贠宇輝，楊三虎，楊 鋒

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科，西安 710000)

肺癌是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，包括非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)[1-2]。NSCLC占所有肺癌的80%～85%，其中以腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)[3]。轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是NSCLC患者死亡的主要原因[4]。因此，闡明NSCLC轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找新的轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)靶向藥物在改善其預(yù)后方面具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是一種短片段的單鏈內(nèi)源性保守的RNA分子，通過(guò)調(diào)控靶基因在疾病中發(fā)揮作用[5]。miR-185-5p是新近發(fā)現(xiàn)的在肺癌中失調(diào)的miRNA之一，其參與乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等多種實(shí)體瘤的發(fā)展[6-8]。醛酮還原酶1家族成員C1(aldehyde ketone reductase 1 family member C1，AKR1C1)是人類(lèi)醛酮還原酶家族成員，該家族由AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4 4種酶組成，均具有催化還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的作用[9]。有研究[10]證實(shí)，AKR1C1參與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥惡變過(guò)程，但是其與miR-185-5p在肺癌中的關(guān)系尚不清楚。本研究擬以肺癌為研究對(duì)象，觀(guān)察miR-185-5p在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響，并探討miR-185-5p與AKR1C1之間的靶向關(guān)系，為晚期肺癌治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

收集空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2018年4月至2021年1月期間行肺癌切除術(shù)患者的癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本各31例。所有患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：1)自愿參與并簽署知情同意書(shū)；2)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南(2019版)[10]診斷肺癌的標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并其他惡性腫瘤；2)不符合醫(yī)學(xué)倫理，如孕婦、晚期且生存期不足3個(gè)月者。

1.2 細(xì)胞系和主要試劑

人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、肺癌細(xì)胞A549、H460均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；LipofectamineTM3500轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol液均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RT-qPCR試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；Transwell小室(8.0 μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；兔抗人AKR1C1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自上海Abcam公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；miR-185-5p、anti-miR-185-5p、AKR1C1-WT、AKR1C1-MUT及所有引物的設(shè)計(jì)合成均由上海吉瑪科技有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將組織樣本分為癌旁組和肺癌組；常規(guī)培養(yǎng)的BEAS-2B、A549、H460細(xì)胞分別標(biāo)記為BEAS-2B組、A549組、H460組；A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-185-5p組(轉(zhuǎn)染miR-185-5p)、miR-185-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-185-5p和pcDNA)、miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1組(共轉(zhuǎn)染miR-185-5p和pcDNA-AKR1C1)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染

于37 ℃、含5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BEAS-2B、A549、H460細(xì)胞。每隔2～3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基。按照脂質(zhì)體：質(zhì)?；蚝怂嵝蛄袨?:1的比例混勻后與A549細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，RT-qPCR或蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-185-5p、AKR1C1的表達(dá)

將需要檢測(cè)的組織充分研磨，細(xì)胞收集待用。用TRIzol液提取總RNA，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。使用RT-qPCR試劑盒檢測(cè)模板中miR-185-5p、AKR1C1的表達(dá)情況。以U6或GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct計(jì)算miR-185-5p、AKR1C1的相對(duì)表達(dá)量。引物信息見(jiàn)表1。

表1 靶基因的引物序列

1.3.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲

將需要檢測(cè)的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，再用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整至5×104個(gè)·mL-1，待用。取200 μL置于Transwell小室的上層，均勻涂抹，下室置于600 μL的含血清培養(yǎng)基，37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出小室，拭去未發(fā)生穿膜的細(xì)胞，用甲醇固定20 min，甲基藍(lán)結(jié)晶紫染液染色15 min，顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目。計(jì)數(shù)3次，取平均值。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的操作步驟同上，Transwell小室更換為含有基質(zhì)膠的上層膜。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞傷口愈合

將待檢測(cè)的細(xì)胞接種到6孔板，每孔5×105個(gè)。使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%，用無(wú)菌10 μL槍頭，垂直細(xì)胞板劃出“一”字傷口，再用無(wú)血清培養(yǎng)基漂洗。倒置顯微鏡下拍照記錄原始的劃痕寬度。再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后記錄愈合后傷口寬度。使用Image J軟件分析傷口的愈合率(%)=(初始傷口寬度-愈合后傷口寬度)/初始傷口寬度×100%。

