＊范紅革 岳彩欣 張鴻雁 孫雪 馮德日

（沈陽醫(yī)學(xué)院 遼寧 110034）

活性氧自由基（ROS）是體內(nèi)線粒體呼吸鏈傳遞電子過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，ROS在體內(nèi)的大量堆積會引起體內(nèi)組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和衰老。體內(nèi)存在著多種可以清除ROS的抗氧化物酶，其中谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）清除ROS的作用非常重要[1,2]。研究表明，體內(nèi)GPX活性的降低及減少與臨床上多項(xiàng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括克山病、各種心腦血管疾病及癌癥等[3]。但在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，天然的GPX具有來源有限、在體內(nèi)穩(wěn)定性差、不易被吸收等特點(diǎn)，這限制了其在臨床上的醫(yī)療應(yīng)用價值。因此，近年來越來越多的科研人員致力于GPX模擬物的人工合成研究，如Ebselen（PZ51），硒（碲）化環(huán)糊精，硒（碲）化GPX單克隆抗體酶等，其中Ebselen是研發(fā)最早的一種GPX模擬物，被稱為“小分子硒酶”，現(xiàn)已進(jìn)入實(shí)際的臨床應(yīng)用中[4,5]。

4-叔丁基杯[4]芳烴是繼環(huán)糊精和冠醚之后廣受矚目的第三代有機(jī)合成超分子，其是由4個苯酚單元通過亞甲基在酚羥基鄰位連接而成的環(huán)狀小分子聚合物[6,7]。在其分子結(jié)構(gòu)中，每個苯酚單元下端都含有1個活性羥基基團(tuán)，可以作為修飾活化的目標(biāo)靶點(diǎn)，進(jìn)行多種酶催化基團(tuán)的修飾改造。同時，4個苯酚單元在空間上連接成環(huán)狀，在其分子內(nèi)部形成一個類似于酶活性中心的疏水腔結(jié)構(gòu)，非常有利于其與各種酶催化底物的結(jié)合。近年來，科研人員通過以4-叔丁基杯[4]芳烴為修飾底物，將其改造為多種酶的人工模物[8]。

在本研究中，我們以4-叔丁基杯[4]芳烴為GPX模擬物的修飾底物，將GPX酶的關(guān)鍵催化基團(tuán)-金屬碲（Te）特異的修飾到其疏水腔結(jié)構(gòu)下緣苯酚單元的-OH基團(tuán)上，合成了一種新化合物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴，該模擬物具有顯著的GPX活性，合成方法如圖1所示。為了進(jìn)一步研究該模擬物的體外抗氧化效果，我們還建立了由H2O2誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞體外氧化損傷體系，對該模擬物的抗氧化活性進(jìn)行研究[9]。

圖1 碲代4-叔丁基杯[4]芳烴合成路線

1.實(shí)驗(yàn)方法

(1)試劑與儀器

對甲苯磺酰氯（p-TsCl）、4-叔丁基杯[4]芳烴、寒羊血購自上海國藥集團(tuán)有限公司；碲（Te）、谷胱甘肽（GSH）、輔酶（NADPH）、H2O2購于德國Sigma公司；其它試劑為國產(chǎn)分析。

Agilent 7890A-5975C型質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Bruker-300型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）TMS為內(nèi)標(biāo)，甲醇為溶劑；UV-120分光光度計（日本島津公司）；日本日立熒光分光光度計（日本島津公司）。

(2)模擬物的制備方法

①合成化合物2

將50mL二氯甲烷加入三口燒瓶中，然后分別加入3.0g 4-叔丁基杯[4]芳烴和1.8mL三乙胺。將反應(yīng)液放入0℃冰鹽浴中，30min內(nèi)滴加P-TsCl/乙腈溶液（3.8g/10mL）。然后將反應(yīng)液放入室溫條件下，攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，將大部分溶劑從反應(yīng)液中蒸出，再分別加入1M稀鹽酸和50mL氯仿，繼續(xù)室溫攪拌15min。反應(yīng)液有機(jī)相用NaHCO3萃取三次，調(diào)有機(jī)相pH值至中性，經(jīng)無水硫酸鎂干燥、過濾。有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出大部分氯仿，再加入甲醇，有白色沉淀析出，沉淀經(jīng)抽濾、甲醇重結(jié)晶，最終得到3.45g白色固體，產(chǎn)率為81%，mp176.0～177.4℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ:7.75(bs，2H，OH)，7.08(s，4H，ArH)，6.79(bs，8H，ArH)，6.53(s，4H，ArH)，4.26(d，4H，ArCH2Ar)，3.12(d，4H，ArCH2Ar)，1.43(s，6H，ArCH3)，1.29［s，18H，C(CH3)3］，0.97［s，18H，C(CH3)3］；ESI-MS，m/z:956.32[M+HI]+。

