衛(wèi)小娟，李樹德，黃映光，李青玲，李治綱，何水旺，李思熳*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，云南 昆明 650500；2.中國科學(xué)院 昆明動物研究所，云南 昆明 650201;3.云南省第一人民醫(yī)院 普外一科，云南 昆明 650032)

中草藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要醫(yī)用資源，也是千百年來我國無數(shù)醫(yī)者理論和實踐的積累，而關(guān)于中草藥中特定成分及其治療效果研究也成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究熱點.姜黃作為傳統(tǒng)中藥，能行氣破瘀，通經(jīng)止痛.主治胸腹脹痛、肩臂痹痛、心痛難忍、產(chǎn)后血痛、瘡癬初發(fā)、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、跌打損傷[1].姜黃素(Curcumin，Cur)是姜黃根莖中主要的天然多酚.作為姜黃的主要提取物，其最初作為食品添加劑用于食品著色，而近年來的研究[2]表明其具有抗氧化、抗炎癥的作用.姜黃素極低的毒副作用和廣泛的生物活性，為研究臨床疾病的治療提供了新的方向.姜黃素除有抗癌作用外，對心血管系統(tǒng)、急性肺損傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎組織損傷和肝組織損傷均有良好的保護和緩解作用[3-23].

目前對姜黃素的藥用研究主要集中在抗腫瘤作用上，已有研究[3-5]顯示，姜黃素在前列腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、非小細胞肺癌和白血病治療中能誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖和遷移.除了具備抗腫瘤效果，多項研究[6-8]顯示，姜黃素可以通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡，對心血管系統(tǒng)起到保護作用.糖尿病患者的心血管疾病往往由體內(nèi)長期的高糖環(huán)境誘發(fā)，并多表現(xiàn)為細胞凋亡與壞死，但是姜黃素對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護研究較少，且對于不同的細胞，姜黃素的最適作用濃度有所不同.在細胞凋亡過程中，Caspase與真核細胞凋亡密切相關(guān)，其中Caspase 3在細胞凋亡過程中有著舉足輕重的位置，它是一種促進細胞凋亡的蛋白酶，它的作用底物很多，其中大部分可被Caspase 3水解[9-11].本研究旨在通過檢測H9c2心肌細胞增殖活力和Caspase 3及活性片段Cleaved-Caspase 3的蛋白表達，篩選出姜黃素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷預(yù)防的最適濃度.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

姜黃素(C21H20O6)購自西安首禾生物科技有限公司，分子質(zhì)量為368.39，以二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成 0.1 mol/L 儲存液置于 4 ℃ 避光保存.二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio公司，CCK8試劑盒購自Biosharp公司，DMEM 低 NaHCO3基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，0.25%EDTA胰蛋白酶購自Gibco公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海源培生物科技股份有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Gibco公司，GAPDH、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3抗體購自Affinity Biosciences公司，蛋白定量試劑盒(BCA 法)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司.

1.2 細胞培養(yǎng)

H9c2(2-1)大鼠正常心肌細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫.將H9c2細胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，加入含有10%FBS和1%雙抗的DMEM低NaHCO3基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱中 37 ℃ 環(huán)境下培養(yǎng)，2～3 d 傳代，穩(wěn)定傳代3次后，取細胞進行實驗.

1.3 實驗分組及細胞處理

實驗分為正常組、模型組、4×10-6mol/L 處理組、8×10-6mol/L 處理組、12×10-6mol/L 處理組、16×10-6mol/L 處理組、20×10-6mol/L 處理組，實驗各組處理詳見表1.

表1 實驗分組與處理

1.4 CCK8法檢測細胞增殖活力

取穩(wěn)定傳代，生長密度達80%以上，且狀態(tài)良好的H9c2細胞，棄上清，用PBS洗3次，胰酶消化并收集細胞，重懸，計數(shù).調(diào)整細胞懸液，最終使96孔板中每孔細胞數(shù)在 5 000 個左右.然后將96孔板放入培養(yǎng)箱中，孵育 24 h 使細胞貼壁.按表1處理細胞，并設(shè)置空白組(無細胞)，每組6個復(fù)孔.處理完成后，棄去96孔板中原培養(yǎng)基，每孔加入1.0×10-4L 提前配好的含有CCK8的培養(yǎng)基(CCK8∶培養(yǎng)基=1∶10)，在5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃ 環(huán)境下培養(yǎng) 4 h 后，使用酶標儀測其OD值(使用光源波長為 450 nm).收集數(shù)據(jù)并按照下式計算各組細胞的增殖活力：

細胞增殖活力=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)]×100%.

1.5 Western blotting檢測凋亡蛋白的表達

按表1處理細胞后，棄去原培養(yǎng)基，使用PBS洗3次，胰酶消化后收集細胞；加入細胞裂解液與蛋白磷酸酶抑制劑混合物于細胞中，在冰上裂解 30 min，制成的蛋白樣品采用BCA法檢測蛋白樣品的濃度，并用1Χ Buffer和無菌水將各蛋白樣品濃度調(diào)整到同一濃度，100 ℃ 變性 10 min；每個泳道上樣 3×10-5g，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，在半干轉(zhuǎn)膜儀中將目標蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶 37 ℃ 封閉 40 min；TBST洗膜，再用抗體稀釋液根據(jù)說明書稀釋的一抗常溫孵育 30 min 之后，在 4 ℃ 環(huán)境下過夜孵育 8 h；TBST洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)常溫孵育 2 h；TBST洗膜，用ECL顯影液對目的條帶進行顯影，GAPDH作為內(nèi)參；使用Image J軟件對圖片進行掃描和分析.

