孫廷麗， 李彩玲， 陳 靜， 葉一均， 林小涵， 楊義熙， 謝小保

廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

研究顯示，每年因使用不潔凈水洗手或不能使用洗手產(chǎn)品進(jìn)行有效洗手而導(dǎo)致100萬人次的死亡[1]。使用香皂等洗手產(chǎn)品，可以將腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)降低23%～48%，呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)降低21%～23%[2-4]。因此，洗手特別是使用洗手產(chǎn)品進(jìn)行正確的洗手，是預(yù)防疾病傳播的有效手段，對于控制傳染性疾病的傳播具有積極的意義。

當(dāng)使用皂類等洗手產(chǎn)品時，產(chǎn)品中的表面活性劑會使皮膚脂肪乳化，并通過與微生物表面的親脂物質(zhì)結(jié)合，形成乳化顆粒使其更容易從皮膚表面脫離，進(jìn)而被水沖掉[5]。因此，使用洗手產(chǎn)品進(jìn)行洗手，可以得到比機(jī)械搓洗更好的清潔效果[6]。但在目前，大多數(shù)對于手衛(wèi)生依從性的教育和研究主要是在醫(yī)院和社區(qū)公共衛(wèi)生系統(tǒng)進(jìn)行的[7-8]，對于洗手產(chǎn)品的微生物作用的質(zhì)量評價主要考慮其抗抑菌效果，而非綜合的清潔去除作用[9-10]。我國的標(biāo)準(zhǔn)體系中日化產(chǎn)品除菌的概念尚屬空白，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)評價方法并不能很好地滿足企業(yè)和行業(yè)對于洗手產(chǎn)品質(zhì)量控制和宣稱的需要。因此，建立一個安全可行的評價此類產(chǎn)品對細(xì)菌的去除效果的試驗(yàn)方法，就顯得十分必要和迫切。

基于上述問題，本文以仿真皮為載體，驗(yàn)證了仿真皮離體試驗(yàn)與在體試驗(yàn)的相關(guān)性，研究并建立了一個洗手產(chǎn)品除菌效果的體外評價方法并驗(yàn)證了該方法的可重復(fù)性及適用性，為建立標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)方法提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusAureus)ATCC 6538、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，均購自廣東省微生物菌種保藏中心，本實(shí)驗(yàn)室保存。

(2) 實(shí)驗(yàn)載體：離體仿真皮(VITRO-SKIN，IMS)。

(3) 洗手產(chǎn)品：市售產(chǎn)品，分別編號為香皂，洗手液A～C。

1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、拍打式均質(zhì)器(Bag Mixer 400 mL，法國Inter science公司)、電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)、搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司)、移液槍(Eppendorf)，其他小型設(shè)備及耗材均購自廣東環(huán)凱生物生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑與培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)及SCDLP液體培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1體外洗手除菌測試流程

參照ASTM E1174—2013[11]、孫廷麗等體外除病毒的試驗(yàn)方法[12]，并結(jié)合細(xì)菌的生物學(xué)培養(yǎng)特點(diǎn)，初步制定以下流程：

(1) 試驗(yàn)用菌懸液的制備

取標(biāo)準(zhǔn)菌株在NA上劃線活化，于(36±1)℃，培養(yǎng)18 h～24 h。用接種環(huán)從平板上挑取一個單菌落接種到含有50 mL NB的錐形瓶中，培養(yǎng)18 h～24 h，得到最終濃度為108CFU/mL～109CFU/mL的菌懸液。

(2) 試驗(yàn)載體的準(zhǔn)備

無菌條件下打開仿真皮包裝，將仿真皮剪成6 cm×6 cm大小，糙面向上備用。每次試驗(yàn)使用9片仿真皮，3片用于基線回收取樣(即接種后立即洗脫取樣)，3片用自來水清洗后作為對照組試樣；3片用作洗手產(chǎn)品洗手試樣。用水潤濕仿真皮表面，無菌紙巾輕拍干燥。

(3) 試驗(yàn)菌的接種

取0.1 mL菌懸液接種于仿真皮表面，涂布棒擦拭至整個仿真皮表面，使仿真皮在空氣中自然干燥大約30 s。重復(fù)該過程3次。

(4) 基線菌落回收

接種完成后，取其中的3片仿真皮，進(jìn)行基線回收。回收時，將仿真皮分別放入均質(zhì)袋中，加入10 mL SCDLP，均勻揉搓仿真皮1 min，獲得洗脫液，并對洗脫液進(jìn)行梯度稀釋計(jì)數(shù)。

