董 彬，王立志,宋紅麗，王國祥，劉 艷

(1：山東省水土保持與環(huán)境保育重點實驗室，臨沂大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，臨沂 276000) (2：南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023)

河流是陸地系統(tǒng)主要的氮匯，每年向海洋輸送的氮量約為35 Tg。氮素是我國河流的主要污染物之一，削減氮負(fù)荷是河流水環(huán)境管理和修復(fù)的關(guān)鍵問題。反硝化作用可使氮素以氮氣(N2)形式徹底脫離水體，全球輸入河流的總氮約有50%通過反硝化作用被去除[1-2]，盡管已發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化、甲烷厭氧氧化等脫氮過程在河流中存在，但目前認(rèn)為反硝化過程仍是河流氮去除的重要途徑[3-4]，是調(diào)節(jié)區(qū)域甚至全球尺度上氮循環(huán)的關(guān)鍵過程[1]。目前對河流反硝化作用的研究場所主要集中在沉積物-水界面和上覆水中，普遍認(rèn)為河流沉積物由于含有豐富的有機質(zhì)、氮(N)、磷(P)、硫(S)和微生物等，是反硝化發(fā)生的主要場所[2,5]。

自然水環(huán)境中反硝化作用通常出現(xiàn)在很薄(μm～mm)的基質(zhì)層內(nèi)[6]。氮負(fù)荷較高的水體中，沉水植物莖葉表面常有一層附著生物膜，其結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成復(fù)雜，存在氧化-還原異質(zhì)微環(huán)境[7-8]，且營養(yǎng)物質(zhì)豐富，是氮素循環(huán)及生命活動較為強烈的場所[9]。已發(fā)現(xiàn)在夏季養(yǎng)分和水生植物豐富的淺水河流和人工濕地中，沉水植物馬來眼子菜(PotamogetonmalainusMiq)、金魚藻(CeratophyllumdemersumL.)、穗狀狐尾藻(MyriophyllumspicatumL.)、苦草(Vallisnerianatans)，挺水植物蘆葦(Phragmitesaustralis)附著生物膜的反硝化活性較高，反硝化作用貢獻(38.96%～67.56%)已接近甚至超過沉積物的貢獻[9-11]，是不可忽視的反硝化場所。在富營養(yǎng)化水體中，沉水植物菹草(Potamogetoncrispus)春季適宜溫度(10～20℃)下暴發(fā)生長(“瘋長”)可造成生物量(2.0～5.3 kg/m2)和蓋度(>80%)過大[12]，可能會強烈影響水生態(tài)系統(tǒng)中的硝化、反硝化過程，促進氮去除。但相關(guān)研究非常匱乏，限制了河流氮收支的精確計算及氮匯的評價。

沂河是發(fā)源于山東省境內(nèi)最長的河流，由于臨沂市城區(qū)段受污水排放、橡膠壩及人類活動影響，水污染負(fù)荷壓力較大，水體氮磷養(yǎng)分豐富，菹草已成為春季該水域的絕對優(yōu)勢種，每年4、5月份均有暴發(fā)現(xiàn)象，由菹草引發(fā)的水質(zhì)污染問題成為已成為關(guān)注的焦點，常采用收割打撈的方式清除菹草，但對河流生態(tài)系統(tǒng)的干擾較大，且忽略了菹草的生態(tài)功能。暴發(fā)生長期菹草生物量增長迅速，為附著生物膜提供了巨大的附著表面，附著生物膜反硝化作用如何變化？單位河流面積上附著生物膜反硝化脫氮潛力有多大？其對水生態(tài)系統(tǒng)氮去除的貢獻如何？是否河流反硝化作用的熱點？這些問題目前尚不清楚，難以客觀科學(xué)地評價菹草暴發(fā)生長對水體的環(huán)境效應(yīng)。鑒于此，本研究選擇沂河城區(qū)段菹草進行觀測研究，主要目的是分析暴發(fā)生長階段菹草附著生物膜的反硝化作用變化特征，探明附著生物膜反硝化脫氮潛力，為菹草的科學(xué)管控和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

