汪雪蓮，劉鵬展，崔春*, 劉國鋒

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院,廣州 510640; 2.湖南菲勒生物技術有限公司，長沙 410205)

魚皮膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白,Ⅰ型膠原蛋白是由1條α1鏈(G9M6I5)和2條α2鏈(G9M6I6)三螺旋組成。每條肽鏈的序列特征為Gly-X-Y 的重復序列,X主要為脯氨酸(Pro),Y一般為羥脯氨酸(Hyp)和丙氨酸(Ala)[1]。

膠原蛋白水解產物被報道具有多種生理活性,其中以膠原三肽GPH[2]、GPA[3]、GHK[4]活性最為突出。GPH 具有易吸收、低過敏性、預防疾病等優(yōu)點,Sontakke等[5]研究發(fā)現GPH 能跨腸單層細胞進行轉運進入血漿并在人體內穩(wěn)定運輸,有利于機體吸收;Kim等[6]用含34 mg/kg GPH 的膠原蛋白水解物處理經丙酮誘導后皮膚干燥的小鼠,發(fā)現GPH 可以有效地維持膠原結構形態(tài)以及預防皮膚干燥;滿帥[7]報道 200 μg/mL的GPH可有效防治大鼠地塞米松性骨質疏松;Deng等[8]研究發(fā)現200 mg/kg 的GPA可通過降低氧化應激保護腸道損傷;艾麗奇報道GPA 有潛在的抗光老化作用,100 μmol/L GPA 處理光損傷成纖維細胞,細胞存活率為75.34%，此外，GPA還可抑制膠原酶的產生、抑制Ca2+離子內流和改善線粒體膜電位流失。

膠原三肽具有以上生理活性,所以被廣泛應用于美容、保健食品行業(yè)。初鑫等[9]研究了鱈魚皮膠原蛋白肽果汁飲料可有效預防和延緩皮膚光老化;金辰也等[10]制備了含有蘋果汁、膠原三肽的美容飲料,可以防止皮膚干燥，增加皮膚光滑度。同時膠原三肽也可以促進愈傷組織、骨骼修復、礦物質吸收,使其能夠作為食品營養(yǎng)補充劑或強化劑,通過口服來調節(jié)人體機能。Tang等[11]研究發(fā)現膠原三肽可以有效抑制動脈粥樣硬化,所以將其應用于功能食品中可以預防多種疾病以及輔助治療某些疾病。

膠原蛋白肽的酶解工藝一般以內切蛋白酶水解為主,水解產物分子量較大,肽的種類多樣,幾乎不含有GPH、GPA 等三肽。鑒于此,本文優(yōu)化了內切蛋白酶與實驗室篩選得到的三肽基肽酶(解淀粉芽孢桿菌蛋白酶)分步水解羅非魚魚皮膠原蛋白,并對酶解產物中膠原三肽進行了定性和定量分析,以期為膠原三肽的工業(yè)化制備提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮:汕尾市五豐海洋生物科技有限公司;堿性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶(Trypsin)、復合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase):諾維信生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(Papain):南寧東恒華道生物科技有限責任公司;膠原三肽Gly-Pro-Hyp(GPH)、無水乙醇、甲醛、鹽酸、氫氧化鈉:均為分析純。

從中國南海海泥中篩選出的解淀粉芽孢桿菌SWJS22(BacillusamyloliquefaciensSWJS22,CGMCC No.8425),由華南理工大學輕工與食品學院食品生物技術實驗室提供。將解淀粉芽孢桿菌接種于含有1%羅非魚魚皮和0.5%麩皮的液體培養(yǎng)基的三角瓶中,在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后, 過濾得到的上清液作為粗酶液。