(5) 體外洗手過程

調(diào)節(jié)水流速至約(4.0±0.3)L/min。洗手試驗(yàn)用的水為市政自來水，其水質(zhì)要求符合GB 5749的衛(wèi)生要求。輕輕打濕染菌的仿真皮，然后按下列方式進(jìn)行清洗：以自來水清洗作為對照試驗(yàn)組,搓洗30 s，后流水沖洗30 s；對于固體類產(chǎn)品(如香皂)，使用產(chǎn)品擦15 s，整手掌部分搓洗起泡30 s，后流水沖洗30 s；對于液體類產(chǎn)品(如洗手液)，稱取0.45 g 樣品至皮表面，整手掌部分搓洗起泡30 s，后流水沖洗30 s；沖洗完畢，使用無菌紙巾輕輕拍干皮表面。將洗后的仿真皮分別進(jìn)行菌落回收計(jì)數(shù)，回收方式同基線回收。

(6) 結(jié)果計(jì)算

以每次試驗(yàn)時3片洗手產(chǎn)品洗手后取樣的離體仿真皮相對3片基線回收的仿真皮上菌落減少的對數(shù)平均值。

(7) 除菌有效性的確定

按相同測試條件進(jìn)行2次測試，每次測試設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)重復(fù)，共6個重復(fù)。對6片對照組回收對數(shù)值與試驗(yàn)組菌回收對數(shù)值進(jìn)行t檢驗(yàn)，顯著性水平取p≤0.05(雙尾檢驗(yàn))，評價測試樣品與對照樣品除菌性能是否存在差異。當(dāng)兩組樣品結(jié)果存在顯著性差異，且對照組菌落對數(shù)值大于試驗(yàn)組時，可認(rèn)為試驗(yàn)組樣品具有除菌功效。

1.4.2仿真皮與在體洗手試驗(yàn)的相關(guān)性研究

制備2.0×108CFU/mL～2.0×109CFU/mL的菌懸液備用；樣品選用洗手液A、洗手液B和洗手液C。分別使用在體洗手方法及離體洗手流程進(jìn)行洗手除菌試驗(yàn)，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，驗(yàn)證二者之間的相關(guān)性。

在體試驗(yàn)采用《消毒技術(shù)規(guī)范》中消毒劑對手消毒模擬現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)的方法[13]。即將每個樣品分為2組，每組5人。首先使用液體肥皂洗手1 min去除手表面污染的自然菌，然后用無菌紗布將手擦干。將2×108CFU/mL～2×109CFU/mL菌懸液放入一無菌容器中，將手掌中間到指尖部位浸入菌懸液中，手指分開，停留5 s，將手離開菌懸液，在空氣中干燥3 min。干燥后立即將拇指與其他手指尖在含 10 mL TSB的平皿中搓洗1 min，取適當(dāng)稀釋度接種平皿。計(jì)數(shù)菌落數(shù)，作為試驗(yàn)前菌落數(shù)。不再重復(fù)污染手，立即進(jìn)行試驗(yàn)組處理。按說明書介紹的用量、作用時間和使用頻率以標(biāo)準(zhǔn)的洗手方法(搓擦30 s～60 s)。以流動的自來水沖洗5 s，抖掉手上殘留的水。立刻將拇指與其它手指尖在含10 mL中和劑的平皿中搓洗1 min，做適當(dāng)稀釋后，分別取樣液1.0 mL以傾注法接種兩個無菌平皿，放37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。離體試驗(yàn)按1.4.1描述的洗手步驟進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)組數(shù)和試樣個數(shù)同在體試驗(yàn)。

1.4.3方法的確認(rèn)及驗(yàn)證

需要確認(rèn)的內(nèi)容為使用洗手液、香皂對兩種細(xì)菌的去除率以及測試方法對不同產(chǎn)品劑型的適用性。另外，使用人員比對的方式驗(yàn)證方法的可重復(fù)性。

1.4.4數(shù)據(jù)分析[14,15]

根據(jù)需要，將回收菌落數(shù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)值。用x±s計(jì)算結(jié)果的指定值，采用變異系數(shù)(Coefficient of variation， CV)來考察數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；以|Z|值計(jì)算人員比對的有效性，使用SPSS計(jì)算方差齊性及t檢驗(yàn)的p值。

2 結(jié)果

2.1 仿真皮與在體洗手試驗(yàn)的相關(guān)性

3種洗手液分別進(jìn)行在體洗手和離體洗手的除菌效果情況見表1。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用3種洗手液進(jìn)行在體洗手時，兩種細(xì)菌減少的對數(shù)值均大于3，介于3.39～3.87之間，去除效果都比較理想，但是針對同一種微生物分別進(jìn)行5組實(shí)驗(yàn)人員結(jié)果的重復(fù)性分析，其變異系數(shù)(CV)相對比較大，最大的達(dá)到了13.59%，這說明試驗(yàn)的結(jié)果受受試者個體差異影響比較大。在使用仿真皮作為試驗(yàn)載體時，3種洗手液作用后，金黃色葡萄球菌的細(xì)菌平均減少對數(shù)值分別為3.47、3.61及3.82，大腸桿菌的細(xì)菌平均減少對數(shù)值分別為3.39、3.44及3.58，這些結(jié)果與在體模擬實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相近，人造皮與在體試驗(yàn)的結(jié)果均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(在體試驗(yàn)及離體仿真皮試驗(yàn)的同一種樣品、同一種微生物的洗去效果進(jìn)行雙樣本等方差t檢驗(yàn)，其P(0.05)均大于0.54)。綜上所述，仿真皮試驗(yàn)結(jié)果與在體試驗(yàn)結(jié)果具有一定的相關(guān)性，而且結(jié)果穩(wěn)定性好，是一種理想的試驗(yàn)載體。

