馬慧斐，朱海生，李永平，黃 昊，蔡章棣，薛珠政*，溫慶放*

(1.福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/福建省蔬菜工程技術研究中心， 福建 福州 350013； 2.晉江市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 福建 晉江 362200)

辣椒CapsicumannuumL.原產(chǎn)墨西哥，在我國有悠久的栽培種植歷史，是重要的蔬菜和調味品。2020年我國辣椒種植面積220萬hm2，成為我國第一大單品蔬菜，貴州、河南、山東、河北、內蒙古等主產(chǎn)區(qū)種植面積仍保持增長，辣椒需求量還在不斷上升[1-2]。辣椒也是福建省重要的種植蔬菜，從沿海地區(qū)到內陸山區(qū)都有種植。福建省沿海地區(qū)多砂質土壤，且臺風降雨比較多，因此大部分蔬菜種植戶選擇設施栽培[3-4]。設施辣椒連作障礙十分普遍，主要表現(xiàn)為病害加重，產(chǎn)量降低，品質下降[5]。研究顯示辣椒連作土壤速效養(yǎng)分富集，出現(xiàn)酸化和鹽漬化現(xiàn)象，且隨連作年限增加程度加大，表現(xiàn)為土壤抗氧化酶活性增強，植株生長異常，并且隨連作年限增加影響程度進一步加大[6]。另有研究表明連作使土壤微生物數(shù)量高于單作，土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性降低[7]。而且，連作土壤根際微生物區(qū)系發(fā)生變化，從“細菌型”高肥力土壤轉變?yōu)椤罢婢汀钡头柿ν寥?，使有害微生物成為?yōu)勢種群，從而導致連作障礙[8-10]。

針對連作障礙，我國在20世紀90年代開始采取秸稈還田方式來增加土壤有機質含量，改善土壤理化性質，增強土壤通透性，增加有益生物活性[11]。同時，也可通過添加有機菌肥來改善土壤耕作條件。Mendes等[12]研究表明假單胞菌在土壤中對抑制甜菜植株立枯絲核菌起重要作用，但假單胞菌在單獨測試時缺乏對病原體的抑制活性，當與其它微生物構成部分微生物群落時可以協(xié)同產(chǎn)生抑制作用，證明作物可以依靠微生物群落的特定成分來保護自身免受病原體感染。王輝等[13]研究表明黃柄曲霉ASD可以增加辣椒疫病根際土壤真菌多樣性，改變土壤營養(yǎng)狀況與優(yōu)勢真菌種群結構，從而降低辣椒疫病的發(fā)病率。

辣椒是福建省重要的設施蔬菜，隨著種植年限的增加連作障礙問題日漸凸顯，成為辣椒種植的主要障礙，探究辣椒不同生長狀態(tài)下根際微生物多樣性差異，對改善辣椒種植環(huán)境、減緩辣椒連作障礙、實現(xiàn)辣椒科學種植和合理施肥具有重要的指導意義。本研究對發(fā)生辣椒連作障礙的種植地施用牡蠣鈣土壤調理劑(900 kg·hm-2)進行改良，分析改良前后土壤細菌、真菌的豐富度和多樣性變化及其原因，為減緩福建省辣椒連作障礙提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建省福清市東張鎮(zhèn)，南近北回歸線，屬南亞熱帶氣候帶，季風氣候顯著，年平均氣溫17～20℃，幾乎無霜日，年降水量1 000～2 000 mm，80%以上降水量集中在4月至10月。年平均氣溫17～20℃，年均日照時數(shù)約1 778 h，土質為紅壤土。

1.2 試驗設計

2021年初，將發(fā)生連作障礙的辣椒田塊翻耕，均分為兩塊田，其中一半田塊施用牡蠣鈣土壤調理顆粒劑(900 kg·hm-2)進行改良(記為GL)，另一半連作障礙田塊不添加土壤改良劑(記為LZ)，以未發(fā)生連作障礙且不添加土壤改良劑的健康田塊作為對照(記為JK)。3月初在這3個田塊同時定植辣椒。試驗設置GL、LZ、JK 3個處理，每個處理3次重復，小區(qū)面積為256 m2(8 m×32 m)，每個小區(qū)種植辣椒844株。各處理管理方式一致。

1.3 測試項目與方法

7月份分別采集JK、LZ和GL3種土壤的樣品檢測微生物多樣性。采用5點采樣法采集10～15 cm辣椒根部土壤，去除大顆粒雜質，混勻，取大約5 g土樣立即裝入滅菌的10 mL離心管中，放入干冰中速凍，用于提取DNA，每種土壤取3次重復。

1.3.1土壤微生物總DNA提取 使用天根生化科技(北京)有限公司的TGuide S96基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA。用酶標儀對提取的核酸進行濃度檢測，擴增后的PCR產(chǎn)物使用濃度1.8%的瓊脂糖進行電泳檢測。

