田 捷，陳吉濤，邱 美，楊舉良，劉 飛

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006)

腎細(xì)胞癌(RCC)是起源于腎實(shí)質(zhì)的惡性腫瘤，發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)腫瘤中排第3位[1]。腎細(xì)胞癌的病理分型中以腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、腎乳頭狀癌(KIRP)和腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)較為常見(jiàn)，其中KIRC是腎細(xì)胞癌最常見(jiàn)的亞型，約占75%～80%[2]。目前外科手術(shù)仍是治療腎細(xì)胞癌的主要手段，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%，此外大約有三分之一的腎細(xì)胞癌患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，其次晚期或轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌對(duì)放療化療不敏感，有效率低[3]。因此，為了改善KIRC患者的生存預(yù)后，尋找合適的篩查或監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記物迫在眉睫。著絲粒蛋白W(CENPW),又稱(chēng)癌癥中上調(diào)基因2(CUG2)，是一種核蛋白，參與細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等，在大多數(shù)人體腫瘤組織中高表達(dá)，如肺癌、肝癌、卵巢癌和腦膠質(zhì)瘤等，一致被認(rèn)為是癌基因[4-7]。因此，本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，分析CENPW基因在KIRC中的表達(dá)特征及預(yù)后價(jià)值，以便為KIRC的診斷治療尋找有效的分子標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 資料收集

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.tcga.org/)中下載KIRC的mRNA數(shù)據(jù)和相關(guān)的KIRC患者腫瘤組織樣本541例，正常組織樣本72例作為對(duì)照。運(yùn)用R3.6.3軟件提取CENPW基因在KIRC組織和正常腎組織的表達(dá)情況,通過(guò)Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)分析比較二者中CENPW的表達(dá)；采用Wilcoxon signed rank檢驗(yàn)對(duì)72對(duì)KIRC組織和正常腎組織中CENPW表達(dá)進(jìn)行配對(duì)差異分析。分別獲取KIRC患者的臨床資料，主要有年齡、性別、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、腫瘤分級(jí)、臨床分期及TNM分期。

1.2 研究方法

1.2.1 分析CENPW在KIRC組織中的表達(dá)差異與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)CPNEW在KIRC的表達(dá)中位值，將KIRC患者分為高、低表達(dá)組。運(yùn)用R 3.6.3軟件，通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)分析CENPW表達(dá)與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，包括腫瘤分級(jí)、臨床分期、T分期、N分期、M分期；采用Kaplan-Meier生存分析CPNEW高、低表達(dá)組的總體生存率(OS)；采用單、多因素COX回歸分析CPNEW基因與患者預(yù)后的相關(guān)性，并分析CENPW基因在KIRC中的預(yù)后價(jià)值。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CENPW基因mRNA在KIRC細(xì)胞系和正常腎上皮細(xì)胞系中的表達(dá)

通過(guò)體外培養(yǎng)正常腎小管上皮細(xì)胞系HK2和KIRC細(xì)胞系786-O、ACHN、ORSC-2、A498,用細(xì)胞或組織RNA提取試劑trizol(全世金生物公司)提取各個(gè)細(xì)胞系的總RNA,EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全世金生物公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,TaKaRa Ex Premier DNA Polymerase(TAKARA生物公司)進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算驗(yàn)證。CENPW基因上引物：3′-GGAGCTTGTGTGCGATACAGAGAG-5′；下引物：3′-GCCTTCCGCTTTATCTGCTTCCTC-5′。GAPDH基因上引物：3′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-5′；下引物：3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。引物均由生工生物公司合成生產(chǎn)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R3.6.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)和Wilcoxon signed rank檢驗(yàn)分析CENPW基因在KIRC正常組織和腫瘤組織的表達(dá)；通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)分析CENPW表達(dá)與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；使用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析；使用單因素COX回歸分析OS與臨床相關(guān)因素之間的關(guān)系；采用多因素COX回歸分析，篩選KIRC的獨(dú)立預(yù)后因素。用配對(duì)t檢驗(yàn)比較CENPW基因在KIRC腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系中的表達(dá)差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CENPW在KIRC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

