張建棟 李梁和 程海玉 姜洞彬 楊勤 詹瑋

作者單位：550004 貴陽(yáng) 貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(張建棟，姜洞彬)；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科(李梁和)；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科(程海玉，詹瑋)；貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室(楊勤)

肝癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最新一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，亞太地區(qū)肝臟疾病死亡的患者中43.6%為肝癌患者，高于美國(guó)33.9%及歐洲地區(qū)39.4%[1]。由于肝臟結(jié)構(gòu)和功能特殊性，肝癌早期確診和就診率不高，是肝癌病死率偏高和5年生存率較低的原因之一[2-4]。肝癌的發(fā)生、發(fā)展被認(rèn)為與異常的組蛋白乙?；揎椝疥P(guān)聯(lián)密切，在肝癌細(xì)胞組蛋白H3的肽鏈結(jié)構(gòu)中，位于第9位的賴氨酸常常發(fā)生乙?；揎?(histone H3 lysine 9 acetylation, acH3K9) 異常，而關(guān)于肝癌細(xì)胞組蛋白H3K14、H3K18、H3K27位點(diǎn)的乙酰化修飾的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探索人肝癌細(xì)胞株MHCC-97L中組蛋白乙酰化修飾的相關(guān)位點(diǎn)的變化情況，以期了解相關(guān)位點(diǎn)組蛋白乙酰化與肝癌發(fā)生之間的相關(guān)性，旨為臨床肝癌的早期診療和藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和藥物開(kāi)發(fā)提供參考。

材料與方法

一、細(xì)胞株及主要試劑

人正常肝細(xì)胞株LO2及人低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L由貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；DNaseⅠ、彩虹Maker購(gòu)于Solarbio公司；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BAC蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、AlexaFiuor488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、DyLight549標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購(gòu)自上海碧云天公司；E-Plate檢測(cè)板購(gòu)自埃森生物有限公司；acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體購(gòu)于Abcam公司，低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)TDZ-WS，購(gòu)于湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

二、主要方法

(一)體外細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇人正常肝LO2細(xì)胞及人低轉(zhuǎn)移性肝癌MHCC-97L細(xì)胞，分別置于含青、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基換液，細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

(二)RTCA檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 向E-Plate檢測(cè)板中加入培養(yǎng)基并測(cè)定背景阻抗值；向相同培育條件下的兩組E-Plate檢測(cè)板中加入適量狀態(tài)良好的人正常肝LO2細(xì)胞或人低轉(zhuǎn)移性肝癌MHCC-97L細(xì)胞，室溫超凈臺(tái)內(nèi)放置30 min；后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱，于培養(yǎng)箱中予RTAC xcell-Ligence動(dòng)態(tài)觀察對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的LO2細(xì)胞或MHCC-97L細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞增殖檢測(cè)并將二者的增長(zhǎng)曲線繪制成圖。

(三)免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)比細(xì)胞凋亡情況 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常肝LO2細(xì)胞、人低轉(zhuǎn)移性肝癌MHCC-97L細(xì)胞于培育皿中孵育培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后使用Annexin V-FITC/PI雙染法，順序加入Annexin V-FITC結(jié)合液15 μL/皿，Annexin V-FITC 5 μL/皿，PI 10 μL/皿，室溫?fù)u床避光孵育20 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，分析細(xì)胞凋亡情況。

(四)提取細(xì)胞核及核蛋白制備 通過(guò)核漿分離技術(shù)提取人正常肝LO2細(xì)胞及人低轉(zhuǎn)移性肝癌MHCC-97L細(xì)胞核蛋白，按每1×106個(gè)細(xì)胞比率加入裂解液100 μL，核蛋白酶抑制劑1 μL，冰上裂解30 min，以60 g轉(zhuǎn)速低溫離心10 min，-80 ℃下保存待用[5]。

