馮 亮，鄭曉衛(wèi)，，葉 力，夏 冰，梁宏運(yùn)，陳曉園，吳新亮，楊 儒，孫玉婷

（1.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416000；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209）

馥郁香型白酒以五谷為原料，小曲和大曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵、清蒸混入、陳釀、勾調(diào)而成，具有窖香、曲香、蜜香等復(fù)合香氣[1]，小曲的主要功效為糖化作用，與傳統(tǒng)小曲酒中小曲的功效一致。馥郁香型白酒工藝中使用的小曲，起主要糖化功能的菌株為米根霉，因此小曲也稱為根霉曲。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，酒鬼酒使用的多糧糖化工藝，糖化效果最好，原料的出酒率最高[2]，根霉曲對基酒品質(zhì)有著十分重要的影響。然而，目前白酒行業(yè)使用的根霉曲存在菌株組成復(fù)雜、香氣不好、糖化力有待提高等問題[3]，阻礙了根霉曲在白酒釀造業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用和規(guī)?；a(chǎn)。因此，篩選高糖化力、發(fā)酵性能良好、典型風(fēng)味突出的功能菌株，是穩(wěn)定白酒釀造工藝，提高產(chǎn)品品質(zhì)主要措施之一。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

原料、麩曲和糖化料，2020 年取自酒鬼酒股份有限公司；商業(yè)根霉曲，酒鬼酒股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及耗材

孟加拉紅瓊脂、馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均購自于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；真菌DNA 基因組試劑盒購自于美國Omega Bio-Tek 公司；免疫親和柱購自于美國Romerlabs 公司；四甲基戊醇（純度為99 %）購自于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

孟加拉紅培養(yǎng)基：稱取36.6 g 孟加拉紅瓊脂，煮沸溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

PDB 培養(yǎng)基：稱取35 g馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，煮沸溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：稱取37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，煮沸溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌15 min。

1.1.4 儀器設(shè)備

蔡司AxioLab.A1 生物顯微鏡，卡爾蔡司(上海)管理有限公司；S-4300N 掃描電鏡，日本日立公司；NanoDrop One 微量核酸蛋白分析儀，美國Thermo Fisher公司；Agilent 7890B氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器）、Agilent 1260 液相色譜（配熒光檢測器）、Agilent 8890-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；ME204 分析天平（感量為0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q 純水儀，美國密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 功能菌株篩選及鑒定

1.2.1.1 篩選

分別取原料、麩曲、糖化料（糖化時(shí)間0 h、5 h、18 h、24 h）粉碎后按照1∶9 溶于45 mL 無菌生理鹽水，室溫振蕩10 min，取上清液逐級稀釋制備梯度菌懸液，將各梯度菌懸液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3 d，隨機(jī)選取具有典型霉菌菌落特征的單菌落，劃線分離純化2～3次，直至平板上的菌落為同一形態(tài)，獲得單個(gè)純種菌落。

無菌條件下，挑1 環(huán)菌絲，接種于PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 后過濾，參考崔香香等[7]的分析方法，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（solid-phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法檢測揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)并進(jìn)行感官評價(jià)。將菌株制備成麩曲后對其糖化力進(jìn)行檢測，初步篩選糖化力較好且具有產(chǎn)蜜香能力的功能菌株。

1.2.1.2 鑒定

菌株形態(tài)學(xué)觀察：將經(jīng)活化的菌株用接種環(huán)劃線接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)特征，并用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察菌絲及其孢子形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定：使用真菌DNA 基因組試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，利用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 擴(kuò)增基因組DNA。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs) (2.5 mmol/L) 4 μL，模板5 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，引物各1 μL，補(bǔ)充去離子水至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0 %的瓊脂糖進(jìn)行驗(yàn)證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對，采用Blast程序進(jìn)行同源性序列分析。

1.2.1.3 性能及安全性評價(jià)

表型安全性評價(jià)：將菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d 后，將培養(yǎng)基與培養(yǎng)物切碎，轉(zhuǎn)移至50 mL 無菌離心管中，加入30 mL 的80 %甲醇，超聲30 min，8000 r/min 離心20 min，取上清液，參考GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B 族和G 族的測定》[4]、GB 5009.240—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中伏馬毒素的測定》[5]及GB 5009.96—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中赭曲霉毒素A的測定》[6]，使用免疫親和柱凈化高效液相色譜法對常見真菌毒素黃曲霉毒素B1、B2，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉素A進(jìn)行檢測。

