廖靜靜

（長江師范學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100）

基因工程作為生物技術(shù)中發(fā)展速度最快、創(chuàng)新成果最多、應(yīng)用前景最廣的一門核心技術(shù)，是當今生命科學(xué)領(lǐng)域中最具生命力、最引人注目的學(xué)科之一[1]。該學(xué)科以分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)，以改造生物遺傳性狀為最終目標，是高等教育階段生物專業(yè)集理論與實踐為一體的綜合性必修科目。然而，目前基因工程理論課程在教學(xué)過程中仍存在較多問題，主要體現(xiàn)在以下兩個方面：（1）隨著理論和技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生出許多新原理和新技術(shù)，而教材的更新速度較慢，不能滿足該課程貼近科技前沿教學(xué)的需求；（2）基因工程技術(shù)和原理的理論教學(xué)復(fù)雜度高，知識點分散，按教材章節(jié)教學(xué)往往枯燥乏味，難以激起學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，使得學(xué)生對該門課程的學(xué)習(xí)重視度不高，且不能在科研訓(xùn)練和畢業(yè)論文中有效運用[2]。針對這兩個問題，積極推進案例教學(xué)有望改善教學(xué)現(xiàn)狀，提高教學(xué)成效，提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，并增強學(xué)生解決復(fù)雜問題的意識。

案例教學(xué)即根據(jù)教學(xué)目的要求，對典型案例進行詳細分析、思考、討論等，分析案例中體現(xiàn)的事件原因、待解決的關(guān)鍵問題、解決方案的設(shè)計及驗證等[3]。通過案例教學(xué)，能使學(xué)生形成感性和理性認識，是高效轉(zhuǎn)化理論知識的手段之一。在基因工程理論教學(xué)中，根據(jù)不同模塊教學(xué)內(nèi)容，即大腸桿菌基因工程、酵母菌基因工程、植物基因工程和動物基因工程，選擇從難到易、從傳統(tǒng)到現(xiàn)代的典型案例，詳細分析案例的背景、待解決的關(guān)鍵問題、解決方案的設(shè)計及驗證等，讓學(xué)生在案例學(xué)習(xí)中回顧和應(yīng)用所學(xué)理論知識，開拓思維。

案例教學(xué)具有生動具體、直觀易學(xué)的特征，易激起學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，激發(fā)學(xué)生思考，并將深奧難懂的理論知識運用到實際，使理論與實際聯(lián)系更緊密，提高學(xué)生學(xué)習(xí)的成就感[3]。最重要的是，每一個案例都是一個完整的從發(fā)現(xiàn)問題、分析問題到解決問題的閉環(huán)，能培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維、邏輯思考等學(xué)術(shù)習(xí)慣。因此，本文以轉(zhuǎn)基因植物為例，探索基因工程理論的案例教學(xué)實際。

1 轉(zhuǎn)基因植物及案例資源

基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物不僅緩解了人口持續(xù)增長和耕地面積持續(xù)減少等引起的糧食安全問題，還減少了化肥農(nóng)藥的施用，保護了生物多樣性，為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展作出了貢獻。此外，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使一些園林植物定向獲得不同花色、葉色和株型等新性狀，增強觀賞性，也豐富了人們的精神生活。第一例轉(zhuǎn)基因植物是1983年的轉(zhuǎn)基因煙草，隨后轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展，截至2017年，全球已有近30種轉(zhuǎn)基因植物，近500個轉(zhuǎn)基因植物品種/品系被批準商業(yè)化種植，包括27個轉(zhuǎn)基因作物和3個花卉，為基因工程轉(zhuǎn)基因植物的案例挖掘提供了豐富的資源[1]。本文選擇3個轉(zhuǎn)基因植物的案例進行教學(xué)探討，這3個案例難易程度不同，側(cè)重的技術(shù)手段也有一定的差別，能在一定程度上拓展學(xué)生思維，提高學(xué)生的科研素養(yǎng)，并緊跟國際研究前沿，激發(fā)學(xué)生興趣。

