潘金清，湯佳馨，周佳敏，沈小媛，葉祥生，譚筱江

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 a.惠僑醫(yī)療中心； b.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣州 510515)

肺癌是世界范圍內(nèi)造成癌癥相關(guān)死亡事件的主要原因[1]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要組織學(xué)類型，占肺癌病例的85%以上[2]，具有高轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的特點，包括以下4個亞型：肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)、大細(xì)胞癌和肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌，其中LUSC約占所有肺癌病例的30%[3]。目前LUSC的主要治療方式包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療和靶向治療等[4]。盡管肺癌的預(yù)防、診斷和治療已經(jīng)取得了較大進展，但肺癌患者的5年總生存率僅為19%[5]。

細(xì)胞焦亡是一種促炎形式的程序性細(xì)胞死亡，有大量研究表明焦亡過程在腫瘤發(fā)生和腫瘤治療中起著關(guān)鍵作用，包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤對誘導(dǎo)焦亡的治療手段均敏感[6]。近年來，LUSC與長鏈非編碼RNA(lncRNAs)之間的聯(lián)系越來越受到重視。lncRNAs指長度超過200個核苷酸而不具有蛋白編碼能力的RNA，其參與多種細(xì)胞活動，如脂肪生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、細(xì)胞分化、表觀遺傳修飾、腫瘤發(fā)生和調(diào)控等[7]。已有研究[8]表明lncRNAs與膀胱癌、胃癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。lncRNAs在非小細(xì)胞肺癌中調(diào)控細(xì)胞焦亡的作用也被證實[8]，但焦亡相關(guān)lncRNAs在LUSC中的作用仍有待探索，LUSC患者治療或預(yù)后中涉及的焦亡相關(guān)lncRNAs尚不明確。

本研究通過生物信息學(xué)分析篩選肺鱗癌患者中具有預(yù)后價值的焦亡相關(guān)lncRNAs，并用于構(gòu)建基于焦亡相關(guān)lncRNAs的預(yù)后風(fēng)險評估模型，以期為肺鱗癌患者的預(yù)后預(yù)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

LUSC患者的RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、臨床信息均從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取，只將隨訪信息完整的樣本納入分析。通過檢索相關(guān)文獻獲得52個與焦亡相關(guān)的編碼基因(mRNAs)[9]。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析計算焦亡相關(guān)基因表達量與差異lncRNAs相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)絕對值>0.4為焦亡相關(guān)的lncRNAs。再對所得焦亡相關(guān)的lncRNAs進行Pearson相關(guān)分析(|log2 Fold Change|>1，F(xiàn)DR<0.05)，獲得焦亡相關(guān)的差異lncRNAs。

1.2 焦亡相關(guān)lncRNAs預(yù)后風(fēng)險模型的構(gòu)建與驗證

1.3 GSEA、免疫浸潤和免疫檢查點分析

通過GSEA分析比較高、低風(fēng)險2組間的KEGG通路差異。從TIMER2.0中下載免疫細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)，采用R包(limma、GSVA、GSEABase、ggpubr、reshape2)進行分析，比較高、低風(fēng)險2組間免疫細(xì)胞和免疫功能差異；使用limma比較高風(fēng)險組和低風(fēng)險組在免疫檢查點和m6A相關(guān)基因方面的差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理及風(fēng)險模型的構(gòu)建

Pearson相關(guān)性分析鑒定出743個焦亡相關(guān)的lncRNAs，對焦亡相關(guān)lncRNAs進行差異分析(logFC>1;FDR<0.05)，得到277個焦亡相關(guān)的差異lncRNAs。單因素Cox生存分析顯示，21個焦亡相關(guān)lncRNAs與肺鱗癌患者的總生存率相關(guān)(P<0.05)，包括LINC02555、PICART1、AC011511.5、MYOSLID、AC007823.1、AL136369.1、LANCL1-AS1、AP001189.1、AP001189.3、MIR3945HG、AL357054.4、LRRK2-DT、LINC01322、AC010422.4、AC112722.1、AL122125.1、AP001528.1、LINC02345、AC104248.1、AL606469.1、SFTA1P(圖1)。進一步對上述21個lncRNAs進行多因素Cox生存分析，最終獲得8個與預(yù)后相關(guān)的焦亡相關(guān)lncRNAs：PICART1、MIR3945HG、LINC01322、AC010422.4、AC112722.1、AL122125.1、AC104248.1、SFTA1P。