1.3.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKR1C1、MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)

充分無(wú)菌研磨組織，用4倍體積的裂解液充分裂解，提取總蛋白。待檢測(cè)的細(xì)胞使用裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，沸水浴法變性蛋白，取10 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，并將膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜用含有2.5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃孵育處理2 h。充分洗膜，浸入稀釋好的一抗(AKR1C1、MMP-2、MMP-9)中4 ℃孵育過(guò)夜。充分洗膜，浸入稀釋過(guò)的二抗溶液(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔)中，37 ℃孵育2 h。洗膜，滴加ECL電化學(xué)發(fā)光試劑顯影、曝光。Image J軟件分析蛋白的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性

使用靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)miR-185-5p的下游靶基因?；瘜W(xué)合成含有AKR1C1 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的片段(AKR1C1-WT)、不含AKR1C1 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的突變片段(AKR1C1-MUT)，并插入熒光載體，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體。將載體分別與miR-NC、miR-185-5p、anti-miR-NC、anti-miR-185-5p共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)分析細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-185-5p在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示：肺癌組miR-185-5p的表達(dá)水平較癌旁組顯著降低[(0.46±0.06)比(1.00±0.09)，t=14.977，P<0.001]；與BEAS-2B組(1.01±0.07)比較，A549組(0.25±0.07)和H460組(0.57±0.06)miR-185-5p的表達(dá)水平均顯著降低(F=293.373，P<0.001)。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-185-5p對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-185-5p組A549細(xì)胞的miR-185-5p表達(dá)[(3.79±0.46)比(0.99±0.07)，t=18.053，P<0.001]顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)[(77±8)比(100±8)，t=6.099，P<0.001]和侵襲細(xì)胞數(shù)[(48±6)比(74±8)，t=7.800，P<0.001]及劃痕愈合率[(47.83±4.42)%比(81.79±8.85)%，t=10.294，P<0.001]均顯著降低，MMP-2 [(0.59±0.07)比(0.98±0.08)，t=11.006，P<0.001]、MMP-9 [(0.42±0.08)比(0.99±0.07)，t=16.086，P<0.001]的蛋白表達(dá)均顯著降低。見(jiàn)圖1。

A：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲；B：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞傷口愈合；C：蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2.3 miR-185-5p靶向AKR1C1

Starbase預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：miR-185-5p與AKR1C1之間存在連續(xù)的互補(bǔ)結(jié)合序列。見(jiàn)圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，miR-185-5p組AKR1C1-WT細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2B。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，miR-185-5p組細(xì)胞中AKR1C1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-185-5p組細(xì)胞中AKR1C1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2C。

A：Starbase預(yù)測(cè)結(jié)果；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性；C：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKR1C1蛋白表達(dá)；1為miR-NC組；2為miR-185-5p組；3為anti-miR-NC組；4為anti-miR-185-5p組；*P<0.05與miR-NC組比較；#P<0.05與anti-miR-NC組比較。

2.4 AKR1C1在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

與癌旁組比較，肺癌組中AKR1C1 mRNA [(6.21±0.86)比(1.01±0.09)，t=18.041，P<0.001]和蛋白表達(dá)[(1.87±0.19)比(0.99±0.10)，t=12.296，P<0.001]均顯著升高；與BEAS-2B組比較，A549組細(xì)胞中AKR1C1 mRNA [(3.78±0.52)比(1.00±0.09)，t=15.804，P<0.001]和蛋白表達(dá)[(1.55±0.17)比(1.01±0.09)，t=8.422，P<0.001]均顯著升高。見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)AKR1C1蛋白在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

2.5 過(guò)表達(dá)AKR1C1部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-185-5p對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的抑制