在沂河臨沂市城區(qū)段，沂河桃園橡膠壩與小埠東橡膠壩、角沂橡膠壩、劉家道口樞紐相連形成面積36 km2的沂蒙湖。經(jīng)過近幾年的生長繁殖，菹草已成為臨沂市中心城區(qū)水域的絕對優(yōu)勢種，占所有沉水植物的90%以上，每年4月至5月中下旬，菹草覆蓋大部分水面，生物量達到最大，阻擋了80%以上的光，抑制了水中浮游藻類的生長。白天菹草的光合作用較高，夜間由于菹草的呼吸作用可將水體中氧氣(O2)消耗至1 mg/L以下[8]，有利于反硝化作用進行。在前期野外調(diào)查基礎(chǔ)上，選擇沂河城區(qū)段6個典型樣點(圖1)進行研究，各采樣點水體理化特征、菹草豐富度存在差異(表1)，S1、S2樣點菹草豐富度為中，S3、S4樣點菹草豐富度高(圖2)，S5、S6樣點菹草豐富度低。在菹草快速生長季節(jié)(3月底至5月下旬)監(jiān)測其豐富度變化。2019年從4月初開始在上述地點采集菹草、水和沉積物樣品，至5月下旬菹草葉片出現(xiàn)大量分解時采樣結(jié)束，每7～10天采樣1次。

圖1 菹草觀測點示意圖Fig.1 Sampling sites of Potamogeton crispus

表1 菹草暴發(fā)生長前采樣點水體理化特征*Tab.1 Parameters of river water at the sampling sites

圖2 沂河采樣點S3菹草暴發(fā)情況(2019年4月30日)Fig.2 Photographs of Potamogeton crispus during explosive growing at S3 in Yi River

1.2 菹草、水和沉積物樣品的采集

在每個采樣點隨機選擇3個樣方(0.5 m×0.4 m)，樣方間隔50～100 m，用水草夾小心采集每個樣方的全部菹草裝入無菌袋，然后在每個樣方內(nèi)用柱狀采泥器采集完整沉積物底泥柱(深10 cm，直徑8.4 cm)3個，采集表層水樣2000 mL。用便攜式參數(shù)檢測儀(Hach, USA)在每樣方現(xiàn)場測定水溫(WT)、溶解氧(DO)、pH和氧化還原電位(Eh)等。取表層(0～5 cm)沉積物柱樣，兩端封好。植物、底泥和水樣置于恒溫保溫箱中立即運回實驗室。

1.3 反硝化作用樣品的培養(yǎng)實驗和產(chǎn)物N2的分析

表2 實驗中使用的營養(yǎng)液組成Tab.2 Constitution of the nutrient solution used in the experiments

1.4 反硝化作用速率和厭氧氨氧化作用速率計算

根據(jù)膜進樣質(zhì)譜儀測定的溶液中產(chǎn)生的28N2、29N2、30N2濃度，通過同位素配對計算反硝化作用速率和厭氧氨氧化作用速率[9,15-16]。

(1)

(2)

為便于比較菹草附著生物膜反硝化作用、厭氧氨氧化作用和沉積物反硝化作用及厭氧氨氧化作用，將反硝化速率單位轉(zhuǎn)換為通用單位μmol/(m2·h)。單位河流面積上菹草附著生物膜的反硝化作用速率和厭氧氨氧化速率通過菹草生物量(g/m2)、菹草樣品占地面積(m2)、蠕動泵流速(mL/min)、N2的濃度(μmol/L)進行換算；單位河流面積上沉積物的反硝化速率和厭氧氨氧化速率根據(jù)沉積物柱橫截面面積(m2)、蠕動泵流速(mL/min)、N2的濃度(μmol/L)進行換算。

1.5 附著生物膜樣品的采集與分析

附著反硝化細(xì)菌的定量分析采用熒光定量qPCR方法。用超聲法洗脫附著細(xì)菌[9]，真空抽濾至濾膜 -80℃ 保存。附著細(xì)菌反硝化功能基因擴增與熒光定量分析委托上海美吉生物科技有限公司進行。DNA濃度和純度使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計檢測。反硝化功能基因nirK、nirS和nosZ擴增使用引物及序列見表3。使用ABI7500 型熒光定量PCR儀進行擴增，擴增體系如下：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 16.5 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA 模板2 μL，加無菌ddH2O水補足20 μL。所有樣品進行3次重復(fù)擴增，最后所得功能基因拷貝數(shù)為3次重復(fù)的均值。擴增結(jié)果使用StepOne Software vv2.2.2 進行人工校準(zhǔn)。

表3 定量擴增使用引物及反應(yīng)程序Tab.3 Primer pairs and sequence used in qPCR

1.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析(ANOVA)分析不同日期附著生物膜反硝化速率的差異顯著性，采用OriginPro 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菹草暴發(fā)生長特征

