孔令春，鄒 紅，李景景，凌 蕓，唐慧新

0 引言

視網膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)作為一種缺血缺氧性視網膜血管疾病，黃斑水腫(macular edema，ME)和視網膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)是其最常見的并發(fā)癥，也是導致RVO患者視力下降的主要原因[1]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)之間動態(tài)的平衡在新生血管形成過程中起著重要的作用[2]，已得到廣泛共識。而缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉錄因子，是調節(jié)細胞內氧代謝的關鍵物質，能誘導下游基因VEGF的表達[3]，同時也參與PEDF翻譯后蛋白水平的下調機制[4]。

桃紅四物湯是一種經典的活血化瘀中藥方劑，由桃仁、紅花、熟地黃、當歸、芍藥、川芎等6種藥材組成。多項研究報道該方治療心臟、腦等大血管的阻塞效果較好[5-7]。前期研究發(fā)現以桃紅四物湯為基礎方，加上黃芪、枳殼、香附、茯苓、白術、薏苡仁益氣利水的中藥組成的加味桃紅四物湯，灌胃后視網膜靜脈阻塞模型大鼠可以減輕視網膜出血、滲出、水腫等眼底病變[8]。為了進一步研究該中藥復方對視網膜的保護作用機制，本研究擬建立視網膜Müller細胞缺氧模型，探究加味桃紅四物湯含藥血清對缺氧條件下視網膜Müller細胞VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α表達的影響，為臨床上中藥治療缺血缺氧性視網膜血管疾病提供科學依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物與細胞株SPF級健康SD雄性大鼠20只，體質量250±30g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0008。于上海中醫(yī)藥大學SPF級實驗室常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，環(huán)境濕度50%～60%，自由飲水進食。該實驗動物經上海中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員批準。rMC-1細胞是一種鼠源視網膜Müller細胞系，為實驗室液氮保存。

1.1.2藥物加味桃紅四物湯組成：黃芪20g，當歸12g，生地12g，桃仁9g，紅花9g，赤芍12g，枳殼9g，川芎9g，香附9g，茯苓12g，白術10g，薏苡仁20g?？偣?2味中藥，重143g。上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥房配備。由本院中藥制劑室煎制，將上述藥材浸泡、煎煮(加水煮沸1h后過濾，濾渣加水煮沸1h，合并二煎的濾液)、去渣，濃縮(90℃)至藥液濃度為32g/10mL(含生藥)。

1.1.3主要試劑與儀器戊巴比妥鈉(10g/L)(批號：Lot.No.WS20160401)購自國藥集團化學試劑公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號：11885-084，批號：2366072)、胎牛血清(FBS)(貨號：10099-141，批號：2021472)均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒(貨號：CK04-100T)購自日本DOJINDO公司；PEDF酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：SDR0068)、VEGF ELISA試劑盒(貨號：SDR0041)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號：SD0012)均購自上海司鼎生物科技有限公司；Trizol RNA提取試劑(批號：15596018)購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)試劑盒(貨號：RR420A)購自日本TAKARA；引物由上海司鼎生物科技有限公司合成；STAT3抗體(貨號：ab68153)、p-STAT3抗體(貨號：ab32143)、HIF-1α抗體(貨號：ab179483)均購自美國Abcam公司；β-actin抗體(貨號：SD0034)購自上海司鼎生物科技有限公司。三氣培養(yǎng)箱(中國華儀寧創(chuàng)公司，Smartor 118型)。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備正常SD雄性大鼠隨機分為含藥血清組和空白血清組，每組10只。按照每天1mL/100g分別予加味桃紅四物湯方中藥灌胃，空白血清組給予同等量生理鹽水。給藥3d，第3d灌胃結束后給予禁食，次日晨再灌胃一次。1h后3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，無菌條件下自后腔靜脈采血，靜置3～4h，3000r/min、20min、4℃離心，超凈臺上分離血清，將分離得到的血清置于56℃水浴中30min滅活，微孔濾膜過濾，密封好，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前用空白血清進行稀釋作為含藥血清的低、中、高劑量組。