1.2 儀器與設備

FA2204B精密電子天平 上海精密科學儀器有限公司;SCIENTZ-18N 冷凍干燥機 浙江賽德儀器設備有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 江陰市保利科研器械有限公司;HYP-308消化爐、KDN-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;DZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;TS100微型旋渦混合儀 杭州瑞誠儀器有限公司;U-3000液相色譜儀 Thermo Fisher Scientific有限公司;Agilent 1290超高效液相色譜-質譜儀 Bruker科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚皮膠原蛋白內切蛋白酶酶解條件優(yōu)化

羅非魚魚皮與水等重量混合,加熱至110 ℃保持30 min,使魚皮膠原蛋白解聚后[12],加入羅非魚魚皮重量0.25%的商品化酶制劑(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶),55 ℃酶解3.5 h后取出于100 ℃沸水中滅酶15 min。測定蛋白質的回收率和水解度。魚皮膠原蛋白肽蛋白質含量的測定參考凱氏定氮法。

魚皮膠原蛋白肽水解度的測定采用甲醛滴定法,計算公式如下:

采用凱氏定氮法(Kjeldahl nitrogen)測定魚皮膠原蛋白肽與酶解上清液中的總氮,計算公式如下[13]:

式中：m上清液指酶解上清液的質量,N上清液指酶解上清液的含氮量,my指加入魚皮膠原蛋白的質量,Ny指魚皮膠原蛋白的含氮量。

1.3.2 解淀粉芽孢桿菌蛋白酶酶解工藝優(yōu)化

分別以羅非魚魚皮內切蛋白酶(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶)酶解產物為底物,添加液體質量5%的解淀粉芽孢桿菌粗酶液,55 ℃水解不同時間后取出于100 ℃沸水中滅酶15 min,得到魚皮膠原蛋白肽,測定其水解度變化。

1.3.3 魚皮膠原蛋白肽分子量分布情況

采用HPLC法測定魚皮膠原蛋白肽的分子量分布;分別配制相關酶處理的蛋白肽溶液5 mg/mL,過0.22 μm 膜處理,采用TSKgel G2000 SWXL進行液相測定。以含有0.1% TFA 的乙腈(60%)為流動相,流速為0.8 mL/min,等度洗脫進行分析。以標準品分子量對數與洗脫時間做回歸方程,計算各樣品的肽分子量分布[14]。

1.3.4 魚皮膠原蛋白肽的半定量檢測

將膠原蛋白酶解產物滅酶、濃縮、冷凍干燥后收集其粉末,取0.1 g樣品在10 mL 流動相中溶解,經0.45 μm 過濾器過濾,上機分析。

1.3.4.1 高效液相色譜分析

色譜柱:Jupiter 4u Proteo 90A;流動相:A為0.1%三氟乙酸,B為乙腈∶甲醇為1∶4;檢測器:UV 214 nm;流速:0.3 mL/min;洗脫時間:50 min;等度洗脫 (A∶B為95∶5);進樣量:10 μL。

1.3.4.2 液質聯用分析膠原蛋白肽

使用UPLC-MS/MS鑒定膠原蛋白肽,具體實驗操作:色譜流動相經分流閥分流后進入質譜,分流比控制在9∶1(10% 進入質譜)。將柱子連接到HPLC上,在柱溫 40 ℃時,UV 檢測器(214 nm)條件下,流速0.3 mL/min對色譜柱進行約1 h的穩(wěn)定化處理,在穩(wěn)定化處理之后,進樣量10 μL條件下分析標準品和樣品,用面積標準化計算含量。

1.3.5 魚皮膠原蛋白肽中GPH 的檢測

以商品化GPH(純度為99%)為標準樣品,做標準曲線。在214 nm處,采用HPLC法測定魚皮膠原蛋白酶解產物中GPH 的含量。

1.4 數據處理

重復實驗3次,結果以“平均值±標準差”的形式表示,采用Excel 2016和Origin 2021軟件進行圖表繪制和方差分析。數據之間的顯著性差異定義為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 魚皮膠原蛋白的蛋白酶的篩選