春季沂河臨沂城區(qū)段菹草生長呈單峰變化模式(圖3)，暴發(fā)生長階段，菹草生物量呈指數(shù)增長趨勢。3月下旬，6個監(jiān)測點均有菹草零星出現(xiàn)，生物量(鮮重)為20～114 g/m2；隨著水溫升高，菹草生長加速，4月上旬，河岸淺水區(qū)菹草接近水面，分布面積明顯增加，仍呈點狀分布；4月中旬，菹草進入暴發(fā)生長階段，生物量增長迅速(860～1926 g/m2)，菹草沿河呈帶狀分布，寬度為30～50 m，隨水溫升高菹草擴展速度加快，菹草帶明顯增大。5月1日前后，在S3～S4河段，菹草布滿河面，蓋度在80%以上(圖2)，菹草生物量、蓋度持續(xù)增加，菹草進入繁殖期，結(jié)實大量芽殖體，菹草生長進入穩(wěn)定階段。5月8日，6個采樣點生物量均達到最大(1817～3334 g/m2)，在水面附近形成致密的冠層，分別為3月27日生物量的58.37、44.82、29.25、54.04、56.97、90.85倍。

圖3 菹草暴發(fā)性生長階段生物量變化Fig.3 Curves of Potamogeton crispus biomass during burst explosive growing stage

2.2 菹草附著生物膜反硝化作用顯著增強

菹草暴發(fā)生長階段，各采樣點菹草附著生物膜反硝化速率迅速升高(圖4)，與菹草生物量變化趨勢一致。4月3日，各采樣點菹草附著生物膜的反硝化速率均處于最低水平(2.12～8.38 μmol/(m2·h))。隨著菹草生物量的增加和水溫的升高，菹草附著生物膜反硝化速率顯著升高，且明顯高于沉積物的。暴發(fā)生長階段，不同日期菹草附著生物膜反硝化作用差異顯著，5月1日-5月8日，各采樣點菹草附著生物膜的反硝化速率達到最大，分別為936.97、1192.82、1728.39、1337.33、686.71、424.18 μmol/(m2·h)。暴發(fā)生長期間，菹草附著生物膜反硝化脫氮遠超過厭氧氨氧化，占比達77%～96%。與菹草生物膜反硝化相比，沉積物的反硝化速率相對較低，且變化幅度較小(15.10～49.24 μmol/(m2·h))(圖4b)。

圖4 暴發(fā)生長期間菹草附著生物膜反硝化、厭氧氨氧化和沉積物反硝化速率 (箱圖的上方和下方的線段分別表示第三四分位數(shù)和第一四分位數(shù)，箱圖中間 的線段表示中位數(shù)，箱圖外最上方和最下方的線段表示范圍從第5百分位到第95百分位)Fig.4 Rates of denitrification and anammox in epiphytic biofilms on Potamogeton crispus and rates of denitrification in sediments (Each box indicates the 25th and 75th percentiles, and horizontal line indicates median value, and whisker shows range from the 5th to 95th percentile)

2.3 菹草附著生物膜增多

暴發(fā)生長階段，隨著菹草的快速生長，附著物干重逐漸增加，總細(xì)菌豐度、反硝化細(xì)菌功能基因nirK、nirS和nosZ豐度以及TN、TOC含量均顯著增加(圖5)。菹草附著物TOC含量(16.33～98.21 mg/g)和TN含量(1.65～4.56 mg/g)較高，附著物的養(yǎng)分量豐富，可為附著生物進行反硝化作用提供豐富的碳源和氮源。

圖5 菹草暴發(fā)生長期間附著生物膜各指標(biāo)變化特征Fig.5 Variation characteristics of epiphytic biofilms on Potamogeton crispus during explosive growing stage

2.4 水體氮負(fù)荷變化

圖6 菹草暴發(fā)生長期間水體氮濃度變化 Fig.6 Variation characteristics of nitrogen concentration in water during Potamogeton crispus explosive growing stage