(五)Western Blot檢測(cè)組蛋白乙?；稽c(diǎn)修飾情況 將提取的核蛋白分別置入120 g/L的SDS-PAGE中電泳，使用甲醇濕法電轉(zhuǎn)移法，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜室溫下以5%脫脂奶粉搖床封閉2 h；加入單克隆抗體(一抗，分別采用組蛋白乙酰化修飾位點(diǎn)H3K14、H3K18、H3K27抗體1:1000及H3抗體1:400)，4 ℃下低溫過(guò)夜；加入TBS洗滌液，洗膜后3～4次，再放入用TBS(按1∶1000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗)，于室溫下?lián)u床上反應(yīng)1 h進(jìn)行標(biāo)記；TBS洗滌液洗膜，加入曝光液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光后以H3為內(nèi)參，通過(guò)Image Lab圖像軟件定量分析H3K14、H3K18、H3K27組蛋白條帶灰度值，對(duì)比其乙?；揎椝?。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人正常肝細(xì)胞株LO2與人低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L細(xì)胞形態(tài)圖比較

在相同的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，人低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L細(xì)胞核體積大，呈多形性，核分裂增多。

注：A.LO2(×200)；B.MHCC-97L(×200)

二、人正常肝細(xì)胞株LO2與人低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L兩種細(xì)胞株增殖對(duì)比

根據(jù)RTCA結(jié)果顯示，在相同條件下，培養(yǎng)初期人低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L與人肝細(xì)胞株LO2均保持一定的增殖速度，MHCC-97L細(xì)胞株增殖速度高于LO2細(xì)胞株，兩組細(xì)胞株增殖數(shù)目均與時(shí)間呈正比。隨培養(yǎng)時(shí)間的推移，LO2細(xì)胞株增殖速度逐漸下降，相同條件下培育48 h后，人肝細(xì)胞株LO2細(xì)胞指數(shù)趨于穩(wěn)定，而人低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L有無(wú)限增殖趨勢(shì)，增殖速度明顯大于LO2細(xì)胞株(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 兩組細(xì)胞株細(xì)胞指數(shù)水平隨培養(yǎng)時(shí)間增加的對(duì)比(±s, n=3 )

三、細(xì)胞凋亡情況

經(jīng)Annexin V-FITC/PI法染色后，凋亡早期的細(xì)胞，細(xì)胞膜會(huì)被綠染，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常LO2細(xì)胞、MHCC-97L細(xì)胞48 h后自然凋亡情況差異不大。

注：A.LO2；B.MHCC-97L

四、LO2與MHCC-97L細(xì)胞acH3K14、acH3K18、acH3K27位點(diǎn)乙?；稽c(diǎn)修飾水平

通過(guò)Western Blot法檢測(cè)分析，與LO2細(xì)胞株相比，MHCC-97L細(xì)胞株中acH3K14、acH3K18、acH3K27位點(diǎn)乙?；揎椇蟮牡鞍琢勘磉_(dá)較正常細(xì)胞株更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3及表2)。

表2 兩組細(xì)胞株間acH3K14、acH3K18、acH3K27相對(duì)表達(dá)水平的比較(H3, ±s, n=6 )

討 論

肝癌早期檢出率不高，多數(shù)患者被確診為肝癌時(shí)已達(dá)晚期[5]，提升早期診斷率與治療途徑，是肝癌防治的艱巨任務(wù)。國(guó)內(nèi)外研究[6-8]陸續(xù)證實(shí)，肺癌、乳腺癌、前列腺癌及甲狀腺癌患者中乙酰化的組蛋白表達(dá)低于同類正常人，組蛋白乙酰化修飾水平的異常是癌癥發(fā)生、發(fā)展的潛在通路。

