楊元英

(廣西大學(xué)，南寧 530004)

牡蠣含有豐富的蛋白質(zhì)和微量元素，具有降血壓、抑菌、抗氧化等作用，以牡蠣為原材料進(jìn)行深加工，制取生物活性肽成為當(dāng)前牡蠣深加工的重要方式[1-2]。牡蠣多肽一般采用酶水解的方式，過(guò)程中影響因素較多，因此對(duì)牡蠣多肽提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析成為提高多肽提取率的重要措施[3-4]。本文通過(guò)酶水解的方式，對(duì)牡蠣多肽提取率影響因素進(jìn)行綜合分析，確定最佳提取工藝條件，并對(duì)牡蠣多肽的抗氧化活性進(jìn)行研究，為牡蠣的深加工提供借鑒。

1 樣品制備與實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法

將新鮮牡蠣肉瀝干處理后稱取200 g，加入5 000 mL蒸餾水，使用勻漿機(jī)對(duì)其進(jìn)行攪拌處理，放置于50 ℃條件下進(jìn)行振蕩搖勻，混合均勻后在90 ℃條件下進(jìn)行水浴，水浴時(shí)間10 min，水浴完成后在5 000 r/min條件下進(jìn)行離心處理，離心時(shí)間10 min，離心完成后收集上清液[5]。將收集好的牡蠣上清液進(jìn)行超濾處理，使用1 000 Da的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集牡蠣上清液過(guò)濾液，此時(shí)收集到的牡蠣多肽過(guò)濾液分子量小于1 000 Da；將超濾膜更換為360 Da，對(duì)收集到的過(guò)濾液再次進(jìn)行過(guò)濾，此時(shí)收集到的牡蠣多肽過(guò)濾液分子量大于360 Da，小于1 000 Da。收集兩次過(guò)濾后的濾渣，放置于500 mL圓底蒸發(fā)瓶中，在40 ℃條件下進(jìn)行干燥處理，獲取牡蠣淡黃色多肽粉末[6]。

2 牡蠣多肽提取工藝優(yōu)化分析

為了測(cè)定牡蠣多肽提取過(guò)程中加酶量對(duì)多肽酶水解度的影響，設(shè)定牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，設(shè)定酶解反應(yīng)時(shí)間為5 h，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，酶的添加量分別設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%，酶解完成后測(cè)定牡蠣多肽酶水解度[7]。加酶量對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響見(jiàn)表1。

表1 加酶量對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響Table 1 Effect of enzyme addition amount on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides %

由表1可知，當(dāng)牡蠣肉混合溶液料液比一定時(shí)，隨著加酶量的升高，酶與牡蠣多肽分子的接觸機(jī)會(huì)增加，同一時(shí)間內(nèi)的牡蠣多肽分子水解數(shù)量增加，因此牡蠣多肽酶水解度不斷升高，當(dāng)加酶量高于3%時(shí)，牡蠣多肽酶水解度未發(fā)生明顯變化，主要原因是隨著加酶量的升高，牡蠣肉混合溶液中多肽分子已經(jīng)被酶充分水解，因此加酶量對(duì)牡蠣多肽酶水解度不會(huì)再帶來(lái)較大的影響。利用酶解法進(jìn)行牡蠣多肽水解提取時(shí)，最佳加酶量為3%，此時(shí)牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測(cè)定牡蠣多肽提取過(guò)程中酶解時(shí)間對(duì)多肽酶水解度的影響，設(shè)定牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，酶解時(shí)間分別設(shè)定為3，4，5，6，7 h，酶解完后測(cè)定牡蠣多肽酶水解度[8]。酶解時(shí)間對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響見(jiàn)表2。

表2 時(shí)間對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響Table 2 Effect of time on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表2可知，在前5 h的水解過(guò)程中，牡蠣多肽酶水解度快速上升，當(dāng)超過(guò)5 h后，牡蠣多肽酶水解度上升緩慢，主要原因是酶解反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，牡蠣肉混合溶液中多肽分子不斷減少，此時(shí)酶活力也開(kāi)始下降，因此牡蠣多肽酶水解度趨于平緩狀態(tài)。利用酶解法進(jìn)行牡蠣多肽水解提取時(shí)，最佳酶解時(shí)間為5 h，此時(shí)牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測(cè)定牡蠣多肽提取過(guò)程中溶液料液比對(duì)多肽酶水解度的影響，設(shè)定酶解時(shí)間為5 h，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，牡蠣肉混合溶液料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，酶解完后測(cè)定牡蠣多肽酶水解度[9]。牡蠣肉混合溶液料液比對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響見(jiàn)表3。