1.1 羥基脂肪酸積累（擬南芥）

該案例為2006年發(fā)表于《The Plant Journal》的期刊論文[4]，雖然發(fā)文較早，但其系統(tǒng)和詳細的研究思路至今都值得相關(guān)研究人員借鑒和應(yīng)用，有助于培養(yǎng)學(xué)生嚴謹?shù)目蒲兴季S，形成成熟適用的研究模式。該文利用基因工程技術(shù)改造擬南芥FAH12突變體，旨在獲得羥基脂肪酸含量更高的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。其研究是基于工業(yè)脂肪酸需求的增加，而單一基因的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的種子中所需脂肪酸無法滿足工業(yè)需求，在這一矛盾背景下，深入挖掘能顯著促進油籽中羥基脂肪酸積累的相關(guān)基因。為實現(xiàn)高通量、快速的篩選，本文以發(fā)育中的蓖麻種子為材料，構(gòu)建全長cDNA文庫；將該文庫與入門載體進行連接克隆，再通過同源重組的方式與雙元載體進行連接；cDNA文庫轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，利用鳥槍法轉(zhuǎn)化擬南芥植株；最終通過觀察熒光大量篩選轉(zhuǎn)基因植株，同時利用PCR擴增技術(shù)對轉(zhuǎn)基因植株進行分子檢測，采用氣相色譜技術(shù)對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中羥基脂肪酸的含量進行定量分析；在完成這一篩選后，對獲得的能顯著促進擬南芥種子羥基脂肪酸積累的cDNA，進一步進行再轉(zhuǎn)化功能驗證（見圖1）。

圖1 高通量篩選促進轉(zhuǎn)基因擬南芥種子羥基脂肪酸積累的蓖麻基因

（1）在介紹這一案例時，首先提出該研究的背景是工業(yè)生產(chǎn)的需求，即符合“一切從實際出發(fā)”的原則，鼓勵學(xué)生從生活、科研和學(xué)習(xí)中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵問題。（2）該案例將蓖麻種子的cDNA文庫轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)FAH12基因的擬南芥，說明在當時，科學(xué)家已經(jīng)明確羥基脂肪酸的合成受FAH12編碼產(chǎn)物的催化，而待解決的科學(xué)問題是“哪些基因能與FAH12一起促進羥基脂肪酸的積累”。因此，在提出問題之后，需要搜集、閱讀和整理相關(guān)的研究基礎(chǔ)和最新的研究進展，有依據(jù)地提出研究方案。由此，提醒學(xué)生注意基礎(chǔ)理論知識的掌握和思考，一切實施的基礎(chǔ)都基于扎實的理論依據(jù)。（3）該案例在載體構(gòu)建、cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選過程中，都采用多種技術(shù)手段從不同的角度去證明同一個問題，且最終獲得轉(zhuǎn)基因植株后再一次對cDNA進行克隆和再轉(zhuǎn)化，以進一步驗證基因功能。這些操作，則是提醒學(xué)生，科學(xué)研究需要不斷的驗證，從不同水平（組織水平、細胞水平、代謝水平和分子水平等）、不同方面對研究結(jié)果進行驗證，才能得到最終的結(jié)論，未經(jīng)驗證的試驗結(jié)果經(jīng)不起科學(xué)的深究。重點提醒學(xué)生在參與科研項目和進行畢業(yè)論文試驗時，也應(yīng)對自己的試驗結(jié)果盡可能進行多方面驗證，保證試驗結(jié)果的準確性和科學(xué)性。（4）在案例講解過程中，除介紹作者的研究思路外，對其中涉及的主要技術(shù)進行簡單的回顧，并結(jié)合該案例的操作方式進行介紹。