3 討論

3.1 菹草附著生物膜成為反硝化作用熱點

春末夏初，在菹草暴發(fā)生長階段(4月中旬-5月中旬)，沂河、祊河城區(qū)段菹草生物量可達1817～3334 g/m2，覆蓋面積可達30%～90%。當(dāng)按菹草單位葉表面積來計算附著生物膜的反硝化速率時，它遠低于沉積物的反硝化速率，但當(dāng)按單位河流面積計算時，附著生物膜的反硝化速率則高于沉積物的。以5月1日各采樣點為例，菹草附著生物膜的反硝化速率高達424.18～1728.39 μmol/(m2·h) ，而沉積物反硝化速率為24.53～62.45 μmol/(m2·h)，是表層沉積物反硝化速率的17.29～29.09倍，占該日通過反硝化作用氮去除總量的96%，成為反硝化作用的熱點區(qū)域。在菹草暴發(fā)期間，菹草生物膜通過反硝化作用產(chǎn)生的N2可占河流反硝化脫氮作用的70%～97% (圖4b)。類似的高反硝化速率在其他富營養(yǎng)化水體亦有發(fā)現(xiàn)，藍藻水華期太湖水柱的反硝化速率可達(534.45±242.18)～(1614.52±301.57) μmol/(m2·h)[25]，Hudson河岸帶入侵植物菱Trapanatans豐富的區(qū)域反硝化速率高達1541.7～2958.3 μmol/(m2·h)[10]。

3.2 菹草的科學(xué)管理建議

研究表明，當(dāng)菹草生物量超過2000 g/m2即可視為過度生長(暴發(fā))[12]，依據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，本研究6個監(jiān)測點中有5個點達到了暴發(fā)水平。目前相關(guān)管理部門普遍認(rèn)為徹底清除菹草是解決菹草引發(fā)的水質(zhì)污染問題的有效方法。本研究認(rèn)為，通過科學(xué)管理，充分利用菹草強大的養(yǎng)分吸收功能和附著生物膜高效的反硝化脫氮功能降低水污染負(fù)荷更有助于解決問題，提高河流生態(tài)系統(tǒng)的服務(wù)功能。建議如下：

1)構(gòu)建鑲嵌型水生植物群落。可在沂河菹草區(qū)種植本地物種金魚藻、穗狀狐尾藻、黑藻(HydrillaverticillataRoyle)等沉水植物，春末生根發(fā)芽，夏初菹草衰亡時長至水面，使沉水植物群落有效交替，充分發(fā)揮沉水植物附著生物膜的生態(tài)功能，可緩解菹草衰亡帶來的不利影響。

2)適度收割。合理地收割既有利于沉水植物的恢復(fù)和生長，又可緩解生物量過度集中于水體表層的趨勢，提高群落持續(xù)凈化水質(zhì)的穩(wěn)定性。在菹草生長中期對其進行60%～80%收割，可控制菹草過度生長，并維持水體養(yǎng)分負(fù)荷在較低水平[29]。因此，可以通過適時、適量收割來控制沂河城區(qū)段菹草暴發(fā)，理想割草時間為4月下旬，此時芽殖體尚未發(fā)育成熟，避免來年菹草大面積發(fā)生。使其既能充分發(fā)揮其生物脫氮作用，又可避免因密集衰亡分解對水環(huán)境造成的負(fù)面影響。

3)調(diào)控水位。假設(shè)透明度保持不變，水位提高1 m，水下太陽輻照度將降低56.5%，可顯著降低菹草所需的光照，從而抑制菹草生長[30]。4月是沂河祊河菹草生長的關(guān)鍵時期，在條件允許的情況下，可以利用橡膠壩的調(diào)蓄功能適當(dāng)增加河流蓄水量，抬高水位，進而抑制其過度生長。

4 結(jié)論

1)4月上旬-5月初為營養(yǎng)豐富的沂河菹草暴發(fā)增長期，生物量增加迅速，5月8日監(jiān)測點最大生物量為1817～3334 g/m2。

2)暴發(fā)生長階段，菹草附著生物膜厚度和干重逐漸增加，反硝化功能基因豐度、TOC、TN均顯著增加，為附著生物膜反硝化作用提供了豐富的能源和微環(huán)境條件。

3)暴發(fā)生長期，菹草附著生物膜成為反硝化作用熱點。菹草附著生物膜反硝化作用最大速率為424.18～1728.39 μmol/(m2·h)，是表層沉積物反硝化作用的17.29～29.09倍。菹草附著生物膜反硝化作用是沂河臨沂城區(qū)段春季生態(tài)系統(tǒng)氮去除的重要環(huán)節(jié)，環(huán)境意義重大。

4)可通過構(gòu)建鑲嵌型沉水植物群落、適度收割、調(diào)控水位等措施來緩解菹草暴發(fā)，提高河流生態(tài)系統(tǒng)的服務(wù)功能。