袁紅朝 賀 珍 張麗萍 耿梅梅 許麗衛(wèi) 陳 聞 彭 燦 李春勇 王久榮*

(1. 中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；2.農(nóng)業(yè)生態(tài)工程湖南省重點實驗室，長沙 410125)

土壤中銨態(tài)氮以銨根離子(NH4+)形態(tài)存在，是植物可吸收利用的主要氮素形態(tài)之一[1]，也是水體環(huán)境污染的主要來源[2]。穩(wěn)定同位素氮示蹤技術(shù)包括N自然豐度技術(shù)和富集標(biāo)記技術(shù)，在土壤有機氮的周轉(zhuǎn)、氮肥的使用效率、農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地朔源以及氮素的淋失和面源污染等研究中得到廣泛應(yīng)用[3-8]，而其中涉及NH4+—N同位素比值的精準(zhǔn)測定。

目前，土壤銨態(tài)氮提取后不能直接進行穩(wěn)定同位素比值檢測，需要進行前處理。土壤銨態(tài)氮中氮穩(wěn)定同位素比值測定的前處理流程主要包括：1)銨態(tài)氮的分離與吸收；2)將銨態(tài)氮制備成可供同位素質(zhì)譜儀檢測的樣品。合適的樣品前處理方法對樣品質(zhì)譜分析檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用[9-12]。其中，土壤銨態(tài)氮分離吸收的主要方法有：蒸氣蒸餾法[13]和微擴散法[14]。傳統(tǒng)蒸餾法單個樣品的處理時間短，效率比較高，但實驗過程操作繁瑣、樣品蒸餾之間會產(chǎn)生交叉污染，且無法實現(xiàn)批量樣品處理；而擴散法儀器操作簡單，可實現(xiàn)樣品的批處理，但擴散培養(yǎng)耗時長(需要48 h及以上)。通過分離濃縮后的銨鹽可通過元素分析儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用進行15N豐度檢測[9-10，15]或用化學(xué)方法將微量的銨轉(zhuǎn)化為N2O氣體，然后用帶自動預(yù)濃縮裝置的同位素比值質(zhì)譜儀測定N2O 中的15N豐度[11-12]。相較于元素分析儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用法進行15N豐度檢測，需要50 μg氮量所產(chǎn)生的氮氣才能進行15N豐度的精準(zhǔn)測定，而通過化學(xué)方法將微量的銨轉(zhuǎn)化為N2O氣體再利帶自動預(yù)濃縮裝置的同位素比值質(zhì)譜儀測定N2O 中的15N 豐度，檢測限降低1個數(shù)量級[11，15]。但該方法N2O的產(chǎn)率最高僅為25%左右，有待進一步優(yōu)化。

針對以上問題，本研究在上述方法[11-12，15-16]的基礎(chǔ)上創(chuàng)新了蒸餾方法，大幅提高了樣品的批處理效率，并對化學(xué)轉(zhuǎn)化方法的條件進行了探索優(yōu)化，建立一種快速蒸餾法結(jié)合高效化學(xué)轉(zhuǎn)化的N2O發(fā)生的銨態(tài)氮中氮穩(wěn)定同位素比值測定前處理方法。通過考察不同反應(yīng)條件對銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化N2O產(chǎn)率的影響，明確了最適宜的方法條件。通過分析不同濃度條件下自然豐度、15N富集和標(biāo)記的NH4+—N標(biāo)準(zhǔn)溶液對整個分析流程進行了方法學(xué)驗證。同時還考察了該方法對于兩種不同土地利用類型土壤銨態(tài)氮中氮穩(wěn)定同位素比值測定的適用性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

PreCon痕量氣體預(yù)濃縮裝置配備(T1～T3冷阱)，Combi PAL 自動進樣器，96位氣體樣品盤，頂空瓶(12 mL)，化學(xué)阱(填充高氯酸鎂和堿石灰)，PoraPLOT Q 色譜柱，He載氣(氣體純度均>99.999%)。

穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀MAT253：高靈敏度電子轟擊離子源，10 kV 加速電壓，C/N法拉第杯。質(zhì)譜儀主機與外設(shè)的系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)采集和處理均由Isodat NT軟件自動完成。

以上儀器均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

SEAL AA3流動注射儀(德國Norderstedt公司)，Agilent 7890A氣相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

全自動微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置[15]：配備自動進樣器，120位氣體樣品盤(與12 mL頂空瓶匹配)，自動氣體置換及注入系統(tǒng)和自動加液系統(tǒng)等。