表3 料液比對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響Table 3 Effect of solid-liquid ratio on the enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表3可知，當(dāng)料液比大于1∶2時(shí)，隨著料液比的降低，牡蠣多肽酶水解度快速升高，當(dāng)料液比小于1∶2時(shí)，隨著料液比的降低，牡蠣多肽酶水解度快速降低，主要原因是隨著料液比的降低，酶解反應(yīng)物濃度降低，酶解產(chǎn)物濃度降低，因此酶活力的抑制作用降低，促進(jìn)酶解反應(yīng)速度提升，隨著料液比的進(jìn)一步降低，反應(yīng)物中的水分含量增加，酶與反應(yīng)物的接觸面積降低，同時(shí)酶活力開(kāi)始降低。利用酶解法進(jìn)行牡蠣多肽水解提取時(shí)，最佳料液比為1∶2，此時(shí)牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測(cè)定牡蠣多肽提取過(guò)程中酶解反應(yīng)溫度對(duì)多肽酶水解度的影響，設(shè)定酶解時(shí)間為5 h，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溶液pH值為7.5，牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，酶解反應(yīng)溫度為40，45，50，55，60 ℃，酶解完后測(cè)定牡蠣多肽酶水解度[10]。酶解反應(yīng)溫度對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響見(jiàn)表4。

表4 溫度對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響Table 4 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表4可知，當(dāng)酶解反應(yīng)溫度低于50 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，牡蠣多肽酶水解度逐漸上升，主要原因是隨著溫度的上升，反應(yīng)物的內(nèi)能不斷增加，酶與牡蠣多肽分子接觸機(jī)會(huì)增加，酶解反應(yīng)速度也不斷上升。酶是一種具有活性的蛋白類物質(zhì)，當(dāng)溫度超過(guò)一定的閾值時(shí)，酶的部分催化活性逐漸降低，酶活力也開(kāi)始減弱，因此當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，牡蠣多肽酶水解度開(kāi)始降低。利用酶解法進(jìn)行牡蠣多肽水解提取時(shí)，最佳酶解溫度為50 ℃，此時(shí)牡蠣多肽酶水解度最大。

為了測(cè)定牡蠣多肽提取過(guò)程中溶液pH對(duì)多肽酶水解度的影響，設(shè)定酶解時(shí)間為5 h，加酶量為3%，酶解反應(yīng)溫度為50 ℃，牡蠣肉混合溶液料液比為1∶3，酶解反應(yīng)溶液pH值為6.5，7，7.5，8，8.5，酶解完后測(cè)定牡蠣多肽酶水解度[11]。牡蠣肉混合溶液pH對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響見(jiàn)表5。

表5 pH對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響Table 5 Effect of pH on the enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由表5可知，當(dāng)酶解反應(yīng)溶液pH值小于8時(shí)，牡蠣多肽酶水解度逐漸上升，主要原因是溶液pH值維持了酶活性的穩(wěn)定性，促進(jìn)酶與牡蠣多肽分子的結(jié)合，提高酶解反應(yīng)速度。當(dāng)酶解反應(yīng)溶液pH值大于8時(shí)，牡蠣多肽酶水解度逐漸下降，主要原因是溶液pH值破壞了酶活性的穩(wěn)定性，酶與牡蠣多肽分子的結(jié)合度降低，催化速度也開(kāi)始降低。利用酶解法進(jìn)行牡蠣多肽水解提取時(shí)，最佳pH值為8，此時(shí)牡蠣多肽酶水解度最大。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為保證牡蠣多肽提取過(guò)程效率，本文在進(jìn)行提取工藝優(yōu)化時(shí)，設(shè)定加酶量為3%，料液比為1∶2，以酶解反應(yīng)時(shí)間(A)、酶解溫度(B)以及pH(C)為自變量，以牡蠣多肽酶水解度為因變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[12]。牡蠣多肽酶水解度響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 牡蠣多肽酶水解度響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 6 Design scheme and results of response surface experiment of enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

對(duì)牡蠣多肽酶水解度影響因素進(jìn)行交互作用，得出牡蠣多肽酶水解度響應(yīng)面圖[13]。溫度和時(shí)間與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖見(jiàn)圖1，時(shí)間和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2，溫度和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3。響應(yīng)面的坡度陡峭程度表示影響因素對(duì)牡蠣多肽酶水解度交互時(shí)是否具有顯著性，坡度平緩表示交互關(guān)系不顯著，坡度陡峭表示交互關(guān)系顯著[14]。

圖1 溫度和時(shí)間與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface diagrams of relationship between temperature, time and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由圖1可知，隨著酶解溫度和酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，牡蠣多肽酶水解度先上升后下降，在酶解反應(yīng)時(shí)間4 h和酶解溫度45 ℃的條件下，牡蠣多肽酶水解度達(dá)到最大值49.5%，從響應(yīng)面變化趨勢(shì)可以看出酶解反應(yīng)時(shí)間和酶解溫度對(duì)牡蠣多肽酶水解度交互時(shí)均具有顯著性影響。