圖1 21個與肺鱗癌患者的總生存率相關(guān)的焦亡相關(guān)lncRNAs

2.2 風(fēng)險模型的驗證

根據(jù)焦亡相關(guān)lncRNAs的表達及其相應(yīng)的風(fēng)險系數(shù)，計算每位LUSC患者基于該模型的風(fēng)險評分。風(fēng)險評分=PICART1×0.525 752 425+MIR3945HG×0.522 857 7+LINC01322×0.152 951 022+AC010422.4×(-1.180 751 205)+AC112722.1×0.713 017 253+AL122125.1×(-0.245 646 317)+AC104248.1×0.132 707 153+SFTA1P×(-0.016 397 794)。以風(fēng)險評分的中位值(0.99)為閾值，將LUSC患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，分別為246例和247例。Kaplan-Meier生存分析顯示，高風(fēng)險組半數(shù)總生存期為3年，而低風(fēng)險組半數(shù)總生存期為6年，為高危組的2倍(圖2)，低風(fēng)險組的總生存期明顯優(yōu)于高風(fēng)險組(P<0.001)。風(fēng)險曲線表明高風(fēng)險組患者的生存狀態(tài)較差(圖3A—B)。熱圖顯示LUSC預(yù)后相關(guān)的8個焦亡lncRNAs在2組患者中表達量有明顯差異，其中高風(fēng)險組PICART1、MIR3945HG、LINC01322、AC112722.1、AC104248.1、SFTA1P的表達較低風(fēng)險組顯著上升，而AC010422.4、AL122125.1表達明顯下降(圖3C)。

圖2 Kaplan-Meier生存分析

Patients(increasing risk socre)

Patients(increasing risk socre)

A：各樣本風(fēng)險評分散點圖；B：各樣本生存狀態(tài)散點圖，綠色點表示生存，紅色點表示死亡；C：高、低危組8個焦亡相關(guān)lncRNAs表達水平熱圖。

將患者臨床特征和風(fēng)險評分結(jié)合進行單因素Cox分析，結(jié)果顯示風(fēng)險評分是LUSC患者的預(yù)后因素(P<0.001，圖4A)。進一步將風(fēng)險評分納入多因素Cox分析，結(jié)果表明上述基于焦亡相關(guān)lncRNAs的風(fēng)險評分可作為LUSC患者的獨立預(yù)后因素(圖4B)。ROC曲線顯示1、2、3年生存率AUC值分別為0.632、0.643、0.645，說明風(fēng)險模型預(yù)測患者預(yù)后的準(zhǔn)確性尚可(圖5A)，且焦亡相關(guān)lncRNAs預(yù)后模型優(yōu)于年齡、性別、分期等預(yù)測指標(biāo)(圖5B)。熱圖展示了高、低風(fēng)險組焦亡相關(guān)lncRNAs、年齡、性別、分期等的分布情況(圖6)。

A：單因素；B：多因素。圖4 臨床特征和基于焦亡相關(guān)lncRNA的風(fēng)險評分的Cox回歸分析

A：基于焦亡相關(guān)lcnRNAs的1、2、3年生存率預(yù)測；B：基于焦亡相關(guān)lncRNAs、年齡、性別、分期的1年生存率預(yù)測。

圖6 焦亡相關(guān)lncRNAs和臨床特征相關(guān)熱圖

2.3 KEGG富集分析和免疫檢查點分析

GSEA分析顯示，高風(fēng)險組差異基因富集于ECM受體相互作用通路(圖7A)，而低風(fēng)險組在剪接體和藥物代謝細(xì)胞色素P450通路富集(圖7B)。

A：高風(fēng)險組；B：低風(fēng)險組。圖7 KEGG通路富集分析

用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEO、MCPCOUNTER、XCWLL、EPIC等數(shù)據(jù)庫對高低風(fēng)險組進行免疫細(xì)胞浸潤情況分析，結(jié)果顯示高風(fēng)險組患者免疫細(xì)胞浸潤豐度比低風(fēng)險組高，如B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞(圖8A)。進一步對高、低風(fēng)險組的免疫功能(圖8B)及免疫檢查點(圖8C)進行比較，高風(fēng)險組的APC共抑制分子、APC共刺激分子、趨化因子受體、免疫檢查點、細(xì)胞活性、人類白細(xì)胞抗原、促炎因子、組織相容抗原、副炎癥、T細(xì)胞共抑制、T細(xì)胞共刺激、Ⅰ型及Ⅱ型IFN應(yīng)答免疫功能更強。

m6A是最豐富和可逆的RNA修飾，可以調(diào)節(jié)lncRNA的表達和生物學(xué)效應(yīng)，m6A相關(guān)的lncRNA修飾在腫瘤診斷、治療和預(yù)后中表現(xiàn)出出色的應(yīng)用前景[12]。通過分析m6A相關(guān)基因在2組間的表達差異，發(fā)現(xiàn)m6A相關(guān)基因中HINRNPC、METTL3、YTHDC2、YTHDC1在高風(fēng)險組中表達下降，而FTO、YTHDC1在高風(fēng)險組中表達顯著上升(圖8D)。