圖3 Western blot檢測(cè)LO2與MHCC-97L的acH3K14、acH3K18、acH3K27位點(diǎn)乙酰化修飾情況

針對(duì)肝癌細(xì)胞中組蛋白乙?；揎椝綄?duì)肝癌進(jìn)展的影響，研究表明人肝癌細(xì)胞中H3組蛋白乙?；矫黠@低于人正常肝細(xì)胞[9]，且已有學(xué)者通過(guò)對(duì)手術(shù)切除肝癌組織的研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌組織的H3組蛋白乙?；矫黠@低于臨近的非癌變的正常肝臟組織[10]。肝臟組蛋白H3乙?；较抡{(diào)與肝癌發(fā)生相關(guān)，有學(xué)者預(yù)測(cè)這可能是組蛋白H3乙?；浇档?，間接導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄的沉默而誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[11-12]。組蛋白乙?；揎椂喟l(fā)生在H3組蛋白賴氨酸殘基上的9、14、18、23位點(diǎn)[13]，國(guó)內(nèi)學(xué)者張婷[14]通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定出人肝癌細(xì)胞中組蛋白H3K9位點(diǎn)的乙?；捷^人正常肝細(xì)胞低。學(xué)者Wang等[15]通過(guò)人正常肝細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人肝癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果證實(shí)人肝癌細(xì)胞組蛋白H3乙?；磉_(dá)下調(diào)，肝癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞表達(dá)水平較肝癌細(xì)胞的H3乙酰化更低。關(guān)于肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具體哪些位點(diǎn)發(fā)生變化，以及這些位點(diǎn)的變化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系罕見(jiàn)報(bào)道，尚無(wú)報(bào)道證實(shí)轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞中組蛋白H3K14、H3K18及H3K27位點(diǎn)修飾水平的變化情況。

本研究以人正常肝細(xì)胞株LO2為對(duì)照，對(duì)比研究低轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC-97L的組蛋白乙?；剑琖estern Blot法檢測(cè)acH3K14(組蛋白H3位于第14位的賴氨酸發(fā)生乙酰化修飾，histone H3 lysine 14 acetylation)、acH3K18、acH3K27修飾水平是否存在異常。研究結(jié)果顯示相比正常肝細(xì)胞株LO2，低遷移肝癌細(xì)胞株MHCC-97L的acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示以上位點(diǎn)組蛋白乙酰化修飾水平的下調(diào)程度可能與肝癌細(xì)胞的發(fā)生有關(guān)，這與已有相關(guān)肝癌組蛋白乙酰化的研究具有一致性。組蛋白乙酰化與去乙?；g保持動(dòng)態(tài)平衡，特定位點(diǎn)組蛋白乙?；揎椝降母淖?，也可激活或沉默基因的轉(zhuǎn)錄[16]，這一特性為腫瘤早期的臨床診療和藥物開(kāi)發(fā)提供了一種思路。國(guó)外學(xué)者已通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，組蛋白修飾水平的異常發(fā)生在肝癌早期[17]，通過(guò)檢測(cè)H3組蛋白特定位點(diǎn)如K36甲基化修飾的表達(dá)水平，可對(duì)肝癌的生物學(xué)特征如血管浸潤(rùn)程度、異質(zhì)性及分化程度等情況進(jìn)行判斷[18-19]，使得從表觀遺傳分子水平進(jìn)一步診治肝癌成為可能。本研究對(duì)于肝癌組蛋白特定位點(diǎn)乙?；礁淖兊奶接懣山沂舅鼈?cè)诟伟┌l(fā)生中的作用，且有可能為肝癌早期診斷提供新思路，有助于尋找防治肝癌的可能靶點(diǎn)。

肝癌的發(fā)生是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，本研究探討了肝癌細(xì)胞中相應(yīng)組蛋白修飾位點(diǎn)乙酰化的變化情況，acH3K14、acH3K18及acH3K27修飾水平下調(diào)與肝癌發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，而是否可通過(guò)改變上述組蛋白位點(diǎn)的乙酰化水平影響肝癌細(xì)胞狀態(tài)，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。