1.2.2Müller細胞培養(yǎng)及缺氧處理rMC-1細胞復蘇后，使用添加10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃度培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5%CO2，21%O2)，并維持一定的濕度。約1～2d換液1次，細胞生長融合至85%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用完全培養(yǎng)基終止消化后，以1∶3比例傳代，取對數生長期的3～6代細胞用于實驗。缺氧處理為將細胞放入缺氧箱(5%CO2，1%O2)培養(yǎng)6、24、48h。

1.2.3實驗分組及干預實驗分為五組，即正常對照組，缺氧模型組，加味桃紅四物湯低、中、高劑量組，具體干預和培養(yǎng)條件見表1。

表1 各組干預及培養(yǎng)條件

1.2.4CCK-8法檢測細胞活力通過CCK-8實驗明確加味桃紅四物湯含藥血清的干預劑量。向96孔板中每孔接種細胞懸液100μL，使每孔細胞數目至1×105個，然后將96孔板放在培養(yǎng)箱中(37℃, 5%CO2的條件下)常規(guī)培養(yǎng)24h，各組細胞按照分組干預后，每組設6個復孔，向每孔中加入10μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育3h，用酶標儀檢測450nm處的OD值。

1.2.5ELISA檢測VEGF和PEDF分泌收集各組細胞上清液按試劑盒說明操作，每組設3個復孔，在陽性對照正常顯色的前提下，根據說明書對VEGF、PEDF的含量進行測量。

1.2.6Westernblot檢測p-STAT3和STAT3及HIF-1α蛋白的表達收集各組rMC-1細胞，按照蛋白抽提試劑盒說明抽提細胞總蛋白，并采用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，每組分別取20μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜后分別加入p-STAT3、STAT3和HIF-1α一抗體稀釋度分別為1∶2000、1∶2000、1∶1000，以抗體稀釋液配制，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，隨后加入HRP標記的與一抗相對應二抗(1∶20000)，37℃孵育1h。顯色定影之后，用ImageJ圖象處理系統(tǒng)分析目標蛋白條帶的灰度值，蛋白表達量結果以灰密度比值(目的蛋白/β-actin)表示。

1.2.7RealtimePCR檢測VEGF、PEDF、STAT3和HIF-1αmRNA水平收集各組rMC-1細胞，使用Trizol提取細胞總RNA，測定RNA的質量和濃度。應用逆轉錄試劑盒將mRNA合成為cDNA，隨后依照RT-qPCR試劑盒進行VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α mRNA擴增，以GAPDH為內參，引物序列見表2。每個樣品設置3個復孔，反應體系為：cDNA 1μL，上下游引物各1μL，2×Green Mix 10μL，去離子水7μL。反應條件設置為：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)，使用相對表達量2-ΔΔCt法進行分析。

表2 引物序列

2 結果

2.1不同時間各組對缺氧損傷rMC-1細胞活力的影響CCK-8結果顯示(圖1)：在1%O2條件下培養(yǎng)48h，與正常對照組相比，缺氧模型組rMC-1細胞活力明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與缺氧模型組相比，加味桃紅四物湯含藥血清低、中劑量組均可以改善rMC-1細胞缺氧48h的細胞存活率，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而高劑量組對rMC-1細胞缺氧48h的細胞存活率無改善作用，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，故選用加味桃紅四物湯含藥血清低、中劑量組和缺氧48h用于后續(xù)實驗。

圖1 不同時間各組對缺氧損傷rMC-1細胞活力的影響 A:6h;B:24h;C:48h; aP<0.05 vs 正常對照組; cP<0.05 vs 缺氧模型組。

2.2各組對缺氧損傷rMC-1細胞VEGF和PEDF分泌的影響ELISA結果發(fā)現：與正常對照組比較，缺氧模型組細胞上清液VEGF蛋白表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而PEDF蛋白表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，加味桃紅四物湯低、中劑量均可減少缺氧條件下rMC-1細胞VEGF的蛋白表達量，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，但不能增加PEDF的蛋白含量，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果表明，加味桃紅四物湯含藥血清對rMC-1細胞缺氧48h VEGF的分泌有抑制作用，低劑量作用優(yōu)于中劑量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組對缺氧損傷rMC-1細胞VEGF和PEDF分泌的影響 A：ELISA檢測VEGF濃度；B:ELISA檢測PEDF濃度； aP<0.05 vs 正常對照組; cP<0.05 vs 缺氧模型組；eP<0.05 vs 加味桃紅四物湯低劑量組。