圖1 魚皮膠原蛋白的蛋白質回收率(a)、水解度(b)的變化Fig.1 Changes of protein recovery rate (a) and hydrolysis degree (b) of fish skin collagen

使用不同蛋白酶對羅非魚魚皮膠原蛋白進行酶解處理,由于不同酶的酶切位點不同,其水解產物的蛋白回收率和水解度會存在差異[15]。魚皮膠原蛋白的蛋白質回收率和水解度高低順序均為中性蛋白酶<堿性蛋白酶<復合蛋白酶<木瓜蛋白酶<胰蛋白酶。胰蛋白酶的酶解效率最高,蛋白質回收率達到90.71%,水解度為12.16%,顯著高于其他蛋白酶,歸因于胰蛋白酶在魚皮膠原蛋白中酶切位點較多,使得其蛋白質回收率和水解度偏大。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶水解產物的蛋白回收率和水解度分別為88.59%和9.45%,87.59%和7.5%。中性蛋白酶的蛋白質回收率僅為84.79%,水解度為5.74%,這可能是中性蛋白酶在魚皮膠原蛋白中的酶切位點較少,使得其酶解肽段較大。

酶解產物感官評價表明，胰蛋白酶酶解產物苦味最重,木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶僅有微弱的苦味,中性蛋白酶和復合蛋白酶幾乎無苦味。一般而言，酶解產物的苦味與肽分子量、肽的疏水性以及一級結構有關[16]。綜合考慮酶解效率和感官評價,選擇木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶進一步進行酶解處理。

2.2 解淀粉芽孢桿菌蛋白酶二次水解魚皮膠原蛋白肽

圖2 雙酶分步水解作用對魚皮膠原蛋白肽水解度的變化Fig.2 Changes of hydrolysis degree of fish skin collagen peptide by stepwise dual-enzyme hydrolysis

隨著酶解時間的增加,雙酶分步水解使得魚皮膠原蛋白水解度總體呈現上升的趨勢,可能是單一蛋白酶的酶切位點有限,雙酶分步水解作用可以達到協(xié)同增效的效果[17]。

解淀粉芽孢桿菌蛋白酶在堿性蛋白酶酶解的基礎上進一步酶解6 h后魚皮膠原蛋白肽水解度為14.78%,酶解12 h后魚皮膠原蛋白肽水解度為18.40%,酶解15 h后水解度為18.80%,但酶解12 h和酶解15 h之間沒有顯著性差異。綜合考慮能耗與效率,選擇酶解處理12 h得到的魚皮膠原蛋白肽進行進一步研究;解淀粉芽孢桿菌蛋白酶在木瓜蛋白酶酶解的基礎上進一步酶解12 h后水解度為14.64%,酶解效果顯著低于解淀粉芽孢桿菌蛋白酶與堿性蛋白酶分步酶解組合。

2.3 魚皮膠原蛋白分子量分布測定

魚皮膠原蛋白肽分子量分布見圖3。

圖3 魚皮膠原蛋白肽分子量分布Fig.3 The molecular weight distribution of fish skin collagen peptide注:解淀粉芽孢桿菌蛋白酶(Bacillus amyloliquefaciens protease)簡稱 Baq Pro。

由圖3可知,經單一酶處理后再經解淀粉芽孢桿菌蛋白酶二次酶解處理,多數膠原蛋白肽被水解成小分子肽段,主要是<1 kDa的肽段,其含量為堿性蛋白酶+解淀粉芽孢桿菌蛋白酶(86.61%)>木瓜蛋白酶+解淀粉芽孢桿菌蛋白酶(80.40%)>堿性蛋白酶(63.00%)>木瓜蛋白酶(59.13%);其中解淀粉芽孢桿菌蛋白酶在堿性蛋白酶酶解的基礎上進一步酶解后酶解液中>2 kDa的肽段含量極低，為2.28%,其在木瓜蛋白酶酶解的基礎上進一步酶解后酶解液中>2 kDa的肽段含量為10.30%,說明經堿性蛋白酶酶解后再經解淀粉芽孢桿菌蛋白酶處理得到的魚皮膠原蛋白肽分子量極小,膠原蛋白幾乎全部水解成小分子肽段(二肽、三肽等),其酶解產物小分子肽段的存在也預示著酶解產物具有較高的生物活性,小分子肽段也便于人體利用吸收[18]。