全玻璃的半微量蒸氣蒸餾器：全玻璃封閉型的半微量蒸氣蒸餾器。

XS3DU百萬分之一天平(梅特勒-托利多，感量0.001 mg)。

快速蒸氣蒸餾及吸收裝置(見圖1)：裝置使用12 mL螺紋玻璃瓶作為反應(yīng)瓶，配套螺紋密封蓋；氨蒸氣吸收器分為兩部分，其中吸收槽為一體成型的丁腈橡膠空心柱體，柱體有內(nèi)凹槽，可放置6～10 mm的玻璃纖維濾片，濾片上滴加30～50 μL H2SO4-Cu2+吸收液(1 mol/L)，柱體的底部覆膜，可通氣但不通水；頂部設(shè)計為密封墊片，防止氨蒸氣逸散；干式恒溫器配備64位的加熱盤，與反應(yīng)瓶匹配，控溫范圍為室溫～150 ℃，溫度為精度1 ℃。

圖1 NH4+—N 快速蒸氣蒸餾及吸收裝置 Figure 1 Fast steam distillation and absorption unit for ammonium-nitrogen.

1.2 主要試劑與材料

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品

硫酸銨國際標(biāo)準(zhǔn)品：IAEA-N2(δ15Nair=20.3‰)、IAEA 305B(δ15Nair=375.3‰)和IAEA 311(15N=2.05 atom%)，購于IAEA國際原子能機構(gòu)。

硫酸銨實驗室標(biāo)準(zhǔn)品(參考值為δ15NAir‰=-2.7)，購于Sigma-Aldrich，純度≥99.9%。

15N -硫酸銨標(biāo)記材料：15N的豐度10.1 atom%(純度≥99.5%；Sigma-Aldrich)。

硫酸銨標(biāo)記溶液：用低豐度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為稀釋劑，將10.1 atom%15N標(biāo)準(zhǔn)溶液制備成15N豐度2.0 atom%左右的硫酸銨標(biāo)記溶液，其參考值為2.1 atom%。

氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.5%，美國CIL劍橋同位素實驗室公司。

1.2.2 前處理試劑及材料

氯化鉀溶液(1 mol/L)，氧化鎂，堿性次溴酸鈉溶液(含2 mmol/L Cu2+)，具體配制參考已發(fā)表文章[15]。以上所需試劑均購于國藥集團，為分析純試劑；次氯酸鈉溶液(有效氯4%～5%，Sigma-Aldrich)。玻璃纖維GF/D型濾片(Cat No.1823-142，Watman)，實驗用水均為超純水(ELGA OQ015MMX1，電阻率18.2 MΩ.cm@25 ℃)。

1.2.3 土壤提取液制備

土壤樣品采自中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所桃源農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站的長期定位試驗田(111°26′E，28°55′N)的稻田和旱地土壤，土壤具體信息參見表1。

表1 土壤基本理化性質(zhì)

稱取20.00 g(精確至0.001 g)土壤樣品(研磨過2 mm篩，土壤含水量30%)于250 mL螺口聚乙烯瓶中，加入1 mL標(biāo)記硫酸銨溶液(2.1 atom%，約1.0 mg銨態(tài)氮)，然后立即加入100 mL氯化鉀 (1mol/L)提取液，旋緊瓶蓋，置于溫控?fù)u床中，在(20±2) ℃條件下以(220±20) r/min的頻率振蕩1 h，濾液保存于150 mL聚乙烯瓶備用，銨態(tài)氮含量用AA3流動注射儀測定。

1.3.4 參比氣體

N2O 參比氣體：參考值可溯源至法國液空公司的N2O 標(biāo)準(zhǔn)氣體(Lot. 160-401912433-1)，該N2O 參比氣體的δ15NAir‰值為2.2‰±0.3‰。

1.4 實驗條件及優(yōu)化

1.4.1 銨態(tài)氮蒸餾

蒸氣蒸餾法：土壤提取液中加入MgO，在弱堿性條件下銨態(tài)氮經(jīng)蒸氣蒸餾分離出銨態(tài)氮，銨態(tài)氮被濾片中硫酸溶液接收成銨鹽。

反應(yīng)方程式為：[NH4+]+[OH-]→H2O + NH3↑；NH3+[H+]→[NH4+]

本研究利用特制的快速蒸氣蒸餾及吸收裝置(見圖1)替代了傳統(tǒng)的半微量蒸氣蒸餾法，分別選擇硫酸銨和混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品進行蒸餾時間和溫度的實驗，檢驗改進后方法的蒸餾效率。其中混合氨基酸較易高溫水解為NH3，可作為主要的土壤可溶性有機態(tài)氮干擾源，評價檢驗改進后方法的蒸餾效率和有機態(tài)氮熱水解的干擾程度。