1.6 形態(tài)學(xué)觀察

選取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞棄上清，加PBS洗3次，胰酶消化并收集細胞，重懸細胞，并計數(shù).調(diào)整細胞懸液，使細胞密度在5×105個/mL，每孔加細胞懸液 2 mL.將鋪好板的6孔板放入培養(yǎng)箱中，孵育 24 h 使細胞貼壁.吸去原培養(yǎng)基，PBS洗3次，正常組和模型組分別加 1 mL 正常培養(yǎng)基，姜黃素4×10-6mol/L 處理組加入 1 mL 含姜黃素的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 4 h.棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，正常組中加 2 mL 完全培養(yǎng)基，其他組中按 2 mL/孔分別加入含 0.1 mol/L 高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 h.普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化.

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS V17.0或Graphpad Prism 6.0軟件分析，采用(平均值±標準差)表示.兩組數(shù)據(jù)間使用獨立樣本t檢驗進行比較，兩組以上的多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01表示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義.使用Graphpad Prism 6.0軟件進行繪圖.

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞的增殖活力的影響

如圖1所示，高糖處理的H9c2細胞增殖活力為(61.92±13.07)%；使用姜黃素預(yù)處理的H9c2細胞增殖活力，除12×10-6mol/L 處理組(58.78±6.27)%、16×10-6mol/L 處理組(61.91±12.97)%外，其余各組均有所上升，分別為：4×10-6mol/L 處理組(68.46±15.25)、8×10-6mol/L 處理組(68.67±17.69)%、20×10-6mol/L 處理組(62.66±17.26)%，但姜黃素各濃度組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

與正常組比##P<0.01圖1 不同濃度姜黃素對H9c2細胞增殖活性的影響

2.2 姜黃素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞的凋亡蛋白表達的影響

如圖2結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的Caspase 3的蛋白表達水平顯著上調(diào)；與模型組相比，姜黃素各濃度組Caspase 3的蛋白表達水平顯著下調(diào)；且隨著姜黃素濃度升高 (4×10-6～16×10-6mol/L 范圍內(nèi))，Caspase 3蛋白表達水平逐漸下調(diào)，但其濃度達到20×10-6mol/L 時Caspase 3蛋白表達水平又開始上調(diào).

如圖3結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的Cleaved-Caspase 3的蛋白表達水平下調(diào)(P>0.05)；與模型組相比，姜黃素4×10-6mol/L 時Cleaved-Caspase 3的蛋白表達依然下調(diào)(P>0.05)；其他各濃度組相比于模型組，Cleaved-Caspase 3的蛋白表達均顯著上調(diào)，12×10-6mol/L 時上調(diào)最明顯.

(a)Caspase 3蛋白的表達 (b)Caspase 3蛋白表達的灰度值與正常組比##P<0.01，與模型組比**P<0.01圖2 不同濃度姜黃素處理H9c2細胞中Caspase 3的蛋白表達水平

(a)Cleaved-Caspase 3蛋白的表達 (b)Cleaved-Caspase 3蛋白表達的灰度值與正常組比##P<0.01，與模型組比**P<0.01圖3 不同濃度姜黃素處理H9c2細胞中Cleaved-Caspase 3的蛋白表達水平

2.3 不同處理條件下H9c2細胞形態(tài)變化

根據(jù)CCK8檢測結(jié)果和WB結(jié)果，我們選擇4×10-6mol/L 作為預(yù)防高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷的最佳作用濃度.觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常組的H9c2心肌細胞形態(tài)呈梭形，均勻分布于培養(yǎng)皿中，且排列緊密，無異形；模型組中H9c2心肌細胞形態(tài)不規(guī)則、數(shù)量減少且分布不均勻，細胞間出現(xiàn)較大空隙；姜黃素4×10-6mol/L 處理組的H9c2細胞形態(tài)和數(shù)量恢復(fù)，細胞分布均勻、排列緊密，與正常組細胞形態(tài)無較大差異(圖4).

正常組 模型組姜黃素4×10-6 mol/L處理組圖4 H9c2細胞在不同處理條件下的形態(tài)變化(40×)

3 討論與結(jié)論

對于不同的細胞或不同處理后的相同細胞，姜黃素的最佳作用濃度不同.有研究[24]顯示，姜黃素可以降低EC9706和TE13細胞中p-STAT3的蛋白表達，且存在劑量依賴性.HOSSEINZADEH L[25]等人用不同濃度(5×10-6～50×10-6mol/L)的姜黃素預(yù)處理可使H9c2細胞通過產(chǎn)生ROS致敏DOX介導(dǎo)的凋亡.也有研究[7]顯示，10×10-6mol/L 的姜黃素能夠通過抑制H9c2心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減弱棕櫚酸誘導(dǎo)的細胞凋亡.在本研究中，前期通過CCK8結(jié)合WB結(jié)果，最終確定 4×10-6mol/L 為姜黃素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷預(yù)防的最適濃度.而形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn) 4×10-6mol/L 姜黃素處理組的H9c2細胞形態(tài)和數(shù)量恢復(fù)，細胞分布均勻，細胞排列緊密，與正常組細胞形態(tài)無較大差異.

綜上所述，姜黃素可以通過抑制細胞凋亡，增加細胞增殖活力，緩解高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷.其中姜黃素濃度為4×10-6mol/L 時，對H9c2細胞具有最優(yōu)的保護作用.本研究結(jié)果可為姜黃素在高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷治療方面提供實驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也可為相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供參考.