與正常腎組織、癌旁組織相比，CENPW在KIRC組織中的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.001，圖1)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常腎小管上皮細(xì)胞(HK2)相比，CENPW mRNA在KIRC細(xì)胞系(786-O、ACHN、ORSC-2、A498)4種細(xì)胞均高表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.2 CENPW的表達(dá)與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)分析顯示，CENPW在KIRC患者中的表達(dá)與腫瘤分級(jí)、臨床分期、病理T分期、病理N分期、病理M分期均顯著相關(guān)(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

A:CENPW基因在正常腎組織和KIRC組織中的表達(dá)；B:CENPW基因在KIRC組織、配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)；***P<0.001。圖1 CENPW基因在KIRC組織中的表達(dá)

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖2 CENPW mRNA在KIRC細(xì)胞系中的表達(dá)

A:腫瘤分級(jí)；B：臨床分期；C:病理T分期；D:病理N分期；E:病理M分期；***P<0.001。圖3 CENPW表達(dá)與KIRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 CENPW的表達(dá)與KIRC患者OS、臨床預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CENPW在KIRC組織高表達(dá)組中的OS明顯低于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖4。單因素COX回歸分析結(jié)果顯示，CENPW在KIRC組織中的表達(dá)、年齡、腫瘤分級(jí)(grade)、臨床分期(stage)、TNM分期與患者的生存均顯著相關(guān)(均P<0.001)；多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，CENPW基因在KIRC組織中的表達(dá)可以作為KIRC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表1。

t/個(gè)月圖4 CENPW表達(dá)與KIRC患者OS的關(guān)系

表1 單因素和多因素COX回歸分析

3 討論

由于隱匿的早期癥狀和缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)新診斷的KIRC患者已經(jīng)處于晚期，通常伴有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良[8]。目前，KIRC暫時(shí)還沒(méi)有找到具有敏感性和特異性的分子標(biāo)志物，這表明了確定分子標(biāo)志物對(duì)于KIRC早期篩查和監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的重要性[9]。有研究[10-11]表明，癌基因激活和抑癌基因失活是KIRC發(fā)病機(jī)制中的重要原因。因此，迫切需要尋找有效的預(yù)后分子標(biāo)志物和癌癥相關(guān)的分子機(jī)制，以挖掘KIRC的治療靶點(diǎn)。CENPW是著絲粒蛋白復(fù)合物成員之一，其在多種人類(lèi)癌癥類(lèi)型中差異表達(dá)，通常在各種腫瘤組織(如膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌)中高表達(dá)，并且在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用[4-7]。CENPW基因被定位到染色體6q22.32，其跨度約8.5 kb，帶有3個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)，編碼88個(gè)氨基酸的多肽[12]。有研究[13]揭示CENPW為細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖過(guò)程所必需，且位于核仁或者著絲粒上，能和著絲粒蛋白T相互結(jié)合,共同參與著絲粒染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成。KAOWINN等[14-17]研究發(fā)現(xiàn)，由CENPW誘導(dǎo)的EGFR表達(dá)增加，通過(guò)Stat1-HDAC4信號(hào)傳導(dǎo)賦予阿霉素耐藥性[14]；CENPW基因敲除通過(guò)使E2F信號(hào)失活抑制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[15],CENPW通過(guò)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,CENPW可以發(fā)揮促癌作用[16]，著絲粒蛋白W具有調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤侵襲性的作用[17]。

分析TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CENPW基因在KIRC組織中顯著高表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CENPW基因的mRNA表達(dá)水平在腎癌細(xì)胞系均顯著高于正常腎小管上皮細(xì)胞系。此外，CENPW的表達(dá)與KIRC患者的腫瘤分級(jí)、臨床分期和TNM分期顯著相關(guān)，提示CENPW參與KIRC的腫瘤生長(zhǎng)；CENPW的表達(dá)與KIRC患者的總體生存率呈負(fù)相關(guān)，單、多因素COX回歸分析表明CENPW是KIRC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CENPW與患者的預(yù)后有關(guān)。

總之，與正常腎組織相比，CENPW高表達(dá)在KIRC組織中更常見(jiàn)，高表達(dá)的CENPW可以作為患者不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。本次研究是根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果在體外細(xì)胞系mRNA水平驗(yàn)證CENPW的表達(dá)差異,缺少在動(dòng)物水平和人體組織水平證實(shí)本次實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)論，同時(shí)需要進(jìn)一步挖掘CENPW在KIRC發(fā)揮的功能以及與CENPW相關(guān)的信號(hào)通路，以明確其具體作用分子機(jī)制。