2.4 UPLC/MS/MS半定量分析膠原蛋白肽中膠原三肽的種類

將上述堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶與解淀粉芽孢桿菌蛋白酶分步水解得到的兩種魚皮膠原蛋白肽，經滅酶、過濾、濃縮和冷凍干燥后,得魚皮膠原蛋白肽粉。兩種魚皮膠原蛋白肽粉均為白色粉末,在5%和10%濃度下無明顯苦味和異味，表明采用解淀粉芽孢桿菌蛋白酶對內切蛋白酶的水解產物有一定的脫苦效果。采用UPLC-MS/MS對上述兩組酶解產物進行半定量分析,以比較不同蛋白酶組合對膠原蛋白肽種類和含量的影響,結果見表1。

表1 UPLC-MS/MS鑒定結果Table 1 The identification results of UPLC-MS/MS

由表1可知,酶解產物中鑒定出多種膠原三肽,包括GPH、GPA、HAG、LPG、GPV、PGR、GPT 等,其中以GPA、GPH 和HAG 的離子強度最大。從離子強度來看,堿性蛋白酶+解淀粉芽孢桿菌蛋白酶分步水解后酶解產物中GPA 和GPH 的離子強度明顯高于木瓜蛋白酶+解淀粉芽孢桿菌蛋白酶組合。周先艷[19]研究發(fā)現經堿性蛋白酶酶解鱈魚皮膠原蛋白,其酶解液中GPA、GPS、GPR肽段含量較多;同樣艾麗奇用堿性蛋白酶處理后也得到GPA肽段,并驗證了GPA具有潛在抗光老化的活性;Kim 研究發(fā)現70 μg/mL GPH作用人體真皮成纖維細胞可以有效促進透明質酸,減少水分流失以及促進I型膠原蛋白的合成;Wang等[20]從豬、牛、羅非魚、母雞表皮經木瓜蛋白酶酶解制備的膠原蛋白水解物中鑒定出了Gly-Pro-Hyp肽段,并且可減輕經 UVA 誘導的人體真皮成纖維細胞損傷。

目前考慮到GPH能改善皮膚以及具有多種生物活性已有多篇文獻報道,故采用HPLC法對堿性蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌蛋白酶分步酶解產物中GPH含量進行測定,結果表明酶解產物中GPH 含量達到1.46%。

3 結論

魚皮膠原蛋白經胰蛋白酶酶解后其水解度最高，為12.16%,但酶解液苦味明顯,影響產品的風味以及口感，所以選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶作為酶解的酶制劑。

堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產物為底物,添加解淀粉芽孢桿菌蛋白酶于55 ℃水解12 h后,其水解度分別從7.50%和9.45%增加到18.40%和14.64%。分子量分布測定顯示，酶解產物中<500 Da的肽段占比分別為54.28%和48.90%。

經UPLC-MS/MS分析鑒定得到經堿性蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌蛋白酶分步水解處理后,酶解液中的特征性肽段主要是GPA、GPH、HAG 等,用HPLC法測定GPH 含量得出分步水解后酶解產物中GPH 含量達到1.46%。

本研究通過一系列酶解條件探索,最終得到了富含GPA、GPH 等小分子膠原三肽的酶解混合物,并且其酶解產物的口感、風味較佳(輕微苦味)。為進一步提高膠原蛋白附加值提供了數據支撐,也為后期膠原蛋白作為功能性食品原料以及食品營養(yǎng)與美容添加劑奠定了基礎,同時促進了膠原蛋白的再次利用。