1.2 熒光蛋白的表達（矮牽牛）

該案例為2018年發(fā)表于《Scientific Reports》的期刊論文[5]。該案例的特色是在觀賞植物中應(yīng)用熒光蛋白，提高園林植物的觀賞性，同時該技術(shù)也能用于基礎(chǔ)研究。為進一步拓寬學(xué)生視野，激發(fā)學(xué)生的想象力，打破常規(guī)的增產(chǎn)提質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物策略，轉(zhuǎn)而向提高植物觀賞性方面傾斜，讓學(xué)生感受科技給生活帶來的巨大改變。在電影《阿凡達》中，潘多拉星球上的植物都帶有熒光，呈現(xiàn)豐富多彩的顏色，給人夢幻浪漫的感覺。該文通過轉(zhuǎn)錄終止子和增強子的新組合，在矮牽牛中表達eYGFPuv基因，使該基因的激發(fā)光和發(fā)射光幾乎不重疊，在不使用發(fā)射濾光片的情況下，使轉(zhuǎn)基因植物呈現(xiàn)肉眼可見的亮綠色熒光（見圖2）。

圖2 利用一種新的強效熒光蛋白轉(zhuǎn)基因培育亮綠色熒光矮牽牛植株

（1）在介紹該案例時，強調(diào)目的基因（eYGFPuv）的獲取，利用另一篇文獻[6]說明該基因是CpYGFP的突變衍生物，科學(xué)家通過篩選不同熒光蛋白基因獲得發(fā)射光譜和激發(fā)光譜幾乎不重疊的eYGFPuv基因。提醒學(xué)生，目的基因除來源于已有現(xiàn)成基因外，也能通過突變或改造現(xiàn)有基因獲得，拓寬目的基因的獲取途徑。（2）此外，科學(xué)家還通過篩選轉(zhuǎn)錄終止子和增強子的不同組合來增強目的基因的表達。因此，掌握真核表達調(diào)控機制是該文作者探索增強目的基因表達的理論依據(jù)，強調(diào)理論基礎(chǔ)對實踐操作的重要性。（3）這一案例也遵循了從不同角度和方面驗證同一問題的原則，通過采用多種技術(shù)手段明確篩選出的轉(zhuǎn)基因植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。（4）最后，通過該案例介紹，讓學(xué)生明確，通過基因工程手段開發(fā)具有不同花色、形態(tài)或氣味等的觀賞植物也具有重要意義。

1.3 葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)+CRISPR-Cas9技術(shù)（擬南芥）

該案例為2019年發(fā)表于《Nature Plants》的期刊論文[7]。與傳統(tǒng)的基因工程案例不同，該案例描述的是葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合CRISPR-Cas9技術(shù)提高葉綠體轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選并獲得高育性的轉(zhuǎn)基因植株。這一案例復(fù)雜度更高，但其中涉及的相關(guān)技術(shù)能代表當前科學(xué)研究的前沿主流技術(shù)。選擇葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)而非傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)基因技術(shù)，一方面打破學(xué)生的常規(guī)思維——只有核轉(zhuǎn)基因才屬于基因工程的范疇，讓學(xué)生能放開思維思考其他轉(zhuǎn)基因的可能性；另一方面，葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為新興熱點，能進一步激發(fā)學(xué)生興趣，為他們今后的學(xué)習(xí)和研究開拓思路。而CRISPR-Cas9作為基因編輯技術(shù)的典型，也是目前基因工程理論課程必須介紹的重要內(nèi)容之一。在該案例中，科學(xué)家通過CRISPR-Cas9技術(shù)定點突變擬南芥核上ACC2基因，該基因的突變使得植株對篩選抗生素敏感，從而提高篩選率。然后，構(gòu)建含抗生素抗性基因和熒光蛋白基因的重組載體，通過同源重組的方式實現(xiàn)葉綠體基因組轉(zhuǎn)化。在選擇受體細胞時，由于擬南芥葉為多倍體，易導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的不育性問題，因此選擇擬南芥根組織細胞作為受體細胞。由此，同時解決了轉(zhuǎn)葉綠體基因組擬南芥植株的篩選問題和育性問題（見圖3）。