1.4.2 銨態(tài)氮-N2O轉(zhuǎn)化

銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化-N2O產(chǎn)生法[11]：真空條件下，溶液中的銨態(tài)氮與堿性次溴酸鈉反應(yīng)，主要產(chǎn)生N2，另外產(chǎn)生一部分N2O。

反應(yīng)方程式為：[NH4+]+[BrO-]→[Br-]+H2O + N2↑+N2O↑

參考ZHANG等[16-17]研究中次氯酸鹽對[NH4+]具有更強氧化性能的表現(xiàn)，本研究選擇次氯酸鹽替代原方法的次溴酸鹽，對化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件進行摸索。由曹亞澄等[11]研究可知，該反應(yīng)過程被Cu2 +催化，受氧化試劑濃度影響并與pH值有關(guān)。因此，考察了室溫條件下，不同堿度和濃度的堿性次氯酸鈉溶液條件下反應(yīng)生成的N2O氣體的濃度，以確定影響N2O產(chǎn)率的參數(shù)及最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.5 銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液及土壤樣品前處理轉(zhuǎn)化

在確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對不同濃度梯度和15N豐度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液進行前處理。具體操作步驟如下：吸取15N系列硫酸銨溶液置于反應(yīng)瓶中(12 mL螺紋玻璃瓶)，反應(yīng)瓶中氮量分別0.5和1.0 μmol，稱取3 mg MgO(按照3 g/L用量)加入反應(yīng)瓶后安裝好氨蒸氣吸收器及螺紋密封蓋。將反應(yīng)瓶放置在干式恒溫器上120 ℃下蒸餾20 min。蒸餾結(jié)束冷卻后，用鑷子將濾片取出放入另一潔凈的反應(yīng)瓶中蓋上密封瓶蓋，轉(zhuǎn)移至全自動微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置抽真空后，利用裝置的加液模式向反應(yīng)瓶中依次加入1 mL反應(yīng)試劑(堿性次氯酸鈉溶液或堿性次溴酸鈉)，最后注入20 mL的惰性He氣。每組標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)6次。反應(yīng)生成的N2O氣體的濃度和15N豐度分別用氣相色譜儀和帶自動預(yù)濃縮裝置的同位素比值質(zhì)譜儀測定。

依據(jù)土壤銨態(tài)氮含量，取1～2 mL土壤浸提液(pH值范圍6.0～8.0，否則需要調(diào)節(jié)pH值，或者加入合適的pH值緩沖溶液)置于12 mL反應(yīng)瓶中，操作同標(biāo)準(zhǔn)樣品，每組樣品重復(fù)6次，同時做試劑空白(本研究中試劑空白本底未檢出)。

1.6 PreCon-IRMS測定15N—N2O豐度的儀器工作條件

預(yù)濃縮裝置氣體流速(He載氣：20 mL/min)，冷阱T2濃縮時間180 s，冷阱T3濃縮時間300 s，色譜柱溫度30 ℃。待儀器穩(wěn)定后，將氣體樣品置于Combi PAL 自動進樣器上，氣體樣品經(jīng)過化學(xué)阱除去大部分的水汽及二氧化碳干擾氣體后依次通過T2/T3冷阱濃縮。濃縮后的含N2O的混合氣通過氣相色譜柱分離，依次進入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀檢測N2O得到15N豐度。

1.7 統(tǒng)計分析

所有測定結(jié)果均為6次重復(fù)的平均值。使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計描述、方差分析(one-way ANOVA)和Duncan檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 銨態(tài)氮的蒸餾效率

不同蒸餾條件下，銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率為35.3%～100.1%(見表2)。銨態(tài)氮的回收率同時受蒸餾溫度和時間的影響。一般情況下，提高蒸餾溫度和延長蒸餾時間可提高銨態(tài)氮的回收率，當(dāng)溫度達到120 ℃及蒸餾時間為20 min時，回收率可達99.6%～100%，延長蒸餾時間，銨態(tài)氮的回收率沒有顯著變化。此外，在相同蒸餾條件下，不同氮含量硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾回收率基本一致?；旌习被針悠吩?0 ℃下未發(fā)現(xiàn)明顯水解現(xiàn)象，當(dāng)溫度達到100至120 ℃后，水解程度逐漸增加，在溫度120 ℃和蒸餾時間為30 min時達到最大值1.1%左右，并已對銨態(tài)氮蒸餾提純產(chǎn)生干擾。因此，最優(yōu)蒸餾條件為：120 ℃下蒸餾20 min。本研究確認(rèn)的最優(yōu)蒸餾時間與傳統(tǒng)蒸餾法單個樣品的處理時間基本一致，但提高了前處理的樣品通量和分析效率。