②NaHTe的制備

NaHTe的制備方法，參考文獻(xiàn)[5]。

③合成化合物3

將DMF/H2O（體積比為1:1）加入到三口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下分別加入100mg化合物2和4mL NaHTe，60℃攪拌反應(yīng)24h。二氯甲烷萃取反應(yīng)液3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥、過濾，有機(jī)相減壓蒸干，得黃色油狀物67mg。產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)硅膠柱層析分離、純化，洗脫液為石油醚/乙酸乙酯（V:V=5:1），最終得淡黃色固體52mg，產(chǎn)率63%，mp157.2～158.5℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ:7.73(bs，2H，OH)，7.18(s，4H，ArH)，6.58(s，4H，ArH)，4.06(d，4H，ArCH2Ar)，3.33(d，4H，ArCH2Ar)，1.18［s，18H，C(CH3)3］，0.86［s，18H，C(CH3)3］；ESI-MS，m/z:870.31[M+HI]+。

(3)模擬物GPX活力測定

我們對模擬物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的GPX活性進(jìn)行測定，具體測定方法見文獻(xiàn)[2]。

(4)模擬物體外抗血紅細(xì)胞氧化損傷活性測定

①由H2O2誘導(dǎo)的體外血紅細(xì)胞氧化損傷評價體系的建立

系統(tǒng)Ⅰ：1ml紅細(xì)胞懸液；

系統(tǒng)Ⅱ：1ml紅細(xì)胞懸液加入終濃度為10mM的H2O2；

系統(tǒng)Ⅲ：系統(tǒng)Ⅱ中加入終濃度為0.02μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烴和0.05mM的GSH；

系統(tǒng)Ⅳ：系統(tǒng)Ⅱ中加入終濃度為0.05μM的碲代4-叔丁基杯[4]芳烴和0.05mM的GSH；

系統(tǒng)Ⅴ：系統(tǒng)Ⅱ中加入終濃度為0.1μM的碲代4-叔丁基杯[4]芳烴和0.05mM的GSH。

其中系統(tǒng)Ⅰ為空白組；系統(tǒng)Ⅱ?yàn)閾p傷組；系統(tǒng)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別為加入不同濃度碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的保護(hù)組。

②損傷血紅細(xì)胞溶血度的測定

系統(tǒng)Ⅰ～Ⅴ于37℃溫浴1h，1500rpm離心5min后，取上清液，測各系統(tǒng)溶液540nm下的光吸收值OD540，測定血紅蛋白的含量。

③丙二醛生成量的測定

系統(tǒng)Ⅰ～Ⅴ于37℃溫浴1h，1500rpm離心后取上清液1.0ml，加入0.5ml硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴30min，冷卻后1500rpm離心5min，測各系統(tǒng)溶液532nm下的光吸收值OD532，測定丙二醛的生成量。

④脂褐質(zhì)生成量的測定

系統(tǒng)Ⅰ～Ⅴ于37℃溫浴1h，加入五倍低滲PBS中，4℃下放置30min，使之完全溶血，16000rpm離心30min后去上清，洗滌沉淀三次。得到乳白色的影膜（發(fā)暗）。用1:2的甲醇-氯仿溶液抽提血影膜，有機(jī)相用熒光分光光度計于300～400nm范圍內(nèi)掃描最大激發(fā)波長，然后以其最大激發(fā)波長在400～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定。