2.3各組對缺氧損傷rMC-1細胞p-STAT3、STAT3、HIF-1α蛋白的影響Western blot結果發(fā)現：與正常對照組比較，rMC-1細胞缺氧培養(yǎng)48h后，p-STAT3和HIF-1α的蛋白表達顯著上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而加味桃紅四物湯低、中劑量對兩者在蛋白水平較缺氧模型組均有下調作用，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且低劑量組抑制作用均優(yōu)于中劑量，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與正常對照組比較，rMC-1細胞缺氧培養(yǎng)48h后，STAT3的蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而加味桃紅四物湯含藥血清中劑量對其在蛋白水平較缺氧模型組有上調作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明加味桃紅四物湯含藥血清可減少缺氧48h后rMC-1細胞STAT3的磷酸化，減少HIF-1α的蛋白表達，見圖3，表3。

圖3 Western blot檢測各組rMC-1細胞中p-STAT3、STAT3、HIF-1α蛋白表達條帶圖。

表3 各組對rMC-1細胞缺氧48h p-STAT3、STAT3、HIF-1α蛋白表達的影響

2.4各組對缺氧損傷rMC-1細胞VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α基因表達的影響Real time PCR結果表明：與正常對照組比較，rMC-1細胞缺氧培養(yǎng)48h后，VEGF、STAT3和HIF-1α的基因表達上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PEDF的基因表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而加味桃紅四物湯低、中劑量對VEGF在基因水平較缺氧模型組均有下調作用，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對PEDF在基因水平較缺氧模型組均有上調作用，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且低劑量組優(yōu)于中劑量，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與缺氧模型組相比，加味桃紅四物湯低劑量對STAT3和HIF-1α在基因水平均有下調作用，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但其中劑量對兩者在基因水平無下調作用，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。結果表明，低劑量加味桃紅四物湯含藥血清可以抑制缺氧損傷rMC-1細胞VEGF、STAT3、HIF-1α mRNA的高表達，增加PEDF mRNA的表達。

表4 各組對rMC-1細胞缺氧48h VEGF、PEDF、STAT3、HIF-1α mRNA表達的影響

3 討論

Müller細胞作為視網膜上特有的也是極為重要的一種神經膠質細胞，占視網膜膠質細胞的90%，它通過分泌VEGF等多種細胞生長因子，參與視網膜新生血管的形成[9]。正常情況下它也會分泌PEDF，而PEDF是一種對新生血管形成有抑制效應的細胞因子[10]，來拮抗VEGF的血管損傷作用以維持平衡狀態(tài)。缺血缺氧會誘導大量VEGF反應性增高，PEDF表達下降[11]，二者平衡被打破，從而形成各種病理性新生血管[12-13]。Wolfram等[14]證實，在缺氧條件下，Müller細胞內VEGF 基因及蛋白表達升高，PEDF 基因及蛋白表達降低，引起視網膜新生血管的形成。本研究選用Müller細胞作為模型細胞。