1.3.2微生物多樣性測序 微生物多樣性是基于IlluminaNovaseq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)方法，構建小片段文庫進行測序。測序結束后使用Trimmomatic[14](version 0.33)對原始數(shù)據(jù)進行質量過濾，然后使用Cutadapt[15](version 1.9.1)進行引物序列的識別與去除，其后使用 USEARCH[16](version 10)對雙端reads 進行拼接并去除嵌合體(UCHIME[17]，version 8.1)，最終得到高質量的序列用于后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

借助百邁客公司云平臺系統(tǒng)進行細菌和真菌OTU數(shù)量、α多樣性、群落結構、系統(tǒng)進化等分析。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品測序深度評價

取辣椒種植健康土壤(JK)、改良土壤(GL)和發(fā)生連作障礙(LZ)的土壤各3份進行細菌和真菌多樣性檢測，9個樣品分別獲得731 376和718 413對 Raw Reads，經(jīng)Reads 雙端質控、拼接后共產(chǎn)生729 378 和715 844條Clean Reads，細菌檢測每個樣品至少產(chǎn)生 79 471條Clean Reads，平均81 042條；真菌檢測每個樣品至少產(chǎn)生79 270條Clean Reads，平均79 538條，有效Reads占比均在95.29%以上。對測序得到的序列進行隨機抽樣，將抽到的序列數(shù)和代表的物種數(shù)來構建稀釋性曲線，每個樣本的稀釋性曲線均趨向平緩，說明供試樣品取樣合理，檢測結果與實際土壤中的細菌、真菌群落結構相符合，能真實反映土壤樣本的細菌、真菌群落，繼續(xù)增加測序數(shù)量對新發(fā)掘OTU影響不大。

注：橫坐標為隨機抽取的測序條數(shù)，縱坐標為基于該測序條數(shù)得到的Feature數(shù)量，每條曲線代表一個樣品，用不同顏色標記圖1 測序樣品中細菌和真菌的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of the bacteria and fungi in the sequencing samples

2.2 3種土壤中細菌和真菌OTU數(shù)量的差別

由圖2可知，3種土壤經(jīng)過聚類分析發(fā)現(xiàn)共包含1 490個細菌和1 468個真菌OTU。其中，JK中細菌和真菌OTU數(shù)量分別為1 325和968個，GL中分別為1 058和1 062個，LZ中分別為772和1 099個?？傮w趨勢為JK的細菌OTU數(shù)量最多而真菌的最少，LZ中細菌OTU最少而真菌的最多，與其他研究連作障礙土壤由細菌型轉向真菌型的規(guī)律一致。對發(fā)生連作障礙的土壤中添加土壤調理劑后，細菌OTU數(shù)量有所增加，而真菌OTU數(shù)量有所下降，表明土壤調節(jié)劑能有效提高細菌豐富度降低帶來的菌群失調，但是還不足以使連作土壤恢復到健康土壤的微生物群落水平，土壤調理劑使用時間、計量及施用土層深度還需要進一步試驗明確。3種土壤共享594個細菌OTU和595個真菌OTU。GL和JK共有細菌OTU數(shù)量較多，和LZ共有真菌OTU數(shù)量較多。LZ特有的細菌OTU數(shù)量最少，真菌OTU數(shù)量最多。

圖2 辣椒不同種植年限土壤細菌和真菌在OTU水平Venn圖Fig.2 Venn diagram of the bacteria and fungi at OTU levels in the soils with different planting years of pepper

2.3 3種土壤細菌和真菌的多樣性指數(shù)分析

從表1可知，α多樣性指數(shù)Ace和Chao1表現(xiàn)為細菌JK>GL>LZ，真菌為LZ>GL>JK，說明3種土壤中細菌豐富度依次是JK>GL>LZ，而真菌豐富度依次是LZ>GL>JK；且JK和LZ之間兩種指數(shù)均達到了顯著差異(P<0.05，下同)，表明JK土壤的細菌豐富度顯著高于LZ土壤，而真菌豐富度顯著低于LZ土壤；3種土壤的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)顯示細菌種類多樣性趨勢和豐富度一致，真菌也具有相同的趨勢。顯著性分析結果表明3種土壤的細菌多樣性不存在顯著差異(P>0.05，下同)，而JK土壤真菌豐富度顯著低于LZ和GL土壤。說明在采集的3種試驗土壤樣品中JK土壤細菌豐富度和多樣性最高，而LZ真菌豐富度和多樣都最高，GL細菌豐富度和多樣性均高于LZ，但真菌豐富度和多樣性要比LZ低，從土壤微生物多樣性和豐富度水平說明土壤改良劑在防治連作障礙中具有積極作用。

表1 辣椒種植土壤細菌、真菌α多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of bacteria and fungi in the planting soil of pepper