2.結(jié)果和討論

(1)模擬物的GPX活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碲代4-叔丁基杯[4]芳烴的天然GPX活力達(dá)到了321.16U/μmol。同時，我們還將該模擬物的GPX活性與其他幾種以報道的GPX模擬物活性[10]進(jìn)行了比較，結(jié)果如表1所示。

表1 不同GPX模擬物的酶活性比較

(2)模擬物抗血紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

①模擬物可以降低血紅細(xì)胞的溶血度

以H2O2誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞損傷組溶血度為100%，其它各保護(hù)組及空白組的溶血度為保護(hù)組及空白組的OD540與前者OD540的百分比。從表2可以看出，不同濃度的碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對于由H2O2誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象都有一定的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用隨著模擬物濃度的升高而越來越顯著。其中0.1μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烴保護(hù)組的紅細(xì)胞溶血保護(hù)度已經(jīng)接近空白組紅細(xì)胞發(fā)生自溶血現(xiàn)象的溶血保護(hù)度。

表2 碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對由H2O2誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞溶血保護(hù)作用

②模擬物可以抑制損傷血紅細(xì)胞中丙二醛的生成

H2O2誘導(dǎo)血紅細(xì)胞氧化損傷后，血紅細(xì)胞內(nèi)大量的脂肪酸等物質(zhì)會發(fā)生顯著的脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，該過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物是丙二醛（MDA），MDA在細(xì)胞中的生成量可以表明血紅細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度。圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在由H2O2誘導(dǎo)血紅細(xì)胞損傷組中，其MDA的生成量會顯著增加，說明紅細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象嚴(yán)重。而在加入模擬物碲代4-叔丁基杯[4]芳烴后的保護(hù)組中，MDA的生成量都有一定程度的降低，且隨著模擬物濃度的提高，則保護(hù)組中MDA生成量會越來越少。0.1μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烴保護(hù)組中MDA生成量僅為損傷組的36.2%。結(jié)果表明碲代4-叔丁基杯[4]芳烴可以有效的抑制損傷血紅細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象的發(fā)生。

圖2 不同濃度碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對MDA生成抑制作用的比較

③模擬物可以抑制損傷血紅細(xì)胞中脂褐質(zhì)的生成

損傷血紅細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物丙二醛MDA可以進(jìn)一步與游離氨基生成熒光性的Schiff堿分子-脂褐質(zhì)，其在300～400nm光激發(fā)條件下，在400～500nm可以產(chǎn)生熒光。因而我們通過測定損傷血紅細(xì)胞過氧化反應(yīng)產(chǎn)物中脂褐質(zhì)的熒光強(qiáng)度來進(jìn)一步評價碲代4-叔丁基杯[4]芳烴體外抗氧化活性。圖3表示以393nm為激發(fā)波長，在454nm條件下測定的各組熒光強(qiáng)度評價結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本上與損傷血紅細(xì)胞中MDA生成量評價結(jié)果相吻合，加入模擬物碲代4-叔丁基杯[4]芳烴后的保護(hù)組可以明顯的抑制血紅細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象的發(fā)生，且抑制效果隨模擬物濃度的增加而逐漸加強(qiáng)。

圖3 不同濃度碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對脂褐質(zhì)生成抑制作用的比較

3.總結(jié)

我們將GPX酶關(guān)鍵催化基團(tuán)-金屬碲（-Te）引入到底物4-叔丁基杯[4]芳烴結(jié)構(gòu)中苯酚單元的-OH基團(tuán)上，合成了一種新的GPX模擬物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烴。其天然GPX活性可達(dá)321.16U/μmol，雖然該模擬物的GPX活性與天然GPX酶的活性相比仍存在一定差距，但相比于幾種已報道的GPX模擬物來說，該模擬物已經(jīng)表現(xiàn)出了更顯著的抗氧化活性。同時，我們建立了由H2O2誘導(dǎo)的體外血紅細(xì)胞氧化損傷體系，對該模擬物的體外抗氧化活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模擬物碲代4-叔丁基杯[4]芳烴對于由H2O2誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞氧化損傷現(xiàn)象具有明顯的抑制作用。其能夠有效的降低血紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象，同時還可以明顯抑制損傷血紅細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA及脂褐質(zhì)的累積。