A：免疫細(xì)胞浸潤；B：免疫功能；C：免疫檢查點；D：m6A相關(guān)基因。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns P>0.05。

3 討論

LUSC是肺癌最常見的組織病理類型，多發(fā)生于男性，與吸煙有關(guān)。高敏感性和高特異性的指標(biāo)的缺乏使得LUSC的早期診斷較為困難[13]。隨著對LUSC認(rèn)識的加深，新的預(yù)后相關(guān)指標(biāo)可為LUSC患者的治療及評估預(yù)后提供新的策略。焦亡被認(rèn)為是一種新的細(xì)胞死亡途徑，近期有研究表明焦亡相關(guān)的lncRNAs有可能成為膀胱癌[14]、肺腺癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[15]、頭部鱗狀細(xì)胞癌[16]、骨肉瘤[17]等癌癥的潛在分子標(biāo)志物和治療靶點。LI等[18]研究發(fā)現(xiàn)3個與LUSC焦亡相關(guān)的編碼基因，但尚未有文獻報道焦亡相關(guān)lncRNAs與LUSC的關(guān)聯(lián)。lncRNAs存在于血液中故易于檢測，可避免穿刺活檢等帶來的創(chuàng)傷[19]。而傳統(tǒng)的肺腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA125、CYFRA21-1等的診斷價值有限[20]，因此，lncRNAs也有望成為肺癌早期診斷的標(biāo)志物。

本研究利用已有數(shù)據(jù)庫獲取LUSC患者的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及其臨床信息，構(gòu)建了由8個lncRNAs(PICART1、MIR3945HG、LINC01322、AC010422.4、AC112722.1、AL122125.1、AC104248.1、SFTA1P)組成的預(yù)后預(yù)測模型。有文獻報道PICART1可促進細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞活力，具有抗肺癌的作用[21]；MIR3945HG被認(rèn)為在LUSC預(yù)后中有很高的診斷價值[22]；SUN等[23]研究表明LINC01322可作為LUSC的獨立危險因素；WENG等[12]研究發(fā)現(xiàn)AL122125.1是影響LUSC患者預(yù)后的獨立因素；FTA1P也是影響LUSC預(yù)后的重要lncRNAs[24]，LI等[25]研究顯示SFTA1P可提高LUSC對順鉑的敏感性，可作為預(yù)測LUSC患者化療反應(yīng)和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

依據(jù)基于lncRNAs的風(fēng)險評估模型的高、低風(fēng)險組生存分析結(jié)果顯示高風(fēng)險組患者預(yù)后顯著低于低風(fēng)險組，且單因素和多因素Cox分析顯示風(fēng)險評分可以作為獨立預(yù)后因子。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組在ECM受體相互作用通路富集，而ECM受體相互作用通路已被證實在前列腺癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌中表達異常，并參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤[26]。高風(fēng)險組免疫細(xì)胞的浸潤和功能比低風(fēng)險組更為活躍。

腫瘤細(xì)胞的浸潤、免疫功能以及免疫檢查點抑制分子的表達可以影響腫瘤患者的預(yù)后，并預(yù)測免疫治療的效果[27-28]。免疫浸潤分析結(jié)果顯示，高、低風(fēng)險組在免疫細(xì)胞浸潤、免疫功能、免疫檢查點等方面的表達存在顯著差異。進一步對m6A相關(guān)基因進行分析，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組中m6A相關(guān)基因HNRNPC、METTL3、YTHDC2、YTHDC1表達顯著下調(diào)，而FTO表達顯著上調(diào)。這與WENG等[12]的結(jié)果有相似之處。

本研究也存在一些局限性：一是所有數(shù)據(jù)均來源于數(shù)據(jù)庫，未進行外部數(shù)據(jù)集驗證；二是對于8種焦亡相關(guān)的lncRNAs在LUSC發(fā)生發(fā)展中的分子機制聯(lián)系未做進一步的研究和闡述?？傊狙芯客ㄟ^生物信息學(xué)的方法初步探討了焦亡相關(guān)lncRNAs與LUSC預(yù)后之間的關(guān)系，篩選出了8個lncRNAs可能與LUSC的預(yù)后相關(guān)，為研究細(xì)胞焦亡與LUSC之間的關(guān)系提供了新的方向。