基因型安全性評價(jià)：對菌株進(jìn)行全基因組測序，并通過KEGG、NR、GO 等多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，完成基因組預(yù)測及功能注釋，選取已發(fā)表的常見真菌毒素進(jìn)行比對注釋，對相關(guān)生物信息進(jìn)行分析。

1.2.2 功能菌株的生長條件優(yōu)化

1.2.2.1 生長條件單因素試驗(yàn)

功能菌株于PDA 斜面活化后，用無菌水洗滌孢子，制成濃度為107～108個(gè)/mL 的孢子懸液，將其接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，考察不同培養(yǎng)條件對菌株生長的影響。首先采用單因素試驗(yàn)考察培養(yǎng)基成分（碳源、氮源和無機(jī)鹽）對菌絲干重的影響，具體因素與水平見表1。

表1 單因素及其試驗(yàn)水平

1.2.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

在確定碳源、氮源以及無機(jī)鹽種類的基礎(chǔ)上，選取影響菌絲干重的培養(yǎng)基成分（碳源、氮源和無機(jī)鹽）和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速和溫度）共9 因子進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對生長影響最大的幾個(gè)因素，本實(shí)驗(yàn)選用N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以菌絲干重為試驗(yàn)指標(biāo)，評價(jià)各個(gè)參數(shù)對干重的影響，并篩選出主要因素。用Design-Expert 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較各因素的t值和可信度。

1.2.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

依據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)獲得的回歸模型和試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定裝液量、酵母浸粉、纖維二糖3 個(gè)因素的步移方向和步長，其余條件按照單因素最優(yōu)值進(jìn)行，以菌絲干重為評價(jià)指標(biāo)，最終確定后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中的顯著因素范圍，確定試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

1.2.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對纖維二糖、酵母浸粉以及裝液量進(jìn)行優(yōu)化，以菌絲干重為響應(yīng)值，每個(gè)因素的3個(gè)水平以（-1，0，+1）編碼，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

1.2.3 功能根霉曲的制備

稱取500 g 麩皮，加入300 g 蒸餾水，充分混勻，121 ℃，30 min，趁熱輕搖，打散結(jié)塊，冷卻至30～35 ℃，制成麩曲培養(yǎng)基備用。將按照1.2.2 優(yōu)化生長條件培養(yǎng)的種子液按照8 %的接種量添加至麩曲培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，待菌絲長滿黑色孢子，密集且麩皮成餅后，進(jìn)行扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h。將培養(yǎng)好的麩皮發(fā)酵物于40～45 ℃烘干48 h，使用研磨儀對接種有米根霉的干燥麩皮發(fā)酵物進(jìn)行研磨，制成功能根霉種曲，并完成手工擴(kuò)培，獲得功能根霉曲。以功能根霉曲作為實(shí)驗(yàn)組，商業(yè)根霉曲作為對照組，每組三個(gè)平行，從理化指標(biāo)、微生物和試飯實(shí)驗(yàn)三個(gè)方面對根霉曲質(zhì)量進(jìn)行分析。

1.2.4 功能根霉曲微生物群落結(jié)構(gòu)解析

選取功能根霉曲與商業(yè)根霉曲樣品，每份樣品隨機(jī)取樣3 次，每次2 g，組織研磨儀充分研磨后用真菌DNA 提取試劑盒對樣品微生物群落總DNA進(jìn)行抽提，利用微量核酸蛋白分析儀檢測DNA 濃度及純度。對ITS1F-ITS2R 基因1、2 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進(jìn)行測序，測序與建庫由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用UPARSE 軟件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1）對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，便于降低分析中間過程冗余計(jì)算量（http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html），去除沒有重復(fù)的單序列（http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)，按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Unite（Release 8.0,http://unite.ut.ee/index.php）的真菌數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 根霉曲理化分析與試飯實(shí)驗(yàn)分析

理化指標(biāo)分析：水分、酸度和糖化力測定，參照李洪媛等的方法[8]。

試飯實(shí)驗(yàn)：參考嚴(yán)啟梅等[9]的文獻(xiàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)觀察發(fā)酵產(chǎn)物的外觀，測定試飯?zhí)嵌炔⑦M(jìn)行感官分析。

1.2.6 功能根霉曲釀酒中試實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 功能根霉曲擴(kuò)培與質(zhì)量分析

將篩選得到的功能米根霉參照1.2.2 和1.2.3 進(jìn)行菌株培養(yǎng)及根霉曲制備。擴(kuò)培時(shí)按照0.3 %～0.5 %的接種量（以麩皮計(jì)）添加，30～35 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)12～72 h 期間，每6～8 h 翻曲1 次。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)曲料中菌絲粗壯密布，連接成塊。將曲料打碎，烘干，備用。

理化實(shí)驗(yàn)與試飯實(shí)驗(yàn)方法參考1.2.5方法。

1.2.6.2 糖化料分析方法

取5 g 樣品加入20 mL 超純水，振蕩混勻后，超聲浸提30 min，8000 r/min 離心10 min。取上清液，20 mL 樣品瓶中加入8 mL 上清液、內(nèi)標(biāo)物（四甲基戊醇，濃度為125 mg/L）和3 g NaCl，迅速擰緊并封好瓶蓋，配制成待測液，供上機(jī)分析備用。萃取、氣相及質(zhì)譜條件與1.2.1.1相同。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 18.0 軟件和Design Expert 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株篩選及鑒定

2.1.1 功能菌株的篩選

利用梯度稀釋和平板涂布法先后從原料、麩曲、糖化料樣品中分離純化出41 株米根霉菌株，其中原料中獲得6 株，麩曲中獲得16 株，糖化料中獲得19 株。對41 株菌株進(jìn)行糖化性能及產(chǎn)蜜香能力評估，分離菌株中14 株糖化力＞250，其中3 株糖化力＞350，表現(xiàn)優(yōu)異。專業(yè)術(shù)人員對糖化力顯著的3株菌株發(fā)酵液香氣進(jìn)行感官評價(jià)，發(fā)現(xiàn)3 株菌株發(fā)酵液均具有水果香、花香等香氣，其中1 株發(fā)酵液蜜香風(fēng)味濃郁突出。利用SPME-GC-MS 測定該菌株發(fā)酵液揮發(fā)性香氣成分，將得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST14 標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行對照匹配，取匹配度大于80 的化合物保留，用于定性分析；定量分析采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對百分含量,參考劉登勇等[13]的方法，采用相對氣味活度值法（relative odor activity value，ROAV）評價(jià)各揮發(fā)性成分對樣品總體香氣的貢獻(xiàn)，鑒定結(jié)果見表3。

表3 蜜香風(fēng)味突出菌株揮發(fā)性香氣成分SPME-GC-MS鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示，該高產(chǎn)蜜香風(fēng)味物質(zhì)的菌株，發(fā)酵液中共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)27 種，包括醇類13 種，酯類4 種，酮類2 種，酚類1 種，烴類3 種，其他4 種。其中，3-甲基-1-丁醇（異戊醇）、β-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇（異丁醇）、苯乙酮以及四甲基吡嗪的ROAV 值均大于1，是發(fā)酵液中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。值得注意的是，ROAV 值較大的β-苯乙醇具有蜜香、玫瑰花香、月季花香、花粉香等香氣，這與發(fā)酵液蜜香，感官評價(jià)結(jié)果相吻合。綜合糖化性能、揮發(fā)性物質(zhì)和感官指標(biāo)，將篩選出的糖化力較高且發(fā)酵液有顯著蜜香香氣的菌株，編號為BC 70107菌株，確定該菌株應(yīng)用于后續(xù)馥郁香型白酒用根霉曲的生產(chǎn)。

2.1.2 功能菌株的篩選

將功能菌株BC 70107 接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)特征，并用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察菌絲及其孢子形態(tài)特征。結(jié)果如圖1 所示。菌落疏松或稠密，最初呈白色，后變?yōu)榛液稚蚝诤稚?；菌絲匍匐爬行，無色；假根發(fā)達(dá)，分枝呈指狀或根狀；孢囊梗直立或稍彎曲，2～4 株成束，與假根對生，有時(shí)膨大或分枝，呈褐色，長210～2500 μm，直徑5～18 μm，囊軸呈球形或近球形或卵圓形，呈淡褐色，直徑30～200 μm；囊托呈楔型；孢子囊呈球形或近球形，后期呈黑色，直徑60～250 μm。

圖1 菌株BC 70107菌落及顯微形態(tài)照片

應(yīng)用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）法提取菌株基因組DNA，通過真菌通用引物擴(kuò)增18S rDNA 部分序列、ITS1-5.8S-ITS2 全部序列和28S rDNA 部分序列（rDNA-ITS 序列）并測序，結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，進(jìn)一步確定為米根霉。

2.1.3 功能菌株安全性評價(jià)

對米根霉BC 70107 培養(yǎng)物進(jìn)行真菌毒素檢測，在培養(yǎng)物中未檢出黃曲霉毒素B1、B2，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉素。對菌株進(jìn)行全基因組測序，并通過數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，完成基因組預(yù)測及功能注釋等相關(guān)生物信息分析，結(jié)果見表4。

由表4 可知，米根霉BC 70107 基因組未有相關(guān)匹配基因和基因注釋信息，可以認(rèn)為米根霉BC 70107 不存在PKS 或者NRPS 代謝合成的相關(guān)基因及代謝途徑。綜合表型和基因型分析結(jié)果驗(yàn)證了米根霉BC 70107的安全性[14]。

表4 典型真菌毒素主要合成途徑與基因及其與BC 70107基因組比對結(jié)果

2.2 功能菌株米根霉BC 70107的生長條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

基于探究產(chǎn)蜜香米根霉在馥郁香型白酒釀造中的應(yīng)用，分析其最佳生長條件，為后期菌劑的制備提供參考。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，優(yōu)化碳源、氮源和無機(jī)鹽，得到較高米根霉菌絲干重。采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)判斷實(shí)驗(yàn)組與對照組間的顯著性差異，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，米根霉BC 70107 對碳源利用廣泛，以纖維二糖為碳源時(shí)，菌絲干重最高，能達(dá)到1.00 g/100 mL，因此選取20 g/L 添加量的纖維二糖用于后續(xù)試驗(yàn)。不同的氮源對菌絲產(chǎn)生量的影響較大，酵母浸粉為氮源時(shí)菌絲干重最高，能達(dá)到0.70 g/100 mL，因此選擇10 g/L 添加量的酵母浸粉用于后續(xù)試驗(yàn)。在額外添加FeSO4時(shí)菌株生長良好，菌絲干重能達(dá)到1.42 g/100 mL，因此選用額外添加量為1 g/L FeSO4的無機(jī)鹽用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了11 因素N=12 的Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，方差分析見表6，每組試驗(yàn)的響應(yīng)值取3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 軟件進(jìn)行回歸分析，各因素對菌絲干重影響的一次回歸方程為：

Y=1.15+0.207A+0.288B-0.054C+0.115D+0.338E+0.040F-0.043G-0.110H-0.102J

由表6 可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜=0.0347＜0.05，表明該模型是顯著的；相關(guān)系數(shù)R2=0.9922，表明預(yù)測值與試驗(yàn)值高度相關(guān)，方程能較好的解釋變量響應(yīng)值；調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.9571，表明該方程的擬合度較好。9個(gè)因素對響應(yīng)值影響的顯著順序?yàn)檠b液量＞酵母浸粉＞纖維二糖＞pH 值＞轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵時(shí)間＞FeSO4＞溫度＞接種量，其中裝液量的影響最為顯著，酵母浸粉、纖維二糖有顯著影響，且三者對菌絲量的影響均呈正效應(yīng)，因此選取這3 個(gè)因子進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

由表7 可知，隨著裝液量、酵母浸粉、纖維二糖的變化，菌絲干重呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。當(dāng)纖維二糖為45 g/L、酵母浸粉為35 g/L、裝液量為125 mL 時(shí)，菌絲干重最大，達(dá)2.13 g/100 mL，因此選擇第6 組中的因素水平為中心點(diǎn)，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

設(shè)計(jì)3 因素3 水平的Box-Benhnken Design 響應(yīng)面試驗(yàn)，共17組試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表8，對試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，分析結(jié)果見表9。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

擬合得到的二次回歸方程為：

R=2.10-0.053A+0.029B-0.204C-0.06AB +0.05AC-0.008BC-0.191A2-0.159B2-0.049C2

由表9可知，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9324，F(xiàn)值=10.72，P 值=0.0025＜0.01，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)的P 值=0.0537（＞0.05），失擬項(xiàng)不顯著，說明方程的擬合程度較好，可以用該方程確定菌株生產(chǎn)的最佳條件。另外，一次項(xiàng)C 的P 值=0.0002（＜0.01），說明裝液量對菌株生長影響極顯著。根據(jù)二次回歸方程得到的響應(yīng)面圖如圖3所示。

表9 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

圖3 因素兩兩交互作用對菌絲干重影響的等高線圖（左）和響應(yīng)面圖（右）

由該模型得到的最佳發(fā)酵條件為：纖維二糖42.1 g/L、酵母浸粉為36.7 g/L、硫酸亞鐵1.0 g/L、溫度28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間3 d、轉(zhuǎn)速120 r/min、接種量2%、裝液量110 mL，根據(jù)最佳培養(yǎng)條件對模型進(jìn)行驗(yàn)證，3 次平行試驗(yàn)獲得的菌絲干重平均值為2.32 g/100 mL，與理論預(yù)測值接近，說明該模型能較好地反應(yīng)篩選因素對菌絲干重的影響，在優(yōu)化條件下，菌絲干重較優(yōu)化之前提高了2.36倍。

2.3 功能根霉曲質(zhì)量分析

2.3.1 功能根霉曲理化及微生物指標(biāo)分析

以市售商業(yè)根霉曲為對照，對米根霉BC 70107 制備的功能根霉曲（實(shí)驗(yàn)組）的水分、糖化力和酸度理化指標(biāo)及米根霉活菌數(shù)微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測，測定結(jié)果見表10。

表10 功能根霉曲理化及微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

結(jié)果表明，與商業(yè)根霉曲（對照組）相比，米根霉BC 70107 制備的功能根霉曲糖化力有所提高，酸度明顯下降，米根霉活菌數(shù)是對照組的7.75 倍，相差近一個(gè)數(shù)量級。

2.3.2 試飯實(shí)驗(yàn)

以市售商業(yè)根霉曲為對照，根霉曲試飯實(shí)驗(yàn)兩組樣品觀察均出現(xiàn)變軟、體積變小、出汁，具體結(jié)果見表11。

表11 試飯?jiān)囼?yàn)結(jié)果

由表11 可知，功能根霉曲糖化力與對照組無顯著差異，感官具有更為突出的蜜香特征。綜合各項(xiàng)指標(biāo)和試飯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，功能根霉曲質(zhì)量優(yōu)于市售馥郁香型白酒用商業(yè)根霉曲并且可能會(huì)在糖化過程中產(chǎn)生更加豐富的風(fēng)味物質(zhì)和前體物質(zhì)[15]。

2.4 功能根霉曲微生物群落結(jié)構(gòu)解析

為進(jìn)一步分析功能性米根霉曲品質(zhì)，基于ITS序列的高通量測序技術(shù)分析實(shí)驗(yàn)組與對照組根霉曲真菌微生物群落結(jié)構(gòu)。共得到140 個(gè)有效OTU，序列比對后，得到已知的5 個(gè)門，12 個(gè)綱，25 個(gè)目，43 個(gè)科，57 個(gè)屬分類單元，其中豐度大于10%的優(yōu)勢分類單元共有4 種，根霉屬占絕對優(yōu)勢（＞80%）。TOP10菌屬信息見圖4。

圖4 功能根霉曲微生物多樣性差異

圖4 結(jié)果顯示，在成熟的功能根霉曲樣品中，米根霉持續(xù)保持優(yōu)勢狀態(tài)，其豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌株，此外，其他優(yōu)勢菌株包括念珠菌屬（Diutinasp.）、絲孢酵母屬（Trichosporon sp.）、Dipodascaceae sp.、伊薩酵母屬（Issatchenkia sp.）等；對照組米根霉相對豐度顯著降低，念珠菌屬（Diutina sp.）、絲孢酵母屬（Trichosporon sp.）、Dipodascaceae sp.、伊薩酵母屬（Issatchenkia sp.）等相對豐度占據(jù)近50%。一方面可以推測實(shí)驗(yàn)組與對照組共有菌株來自于外部自然環(huán)境、糧食、操作工具等途徑，一方面也說明商業(yè)根霉曲活力相對較弱，無法始終保持優(yōu)勢狀態(tài)，致使發(fā)酵后期體系中污染大量雜菌，與商業(yè)根霉曲酸度較大的結(jié)果相互印證。

2.5 功能根霉曲釀酒中試實(shí)驗(yàn)

2.5.1 擴(kuò)培小曲質(zhì)量分析

對菌種擴(kuò)培工序中實(shí)驗(yàn)小曲質(zhì)量進(jìn)行5 批次持續(xù)追蹤，結(jié)果見表12。

表12 中試實(shí)驗(yàn)成曲質(zhì)量分析

功能根霉曲擴(kuò)培小曲糖化力達(dá)到419 mg/g·h，酸度為0.7 mmol/10 g，與對照組相比具有糖化力高、酸度低的特點(diǎn)，達(dá)到一級曲標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.2 糖化料風(fēng)味物質(zhì)分析

經(jīng)預(yù)處理，采用SPME-GC-MS 對使用功能根霉曲與商業(yè)根霉曲發(fā)酵制備的糖化料中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如表13所示。

由表13 可知，對照組糖化料丁酸、丙酸、乙酸乙酯、庚酸乙酯、己酸丁酯等含量顯著高于功能根霉曲，丁酸的含量是功能根霉曲糖化料的5.5 倍，易產(chǎn)生不良風(fēng)味。推測可能是市售商業(yè)根霉曲存在一定量的雜菌，糖化過程導(dǎo)致酸類、酯類物質(zhì)明顯增多。功能根霉曲糖化料中苯乙酸乙酯、β-苯乙醇、苯乙醛等物質(zhì)的含量顯著高于商業(yè)根霉曲，使得糖化料具有蜜香、花香的風(fēng)味特點(diǎn)。

表13 糖化料中主要揮發(fā)性物質(zhì) (mg/L)

3 結(jié)論

從酒鬼酒股份有限公司釀酒環(huán)節(jié)中的原料、麩曲、糖化料中定向分離篩選出1 株糖化力較高且高產(chǎn)蜜香功能菌株，編號為BC 70107，經(jīng)鑒定為米根霉，同時(shí)通過表型和基因型分析驗(yàn)證了其安全性。

通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，對米根霉BC 70107 的生長條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵條件為：纖維二糖42.1 g/L、酵母浸粉為36.7 g/L、硫酸亞鐵1.0 g/L、溫度28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間3 d、轉(zhuǎn)速120 r/min、接種量2%、裝液量110 mL。該條件下獲得的菌絲干重平均值為2.32 g/100 mL。

將米根霉BC 70107 制備成種曲，并完成手工擴(kuò)培，與市售商用根霉曲相比，其糖化力、酸度、米根霉活菌數(shù)及試飯實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表現(xiàn)優(yōu)異。微生物多樣性差異結(jié)果顯示功能根霉曲米根霉豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌株，菌株優(yōu)勢明顯。

經(jīng)擴(kuò)培后的功能根霉曲糖化力達(dá)到419 mg/g·h，酸度為0.7 mmol/10 g，評級指標(biāo)達(dá)到一級曲標(biāo)準(zhǔn)。將其應(yīng)用于馥郁香型白酒生產(chǎn)過程中，糖化料中苯乙酸乙酯和β-苯乙醇等蜜香風(fēng)味物質(zhì)含量顯著高于對照組，證明米根霉BC 70107 具有高糖化力和高產(chǎn)蜜香風(fēng)味的特點(diǎn)，是一株性能優(yōu)良的釀酒用糖化菌株，可通過工藝進(jìn)一步詮釋馥郁香型白酒獨(dú)特的蜜甜風(fēng)格。