VEGF是一種促血管生成因子，在ME和RNV的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[15-16]。目前針對以上兩種并發(fā)癥的一線治療是玻璃體內注射抗VEGF藥物，這為廣大患者帶來了福音，但其給藥方式為眼球內注射，屬侵入性治療，增加了眼內感染的機率，且有研究顯示，盡管采取定期多次抗VEGF治療，仍有約25%患者的視力或黃斑水腫程度得不到明顯的改善[17]。在抗VEGF基礎上聯合中醫(yī)中藥治療RVO有提高療效，減少用藥次數的優(yōu)點[18-19]，亦有學者發(fā)現單味中藥含藥血清可以抑制缺氧下視網膜色素上皮細胞的VEGF分泌[20]，因此，傳統(tǒng)醫(yī)學治療視網膜血管病越來越受到學者們廣泛關注。RVO是由視網膜靜脈的血栓引起的，屬中醫(yī)“絡損暴盲”范疇，活血化瘀貫穿其整個治療過程，若并發(fā)黃斑水腫，可配伍益氣、利水的中藥。本課題組前期研究發(fā)現，加味桃紅四物湯(原名行氣活血健脾利水方)治療氣虛血瘀的RVO患者可提高視網膜靜脈阻塞患者的視敏度，減輕視網膜黃斑水腫，增加眼部血流，改善視網膜的微循環(huán)[21]；還可以減輕RVO模型大鼠視網膜出血、水腫等眼底病變，具有良好的改善視網膜水腫的作用[8]。方中黃芪、當歸為君藥，益氣活血；生地黃、赤芍涼血活血，川芎、香附、枳殼行氣活血，白術、茯苓、薏苡仁健脾利水，同為臣藥；佐以桃仁、紅花活血化瘀，全方共奏活血化瘀和健脾利水之功。

本研究用加味桃紅四物湯含藥血清干預缺氧培養(yǎng)的Müller細胞，發(fā)現缺氧培養(yǎng)后該細胞活力受到明顯抑制，而含藥血清低、中劑量均可以改善缺氧后Müller細胞的活力。研究還發(fā)現，與正常對照組比較，缺氧模型組VEGF分泌和基因表達增加，而PEDF分泌水平和基因表達下降，加味桃紅四物湯含藥血清低、中劑量均可以減少VEGF分泌和基因表達，表明加味桃紅四物湯對Müller細胞缺氧條件下VEGF的分泌和基因表達均有抑制作用，且低劑量組的抑制作用優(yōu)于中劑量組，其原因可能是因為Müller細胞在缺氧刺激下其活力下降導致對藥物的吸收率下降。值得注意的是，加味桃紅四物湯含藥血清可上調PEDF的基因表達，但卻不能促進PEDF的分泌，考慮原因可能有兩方面：(1)PEDF的表達水平可能具有滯后性，張梅虹等[22]也發(fā)現高氧誘導早產兒視網膜病變模型小鼠血清PEDF水平的變化滯后于視網膜PEDF的改變；(2)蛋白翻譯是多步驟調控的結果，本實驗的加味桃紅四物湯是多種藥物的復方制劑，可能存在某些單體成分在PEDF的蛋白翻譯水平起到抑制作用，需要對該復方的有效成分進一步研究。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異二聚體，HIF-1αmRNA既是HIF-1的調節(jié)亞基，又是活性亞基，其蛋白穩(wěn)定性及轉錄活性均受到氧分壓的嚴格調控，屬于氧調節(jié)蛋白，故HIF-1的生理活性主要取決于HIF-1α[23]。有研究表明，在缺氧時，STAT3被激活[24-25]，激活的STAT3通過增加HIF-1α的穩(wěn)定性和轉錄活動上調HIF-1α的表達[26]。利用shRNA干擾缺氧條件下人角膜上皮細胞HIF-1α表達，能有效地抑制VEGF mRNA和蛋白表達，使PEDF mRNA和蛋白表達上調[27]，提示PEDF和VEGF的調控均受HIF-1α的調控。本研究發(fā)現，與正常對照組比較，Müller細胞缺氧培養(yǎng)后，p-STAT3和HIF-1α的蛋白和基因表達顯著上調，而低劑量含藥血清對兩者在蛋白和基因水平均有下調作用；與正常對照組比較，Müller細胞缺氧培養(yǎng)后，STAT3的蛋白表達無明顯變化，而中劑量含藥血清對其在蛋白水平有上調作用。表明加味桃紅四物湯含藥血清可減少缺氧后Müller細胞STAT3的磷酸化，減少HIF-1α的蛋白表達。

綜上所述，加味桃紅四物湯可改善缺氧損傷的視網膜Müller細胞rMC-1活力下降，抑制其VEGF分泌，下調VEGF的基因表達，上調PEDF基因表達，維護了兩者的平衡，進而可能抑制視網膜新生血管，減輕視網膜水腫，發(fā)揮治療RVO的作用，其作用機制可能與抑制STAT3/HIF-1α通路有關。