圖2 時(shí)間和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagrams of relationship between time, pH and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由圖2可知，酶解反應(yīng)時(shí)間與pH對(duì)牡蠣多肽酶水解度交互時(shí)，酶解反應(yīng)時(shí)間比pH對(duì)牡蠣多肽酶水解度的影響更加顯著，牡蠣多肽酶水解度隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。

圖3 溫度和pH與牡蠣多肽酶水解度的關(guān)系響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagrams of relationship between temperature, pH and enzymatic hydrolysis degree of oyster polypeptides

由圖3可知，酶解溫度與pH對(duì)牡蠣多肽酶水解度交互時(shí)，二者對(duì)水解度均不具有顯著性影響。

經(jīng)過(guò)牡蠣多肽酶水解度影響因素交互實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)最佳提取工藝條件為酶解溫度49.29 ℃、酶解反應(yīng)時(shí)間4.38 h、pH 8、料液比1∶2、加酶量3%，預(yù)測(cè)牡蠣多肽酶水解度可達(dá)50.8%。對(duì)牡蠣多肽酶水解工藝條件進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得出牡蠣多肽酶水解度為49.7%～50.2%，與預(yù)測(cè)值具有較高的吻合度。將獲取到的牡蠣多肽水解液用1 000 Da過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾，將濾液用360 Da過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾，將兩次得到的濾液進(jìn)行烘干，稱取多肽重量。牡蠣多肽3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 牡蠣多肽3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of three validation experiments of oyster polypeptides

由表7可知，使用200 g牡蠣肉水解后，按照優(yōu)化后的工藝條件，提取到的牡蠣多肽平均值為1.28 g，平均提取率為0.64%。

3 牡蠣多肽抗氧化活性分析

牡蠣多肽抗氧化活性可通過(guò)牡蠣多肽對(duì)鐵離子還原能力和羥基自由基清除率兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行反饋[15]。牡蠣多肽對(duì)鐵離子還原能力測(cè)定過(guò)程中，稱取提取完成的牡蠣多肽0.5 g，加入250 mL蒸餾水定容，混合均勻后，將溶液稀釋至濃度為0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蠣多肽溶液，分別加入濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液1 mL，混合均勻后加入濃度為1%的FeSO4溶液，混合均勻后在50 ℃條件下進(jìn)行水浴，保溫20 min，冷卻后，在700 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色對(duì)照，測(cè)定牡蠣多肽對(duì)鐵離子還原能力。牡蠣多肽對(duì)鐵離子還原能力測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表8。

表8 牡蠣多肽對(duì)鐵離子還原能力測(cè)定數(shù)據(jù)Table 8 Determination data of reduction ability of oyster polypeptides to iron ion

由表8可知，隨著牡蠣多肽溶液濃度的上升，對(duì)鐵離子的還原能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溶液濃度為2 mg/mL時(shí)，牡蠣多肽溶液對(duì)鐵離子的還原能力可達(dá)0.84，數(shù)據(jù)表明牡蠣多肽具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。

牡蠣多肽對(duì)羥基自由基清除率測(cè)定時(shí)，取濃度為0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蠣多肽溶液各2 mL，加入2 mL蒸餾水，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定溶液吸光值，作為空白樣品吸光值。測(cè)定牡蠣多肽對(duì)羥基自由基清除能力時(shí)，取濃度為0.5，1，1.5，2 mg/mL的牡蠣多肽溶液各2 mL，加入2 mL濃度為0.09 mol/L的水楊酸乙醇溶液，混合均勻后加入濃度為0.08 mol/L的雙氧水，靜置混合均勻后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定溶液吸光值，作為待檢測(cè)樣品吸光值，最后計(jì)算牡蠣多肽對(duì)羥基自由基清除率。牡蠣多肽對(duì)羥基自由基清除率測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表9。

表9 牡蠣多肽對(duì)羥基自由基清除率測(cè)定數(shù)據(jù)Table 9 Determination data of hydroxyl radical scavenging rate of oyster polypeptides

由表9可知，隨著牡蠣多肽溶液濃度的上升，對(duì)羥基自由基的清除率逐漸上升，當(dāng)溶液濃度為2 mg/mL時(shí)，牡蠣多肽溶液對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)59%，數(shù)據(jù)表明牡蠣多肽具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

4 結(jié)論

本文以牡蠣多肽提取率為目標(biāo)，對(duì)牡蠣多肽提取工藝影響因素進(jìn)行優(yōu)化，確定提取過(guò)程最佳提取工藝。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的方式對(duì)牡蠣多肽的鐵離子還原能力和羥基自由基清除率進(jìn)行分析，表明牡蠣多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。