圖3 可育轉(zhuǎn)質(zhì)體擬南芥植株的高效繁殖

（1）在介紹該案例時，重點強調(diào)該案例是典型的非核轉(zhuǎn)基因案例。葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過了約25年的發(fā)展，但由于該技術(shù)面臨的諸多困境和挑戰(zhàn)，其應(yīng)用局限性遠遠大于核轉(zhuǎn)基因技術(shù)，但該技術(shù)在基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)方面都具有極高的價值。（2）盡管葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)和核轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造的對象不同，但基因的操作流程和使用的技術(shù)方法等具有一致性。提醒學(xué)生注意活學(xué)活用，舉一反三。（3）在該案例中，科學(xué)家首先通過CRISPR-Cas9技術(shù)對擬南芥的核基因進行改造，通過讓學(xué)生思考并回答為什么沒有選擇經(jīng)典的基因工程操作來敲除或敲低ACC2基因等問題激發(fā)學(xué)生的思考，在解答時則進一步強調(diào)基因編輯技術(shù)與經(jīng)典基因工程技術(shù)相比所具有的優(yōu)勢。（4）作為一篇高水平的研究論文，該案例充分體現(xiàn)了科學(xué)家扎實的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用實踐能力，進一步向?qū)W生強調(diào)理論基礎(chǔ)的重要性和實踐操作的科學(xué)性、嚴謹性和合理性等。提醒學(xué)生只有有意識培養(yǎng)自己解決復(fù)雜問題的能力，才能在相關(guān)領(lǐng)域扎根立足并獲得長遠發(fā)展。

2 結(jié)語

轉(zhuǎn)基因植物的案例非常豐富，本文只是從中選擇部分進行教學(xué)轉(zhuǎn)化。這3個案例都完整包含了基因工程的操作流程：目的基因的獲取、載體構(gòu)建、受體細胞轉(zhuǎn)化、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定以及目的基因的表達。每個部分使用的技術(shù)在一定程度上包括了主要的基因工程操作技術(shù)，有一定的代表性。此外，這3個案例也有一些共同點，除流程基本一致外，在陽性轉(zhuǎn)基因植物的篩選和鑒定過程中，都采用不同的鑒定方法從分子水平和代謝水平來驗證轉(zhuǎn)基因的成功。另外，這3個案例的研究都是基于基礎(chǔ)和應(yīng)用的實際需求展開的，具有較重要的研究價值。在實際教學(xué)過程中，可根據(jù)課時多少來安排案例講解的占比。

我國的基礎(chǔ)教育和高等教育一直都處于改革發(fā)展過程中，其中一個比較重要的問題是如何實現(xiàn)理論基礎(chǔ)知識到實踐的轉(zhuǎn)化，即擺脫填鴨式的知識傳授，而是提高學(xué)生的主觀能動性，主動學(xué)習(xí)和探索，并將所學(xué)知識進行運用?；蚬こ陶n程是一門理論性、實踐性和探索性都非常強的課程，是實現(xiàn)理論和實踐結(jié)合的有效教學(xué)資源。傳統(tǒng)的基因工程理論教學(xué)側(cè)重于對主要流程及技術(shù)原理和操作的講解，脫離了技術(shù)方法的使用環(huán)境，使得學(xué)生在學(xué)習(xí)時缺少感性認識，積極性和教學(xué)效果較差。采用案例教學(xué)則能在一定程度上彌補這一缺陷，同時通過案例介紹激發(fā)學(xué)生思考，鼓勵學(xué)生進行探究，能更生動、更具體地呈現(xiàn)課程內(nèi)容。除植物基因工程外，大腸桿菌基因工程、酵母基因工程和動物基因工程也都有很多生產(chǎn)實踐和科學(xué)研究的實例，深入挖掘和利用這些實例提高教學(xué)成效是今后基因工程理論教學(xué)和實驗教學(xué)的改革方向之一。