表1 在體與離體洗手方法對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的去除效果比較

2.2 不同洗手產(chǎn)品的除菌效果試驗(yàn)

使用市場上購買的不同的洗手產(chǎn)品(洗手液A～洗手液C，香皂)作為試樣，以金黃色葡萄球菌ATCC6538及大腸桿菌ATCC25922作為測試菌種，按離體除菌的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表可知，金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌種時，洗手液A～洗手液C、香皂及清水進(jìn)行洗手試驗(yàn)時，載體上微生物的對數(shù)減少值分別為3.47、3.61、3.82、4.75及2.05，P(0.05)均<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4種產(chǎn)品在5組試驗(yàn)中的變異系數(shù)分別是7.41%、7.65%、6.25%及2.68%。使用大腸桿菌ATCC25922作為實(shí)驗(yàn)菌種的的結(jié)果與金黃色葡萄球菌相似。采用洗手液A～洗手液C、香皂及清水進(jìn)行洗手試驗(yàn)時，載體上微生物的對數(shù)減少值分別為3.39、3.44、3.58、4.89及2.11，變異系數(shù)分別為6.28%、7.26%、4.60%及4.40%，與對照組的去除效果相比，其P(0.05)均<0.01。

表2 不同洗手產(chǎn)品的除菌效果試驗(yàn)

為對產(chǎn)品的除菌有效性進(jìn)行評價，選取了香皂產(chǎn)品進(jìn)行了兩次重復(fù)試驗(yàn)，共獲得6個平行數(shù)據(jù)，并對其進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表3，當(dāng)使用香皂進(jìn)行洗手除大腸桿菌的試驗(yàn)時，其基線恢復(fù)均大于107CFU/片，每片之間的偏差為0.08；對試驗(yàn)組和對照組回收到的細(xì)菌的對數(shù)值進(jìn)行F檢驗(yàn)，其P0.05=0.37，P0.05>0.05，兩組試驗(yàn)方差齊；對試驗(yàn)組及對照組的回收對數(shù)值進(jìn)行t檢驗(yàn)，其P0.05<0.01，表明兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明測試的香皂相較僅使用清水進(jìn)行洗手時，具有增加細(xì)菌去除的效果，計(jì)算獲得其除菌對數(shù)值為4.79。

表3 某香皂對大腸桿菌的去除效果

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法適用于洗手液及香皂等不同劑型的產(chǎn)品的除菌效果的測試，并可以根據(jù)需要進(jìn)行除菌效果的評價。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定產(chǎn)品的除菌效果，并以除菌率來表征試驗(yàn)結(jié)果，是科學(xué)可行的。同時由于其實(shí)驗(yàn)重復(fù)較少，有效的降低了試驗(yàn)成本及工作量，是一種比較合理的評價方式。

2.3 人員比對試驗(yàn)

4位檢驗(yàn)人員作為分別按照離體試驗(yàn)方法對4個樣品及水樣樣進(jìn)行了一次除大腸桿菌的檢測，結(jié)果見表4。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析，所有人的|Z|值均小于2。表明所有實(shí)驗(yàn)人員的結(jié)果一致，沒有出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏離，表明方法可重復(fù)性好。

表4 人員比對試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以離體仿真皮為試驗(yàn)載體，進(jìn)行了兩種常見劑型的洗手產(chǎn)品的除菌效果的測試，建立了一種安全、簡便、可操作性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)流程。該方法與在體試驗(yàn)相關(guān)性較好，以統(tǒng)計(jì)學(xué)方式對產(chǎn)品的除菌效果進(jìn)行評價，減少了試驗(yàn)可能引起的結(jié)果不穩(wěn)定性的情況。同時，該方法能區(qū)分不同除菌能力的產(chǎn)品，適用于液體及固體兩種劑型，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，具有較好的應(yīng)用價值，為進(jìn)一步建立標(biāo)準(zhǔn)化的測試方法提供了數(shù)據(jù)支持，有助于填補(bǔ)我國日化產(chǎn)品除菌效果的性能評價的標(biāo)準(zhǔn)缺失的空白，促進(jìn)行業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。