2.4 3種土壤細菌和真菌群落結構的差異

將聚類產(chǎn)生的OTU進行等級分類，由圖3可知，隨著分類等級遞增，細菌物種數(shù)量也遞增，但是沒有在任何一個等級中出現(xiàn)物種數(shù)量陡增的樣品。JK土壤細菌種類在同一級別中增加的最多(表2)，其次是GL，最后是LZ；真菌的物種數(shù)量也是隨著分類等級的遞增而增加，也沒有在任何一個等級中出現(xiàn)物種數(shù)量陡增的樣品。LZ的真菌種類更加豐富，而GL和JK之間的等級分類物種數(shù)量則更為接近。細菌中JK各分類水平的數(shù)量最多，真菌中LZ各分類水平的數(shù)量最多，GL則介于二者之間。

注：橫坐標為按Features豐度排序的序號，縱坐標為對應的Features的相對豐度圖3 3種土壤細菌和真菌物種等級豐度曲線Fig.3 Grade abundance curves of the bacterial and fungal species in the three kinds of soil

表2 不同分類水平微生物數(shù)量Table 2 Number of the microorganisms at different classification levels

2.5 UPGMA聚類樹

基于UnweightedUnifrac距離矩陣，取每個樣品豐富度前10的OTU做3種土壤細菌OTU水平上聚類分析，由圖4可知每組的3個樣品都能獨立組成一個小的聚類單位，而且遺傳分支清晰，組內遺傳距離小于組間。GL的細菌OTU在系統(tǒng)發(fā)育上與JK更接近，與LZ在系統(tǒng)發(fā)育上距離更遠些。表明3種土壤的細菌在群落組成上有各自獨特的結構，而這種群落結構也賦予土壤不同的特性，與植物根部互作后最終體現(xiàn)出植物生長狀態(tài)的差異。

圖4 不同土壤細菌群落在OTU水平的層級聚類分析Fig.4 Hierarchical clustering analysis of the bacterial communities at OTU level in different planting soils

2.6 優(yōu)勢細菌和真菌的類群

對3種土壤門水平的優(yōu)勢細菌和真菌分析發(fā)現(xiàn)，在分類級別門水平JK的優(yōu)勢菌依次為變形桿菌Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi和巴氏桿菌Patescibacteria，GL的優(yōu)勢菌為變形桿菌Proteobacteria、酸桿菌Acidobacteria、厚壁菌門Firmicutes、巴氏桿菌Patescibacteria和放線菌Actinobacteria，LZ的優(yōu)勢菌為厚壁菌門Firmicutes、變形桿菌Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、ε桿菌門Epsilonbacteraeota和放線菌Actinobacteria，3種土壤中優(yōu)勢細菌的差異較大；真菌中子囊菌門Ascomycota在3種土壤中均為第一優(yōu)勢菌，其次是擔子菌門Basidiomycota，其他優(yōu)勢真菌的順序基本一致。

圖5 3種土壤物種分布圖Fig.5 Species distribution in the three kinds of soil

3 結論與討論

本研究對福建省種植辣椒的健康土壤(JK)、連作障礙土壤(LZ)和改良后土壤(GL)中微生物多樣性進行了檢測。結果表明有效的土壤調理劑能夠調節(jié)、改變土壤微生物群落結構，有效提高連作土壤細菌的豐度和多樣性，降低真菌的豐度和多樣性，將連作真菌型土壤向細菌型土壤轉變，從而減緩連作障礙。

土壤是豐富的資源庫，為植物不同生長時期提供必需的大量營養(yǎng)元素和微量元素，也是植物吸收營養(yǎng)，地下部形態(tài)建成，與微生物進行信號傳導和物質交換的主要場所。但是，作物連續(xù)耕種會導致土壤中的營養(yǎng)失衡、養(yǎng)分偏耗、pH改變，進而土壤微生物區(qū)系發(fā)生改變，加上植物有害根系分泌物積累，最終出現(xiàn)連作障礙，嚴重影響作物產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

連作障礙產(chǎn)生的原因之一是土壤從細菌型轉變成真菌型，而許多土傳病害真菌含量也隨之升高。本研究對福建省種植辣椒的健康土壤和連作土壤進行微生物多樣性測序分析，得到了相似結果，說明連作障礙的發(fā)生和土壤菌群失調緊密相關。對發(fā)生連作障礙的土壤添加土壤調理劑進行改良，改良后的小油菜植株比原來健壯，發(fā)病率大幅下降[18]。本研究表明，改良土壤中真菌豐富度和多樣性較連作土壤明顯降低，而細菌種群明顯上升，且系統(tǒng)進化結果顯示改良后土壤中細菌種群與健康土壤的細菌種群遺傳關系更近。因此，可以通過監(jiān)測土壤微生物多樣性的變化為土壤改良提供參考。

相關研究表明，連作土壤pH值低于同地區(qū)正常土壤[19-20]。土壤調理劑能夠提高土壤pH值，改善土壤環(huán)境[18]。本研究在連作土壤中添加牡蠣鈣土壤調理劑，有效緩解了連作障礙造成的辣椒長勢衰弱和病害加重。改良后細菌的豐度和多樣性都有明顯提升，向健康土壤靠攏，但真菌更接近連作障礙土壤。因此，土壤調理劑的選擇及施用方式還需進一步調整、改進。