.已知AtAMT1.2轉(zhuǎn)錄水平也受缺氮誘導(dǎo)，是一個(gè)高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)根質(zhì)外體中銨態(tài)氮向內(nèi)皮層細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［9］，推測(cè)SoAMT1C可能在菠菜根部銨態(tài)氮高親和吸收中發(fā)揮重要作用.更重要的是，供應(yīng)不同濃度的硝態(tài)氮以及硝銨比7.0∶0.5混施處理，也能上調(diào)SoAMT1C的表達(dá)量，但表達(dá)水平不如低銨態(tài)氮處理下高，進(jìn)一步說(shuō)明SoAMT1C可能在高親和銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮功能，并在一定程度上受硝態(tài)氮供應(yīng)的影響.SoAMT1C在硝銨互作中的功能值得進(jìn)一步深入研究.

與大部分SoAMT表達(dá)受缺氮誘導(dǎo)不同，SoAMT1D不受缺氮誘導(dǎo)，且根中表達(dá)量為6個(gè)SoAMT中最低的.盡管在進(jìn)化樹(shù)上看，SoAMT1D與AtAMT1.1，AtAMT1.3具有較高的同源性，但AtAMT1.1和AtAMT1.3均受缺氮誘導(dǎo)，是擬南芥高親和銨態(tài)氮吸收的主要貢獻(xiàn)者［9，28］.表達(dá)譜的差異說(shuō)明SoAMT1D與AtAMT1.1，AtAMT1.3在功能上差異很大，考慮到SoAMT1D可被低濃度銨態(tài)氮誘導(dǎo)，且在地上部分具有較高的表達(dá)水平，推測(cè)其負(fù)責(zé)地上部分銨態(tài)氮的高親和轉(zhuǎn)運(yùn).

SoAMT1E表達(dá)受缺氮和高濃度銨態(tài)氮誘導(dǎo)，這與水稻OsAMT1.1相似，OsAMT1.1受缺氮、供氮均誘導(dǎo)，高銨條件下表達(dá)量大于缺氮處理.已知OsAMT1.1是一個(gè)雙親和銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)銨態(tài)氮由根向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，過(guò)表達(dá)OsAMT1.1能提高地上部分銨態(tài)氮含量，和籽粒產(chǎn)量的增加［21，29-30］.同源進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，SoAMT1E與AtAMT1.4也具有較高的同源性.AtAMT1.4是擬南芥花粉中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［31］，在根、葉等組織器官中未見(jiàn)表達(dá)，SoAMT1E與AtAMT1.4的組織表達(dá)譜差異較大，不太可能具有類(lèi)似的生物學(xué)功能，更可能與OsAMT1.1相似.

SoAMT2是供試6個(gè)SoAMT中唯一受高濃度和低濃度銨態(tài)氮抑制的AMT成員，其表達(dá)譜與棉花GhAMT1.3和AtAMT2.1相似，均受缺氮誘導(dǎo)和較高銨態(tài)氮濃度（＞1 mmol·L-1NH4+）抑制［8，32］.功能實(shí)驗(yàn)證明，GhAMT1.3是一個(gè)高親和銨態(tài)氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在棉花銨態(tài)氮吸收和利用中起重要作用，而AtAMT2.1受較高銨態(tài)氮（1 mmol·L-1或10 mmol·L-1）抑制，卻是一個(gè)低親和銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.本研究中，SoAMT2的轉(zhuǎn)錄水平受低濃度（0.5 mmol·L-1）和高濃度（7.5 mmol·L-1）銨態(tài)氮的抑制，其在銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能未知，或許是一個(gè)雙親和蛋白，參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)銨態(tài)氮的動(dòng)態(tài)平衡.

由上可知，SoAMT基因表達(dá)水平不僅受外源銨態(tài)氮濃度的影響，部分SoAMT表達(dá)譜還受硝態(tài)氮濃度的影響，如SoAMT1C，SoAMT1D，SoAMT1E顯著受單一低硝態(tài)氮濃度的誘導(dǎo)，而SoAMT2表達(dá)量在長(zhǎng)期單一高濃度硝態(tài)氮處理下表現(xiàn)上調(diào).有關(guān)SoAMT受外源硝態(tài)氮濃度的影響，可能的解釋有：一方面，硝態(tài)氮不僅是植物氮素來(lái)源，還作為信號(hào)分子，調(diào)控植物氮響應(yīng)途徑，從而參與銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；另一方面，銨態(tài)氮是植物體內(nèi)硝態(tài)氮的還原產(chǎn)物，外源硝態(tài)氮的供應(yīng)必然影響植物體內(nèi)銨態(tài)氮庫(kù)的大?。?7，33］，從而影響相關(guān)基因的表達(dá).SoAMT的表達(dá)譜還與兩種氮素形式是否混合供氮有關(guān)，如SoAMT1D在低濃度銨態(tài)氮下的表達(dá)譜與硝銨混合處理相似，說(shuō)明低濃度銨態(tài)氮對(duì)SoAMT1D的誘導(dǎo)作用不受高濃度硝態(tài)氮的影響，高濃度硝態(tài)氮對(duì)SoAMT1B（Spo24677）表達(dá)量的誘導(dǎo)又與營(yíng)養(yǎng)液中是否添加銨態(tài)氮無(wú)關(guān)，相反，硝銨混合處理下SoAMT1C的表達(dá)譜與單一硝態(tài)氮或銨態(tài)氮差異很大，說(shuō)明SoAMT成員間在菠菜硝銨互作中的作用不同，值得更一步深入研究.

4 結(jié)論

本文作者從菠菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定到6個(gè)SoAMT基因家族蛋白，包括5個(gè)AMT1亞家族成員和1個(gè)AMT2亞家族成員.菠菜SoAMT與其他植物AMT蛋白結(jié)構(gòu)相似，高度保守，但在組織表達(dá)譜和氮響應(yīng)表達(dá)譜上與其他物種同源基因差異較大.根據(jù)其不同的氮響應(yīng)模式，初步推測(cè)了其在銨態(tài)氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能，可為后續(xù)進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ).