柴小兵，褚菲菲，肖興國(guó)，吳慧麗

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南省結(jié)直腸癌診治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市結(jié)直腸癌診治與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450007

結(jié)直腸癌是臨床中常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病與大腸腺瘤、遺傳因素、生活習(xí)慣等存在密切關(guān)系，常見的臨床癥狀為腹痛、便血以及大便性狀改變等，多見于中老年人群，男性發(fā)病率高于女性，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢(shì)[1]。目前，手術(shù)是治療結(jié)直腸癌的主要方法之一，早期明確診斷并及時(shí)給予針對(duì)性治療可以使患者獲得較好預(yù)后。研究指出，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的主要因素。結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，某些與腫瘤相關(guān)的因子可能起到重要作用[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與惡性腫瘤有關(guān)，T細(xì)胞受體γ位點(diǎn)反義RNA 1（T cell receptor gamma locus antisense RNA 1，TRG-AS1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種惡性腫瘤相關(guān)lncRNA[3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）不僅參與惡性腫瘤新生血管生成，而且在能量代謝過程中具有重要作用[4]。人抗原R（human antigen R，HuR）是胚胎致死性異常視覺基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可以對(duì)mRNA的不穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)節(jié)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[5]。三元基序家族蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM21）是TRIM家族的重要成員，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等方面起到重要的調(diào)控作用[6]。本研究分析 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義，旨在為結(jié)直腸癌的治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年6月于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌；②初次行手術(shù)治療；③術(shù)前未接受過生物免疫治療或放化療等；④臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病或血液系統(tǒng)疾病；③合并全身性感染。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入103例患者。其中，男性68例，女性35例；年齡34～77歲，平均（54.97±10.68）歲。收集103例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織及癌旁組織（距結(jié)直腸癌組織5 cm以上），所有標(biāo)本均置于低溫保存管，經(jīng)液氮處理后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況及結(jié)果判定 石蠟包埋處理標(biāo)本，連續(xù)切片，厚度為4 μm左右；將切片脫蠟和水化，通過高壓鍋修復(fù)抗原，時(shí)間為2 min；封閉液孵育60 min；滴加HuR、TRIM21、HIF-1α一抗工作液50 μl，4℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加二抗工作液50 μl，室溫下孵育30 min；加入二氨基聯(lián)苯胺顯色，分別應(yīng)用蘇木精及梯度乙醇進(jìn)行復(fù)染和脫水，然后進(jìn)行固封和鏡檢。采用熒光倒置顯微鏡觀察染色結(jié)果。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中等陽性，9～12分為強(qiáng)陽性，其中1～9分為陽性。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)TRG-AS1相對(duì)表達(dá)量 應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，然后應(yīng)用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增，引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，TRG-AS1上游引物5'-ATGAAGAAGCCGCGAAGTGT-3'，下游引物 5'-CACACCCTAATACACATGCCCT-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物5'-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3'，下游引物5'-GGCGCCCAATACGACCAAAT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法檢測(cè)TRG-AS1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪方法

出院后第1天開始隨訪，通過門診復(fù)查或電話、微信等電子通訊的方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2022年3月，以患者死亡或復(fù)發(fā)為隨訪終點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或McNemar檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1相對(duì)表達(dá)量為（1.50±0.50），明顯高于癌旁組織的（0.71±0.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.281，P＜0.01）。結(jié)直腸癌組織中HuR、HIF-1α陽性率分別為65.05%（67/103）、76.70%（79/103），分別明顯高于癌旁組織的10.68%（11/103）、14.56%（15/103），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)直腸癌組織中TRIM21陽性率為30.10%（31/103），明顯低于癌旁組織的91.26%（94/103），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況的比較

不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、血管侵犯情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.116、t=4.688、t=3.038，P＜0.05）；不同浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中HuR陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.864、9.938、7.237，P＜0.05）；不同浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中TRIM21陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.537、7.908、5.859，P＜0.05）；不同浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中HIF-1α陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.498、5.804、5.499，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α的表達(dá)情況

2.3 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況結(jié)直腸癌患者預(yù)后的比較

隨訪至2022年3月，103例患者中死亡36例，生存67例，生存率為65.05%。以TRG-AS1相對(duì)表達(dá)量的中位值為界，中位值以上為高表達(dá)，中位值及以下為低表達(dá)；TRG-AS1低表達(dá)患者的累積生存率為55.6%，高于TRG-AS1高表達(dá)患者的31.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.493，P=0.011）。HuR陰性患者的累積生存率為56.9%，高于HuR陽性患者的37.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.824，P=0.028）。TRIM21陰性患者的累積生存率為22.4%，低于TRIM21陽性患者的59.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.827，P=0.015）。HIF-1α陰性患者的累積生存率為72.0%，高于HIF-1α陽性患者的36.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.422，P=0.035）。（圖1）

圖1 不同TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況結(jié)直腸癌患者的生存曲線

3 討論

結(jié)直腸癌具有較高的發(fā)病率及病死率，特別是中晚期患者，即使接受手術(shù)、化療、放療等綜合治療，其預(yù)后情況仍不容樂觀。近年來，隨著生物信息學(xué)、基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，多種新型腫瘤標(biāo)志物逐漸被發(fā)現(xiàn)[7]。結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制尚未明確，仍需要進(jìn)一步研究其治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，說明TRG-AS1可能作為一種促癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。lncRNA異常表達(dá)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有學(xué)者指出，TRG-AS1能夠通過影響微小 RNA（microRNA，miRNA）-877-5p對(duì)Zeste 12同源物1抑制因子2（suppressor of zeste 12 homolog，SUZ12）的表達(dá)情況進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展[8]。He等[9]研究指出，TRG-AS1可以通過調(diào)控miRNA-543/Yes相關(guān)蛋白1信號(hào)通路促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生。目前關(guān)于TRG-AS1在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。分析其原因可能是TRG-AS1受其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控或編碼基因發(fā)生突變導(dǎo)致[10]。本研究結(jié)果顯示，不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、血管侵犯情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明TRG-AS1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。研究表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在結(jié)直腸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮重要作用，而TRG-AS1下調(diào)有效地抑制了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，TRG-AS1表達(dá)水平升高后對(duì)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用減弱[11]。

據(jù)報(bào)道，許多轉(zhuǎn)錄因子參與了惡性腫瘤某些關(guān)鍵的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、新生血管生成、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)移等，與患者的生存率存在密切關(guān)系[12]。HuR是一種RNA結(jié)合蛋白，已被證明通過不同的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制（如mRNA衰變和蛋白質(zhì)翻譯）調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中HuR陽性率明顯高于癌旁組織，不同浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中HuR陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明HuR能夠反映結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、c-Myc、細(xì)胞周期蛋白D（cyclin D）和細(xì)胞周期蛋白A（cyclin A）基因?yàn)镠uR的下游分子，這些基因均參與了細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期等過程，如轉(zhuǎn)錄因子c-Myc可調(diào)節(jié)10%～15%的人類基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)和存活過程中發(fā)揮重要作用；細(xì)胞周期蛋白是細(xì)胞周期的基本調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，cyclin A是細(xì)胞通過S期所必需的[14]。HuR通過上調(diào)Bcl-2、c-Myc、cyclin D和cyclin A基因表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[15]。

TRIM21是TRIM超家族成員，已被發(fā)現(xiàn)是多種自身免疫疾?。ㄈ缪装Y性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和風(fēng)濕性疾病等）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而且有研究證實(shí)，TRIM21是肝細(xì)胞癌中潛在的腫瘤抑制因子[16]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TRIM21陽性率明顯低于癌旁組織，說明結(jié)直腸癌中TRIM21發(fā)揮抑癌基因的作用。Zhou等[17]研究指出，TRIM21在結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、組織重塑、血管生成以及炎癥反應(yīng)來負(fù)調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮癌變，進(jìn)而降低結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，不同浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中TRIM21陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明TRIM21可反映結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度。其原因可能是TRIM21能夠介導(dǎo)蛋白酶體降解以及Snail蛋白泛素化，調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。

HIF-1α在惡性腫瘤對(duì)缺氧的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在缺氧條件下HIF-1α信號(hào)被激活，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)放療和化療的抵抗[19]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中HIF-1α陽性率明顯高于癌旁組織，說明結(jié)直腸癌中HIF-1α發(fā)揮促癌基因的作用。HIF-1α表達(dá)上調(diào)與抑癌基因突變、促癌基因激活有關(guān)，還可能與組織氧濃度降低有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中HIF-1α陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明HIF-1α水平同樣可反映結(jié)直腸癌患者病情嚴(yán)重程度。其原因可能是HIF-1α表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；另外，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α也可以通過誘導(dǎo)p53表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)，TRG-AS1低表達(dá)、HuR陰性、TRIM21陽性、HIF-1α陰性結(jié)直腸癌患者的累積生存率分別高于TRGAS1高表達(dá)、HuR陽性、TRIM21陰性、HIF-1α陽性患者（P＜0.05），說明 TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)，可能作為評(píng)估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中TRG-AS1、HIF-1α及HuR表達(dá)均升高，TRIM21表達(dá)降低，TRG-AS1、HuR、TRIM21、HIF-1α表達(dá)情況與結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)評(píng)估結(jié)直腸癌患者病情及預(yù)后具有一定的臨床價(jià)值。