與miR-185-5p+pcDNA組比較，miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1組A549細(xì)胞中miR-185-5p表達(dá)[(0.47±0.06)比(1.01±0.08)，t=186.088，P<0.001]顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)[(95±8)比(80±8)，t=11.297，P<0.001]、侵襲細(xì)胞數(shù)[(71±8)比(50±6)，t=30.640，P<0.001]及劃痕愈合率[(83.15±8.86)%比(50.99±8.81)%，t=54.341，P<0.001]均顯著升高；，MMP-2 [(1.38±0.17)比(0.99±0.10)，t=26.171，P<0.001、MMP-9的蛋白表達(dá)[(1.66±0.09)比(0.98±0.04)，t=84.991，P<0.001]均顯著升高。見(jiàn)圖4。

A：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲；B：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞傷口愈合；C：蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)；1為miR-185-5p組；2為miR-185-5p+pcDNA組；3為miR-185-5p+pcDNA-AKR1C1組。

3 討論

miR-185-5p在多種人類(lèi)癌癥中發(fā)揮抗癌作用，但是其作用機(jī)制仍不明確。近期有研究[11]顯示，miR-185-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，其通過(guò)靶向Rab鳥(niǎo)嘌呤三核苷酸磷酸酶家族成員(RAB35)參與癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲過(guò)程。CAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在肺鱗癌中miR-185-5p不僅作為前列腺雄激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物1(lncRNA PART1)的下游靶點(diǎn)，還直接靶向下游的sineoculis同源框同源物1(Six1)，調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡，參與肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展。LI等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p作為長(zhǎng)非編碼RNA(LncRNAs)LINC00205的下游靶點(diǎn)，減弱LINC00205對(duì)肺腺癌增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)降低；過(guò)表達(dá)miR-185-5p可明顯抑制肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲及其相關(guān)基因MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)。故本研究證實(shí)miR-185-5p作為抑癌因子在肺癌中發(fā)揮抗癌作用，這與前述研究報(bào)道相一致。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p直接靶向AKR1C1，且負(fù)向調(diào)控肺癌細(xì)胞中AKR1C1蛋白的表達(dá)，這提示miR-185-5p抑制肺癌的作用可能與AKR1C1的表達(dá)有關(guān)。

AKR1C1及其家族成員參與肺癌的致癌物多環(huán)芳烴的代謝，因此長(zhǎng)期煙草侵蝕會(huì)誘導(dǎo)肺組織中AKR1C1的表達(dá)，參與吸煙相關(guān)肺癌的發(fā)病，還在雄激素、孕酮等固醇類(lèi)激素的代謝中發(fā)揮重要作用[14-15]。除與激素相關(guān)的卵巢癌、膀胱癌有關(guān)外，AKR1C1與肺癌的發(fā)展亦緊密相關(guān)[15]。ZHU等[16-17]報(bào)道，AKR1C1伴轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中的表達(dá)異常上調(diào)，且與患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后不良緊密相關(guān)；此外，AKR1C1的促腫瘤轉(zhuǎn)移作用與其激活STAT3與JAK2之間的相互作用進(jìn)而促進(jìn)STAT3的反式激活緊密相關(guān)，而脫乙?；窼irtuin 2(SIRT2)能夠使AKR1C1脫乙酰基，抑制STAT3靶基因的反式激活，從而抑制細(xì)胞的遷移。HUANG等[18]發(fā)現(xiàn)AKR1C1是肺癌生存相關(guān)基因，在肺癌中高表達(dá)，沉默AKR1C1可明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)鐵死亡。本研究也發(fā)現(xiàn)肺癌組織和細(xì)胞系中AKR1C1的表達(dá)顯著升高。而且，本研究還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AKR1C1可部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-185-5p對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用，這證實(shí)miR-185-5p抑制肺癌的作用是通過(guò)負(fù)性調(diào)控AKR1C1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，miR-185-5p可抑制肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，該作用可能與靶向調(diào)控AKR1C1有關(guān)。但是，本研究?jī)H是基于細(xì)胞水平的研究，后續(xù)應(yīng)從動(dòng)物水平驗(yàn)證在肺癌中miR-185-5p與AKR1C1的關(guān)系及其作用。