表2 不同蒸餾條件下銨態(tài)氮的回收率

2.2 銨態(tài)氮化學(xué)轉(zhuǎn)化過程中N2O產(chǎn)率的影響因素

研究中采用氧化性更強的次氯酸鹽替代原方法的次溴酸鹽，考察了不同次氯酸鈉濃度和堿度對銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表3。

研究發(fā)現(xiàn)堿性次氯酸鈉反應(yīng)體系中，不同反應(yīng)條件下銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率在20.5%～62.3%(表3)。同等堿度條件下(NaOH濃度10 mol/L)，次氯酸鈉濃度對銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率影響顯著，其中30 mmol/L氯酸鈉濃度的N2O氣體產(chǎn)率最高，而降低或者升高氯酸鈉濃度，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率均會顯著下降，與ZHANG等[16]的研究結(jié)果一致。銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體的產(chǎn)率同時還受反應(yīng)體系堿度的顯著影響，當(dāng)升高NaOH濃度，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率升高，并在10 mol/L時達到最大值，與曹亞澄等[11 ]和LAUGHLIN[12]結(jié)果一致，但產(chǎn)率較原方法的25%提升至60%以上。而當(dāng)繼續(xù)提高NaOH濃度，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率顯著下降。因此，實驗最終選擇氯酸鈉濃度為30 mmol/L，NaOH濃度為10 mol/L。

表3 不同反應(yīng)條件下銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率

另外，本研究還考察了最優(yōu)反應(yīng)條件下，不同濃度的銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體的產(chǎn)率，結(jié)果見圖2。銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率為25.1%～62.1%，且隨反應(yīng)體系中銨態(tài)氮濃度的增加而升高，當(dāng)反應(yīng)體系N終濃度為0.5 μmol/mL 時，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率達到最大值，且基本穩(wěn)定，不再受銨態(tài)氮N濃度的影響。此外，在保證質(zhì)譜最低檢測限的基礎(chǔ)上(12 mL進樣體積，保證N2O氣體濃度為1.0 μmol/mL以上)，反應(yīng)體系中總氮量不再是銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率的制約因子。當(dāng)總氮量小于0.5 μmol時可考慮減少反應(yīng)體系體積以增加體系中銨態(tài)氮濃度，保證銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率最高。

圖2 不同濃度的銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率Figure 2 Yields of N2O production under different concentrations of NH4+—N.不同字母代表處理之間差異顯著，p<0.05Letters a，b，c represent significant differences of individual parameters between different treatments by Duncan′s test (p<0.05)

2.3 測定銨態(tài)氮中15N比值的精密度和準(zhǔn)確度

不同氮含量和15N豐度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過前處理后結(jié)合氣體預(yù)濃縮裝置與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(PreCon-IRMS)聯(lián)用系統(tǒng)測定其15N豐度，每組測試6 次，獲得的測定結(jié)果見表4。當(dāng)體系中的NH4+—N濃度不低于0.5 μmol/mL時，所有標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨樣品15N比值均能獲得較好的精密度和準(zhǔn)確度。其中自然豐度和低富集樣品的精密度為0.2‰～0.4‰。對于高豐度的標(biāo)記樣品，精密度為0.001 atom%～0.003 atom%(CV在0.1%～0.3%之間)。所有標(biāo)準(zhǔn)品的15N豐度測定值均與參考值一致。

表4 不同銨態(tài)氮含量和15N豐度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液15N比值測定的精密度和準(zhǔn)確度

2.4 土壤浸提液銨態(tài)氮中15N豐度的測定

分別采用新建的方法和原方法對兩種不同土地類型稻田和旱地土壤的銨態(tài)氮進行前處理后測定其15N豐度，結(jié)果見表5。兩種土壤的15N豐度值在2.067 atom%～2.081 atom%，與添加的外源氮15N豐度值基本一致(2.1 atom%)，土壤本底NH4+—N對其的稀釋作用較小。兩種前處理測定土壤浸提液銨態(tài)氮中15N豐度的精度均較為理想，為0.002 atom%～0.013 atom%，其中新方法的精度(CV<0.2%)優(yōu)于原方法(CV>0. 5%)，可完全滿足相關(guān)科研工作的需求。

表5 新方法和原方法測定兩種不同土地利用類型土壤浸提液銨態(tài)氮中15N豐度

3 結(jié)論

蒸餾法結(jié)合N2O 產(chǎn)生法是目前應(yīng)用較廣泛的土壤銨態(tài)氮15N同位素豐度測定前處理方法。改進后的蒸餾法在120 ℃，蒸餾20 min條件下的銨鹽回收效率可達99%以上，且可以實現(xiàn)批量銨態(tài)氮的分離純化，減少了樣品之間的交叉污染。優(yōu)化后N2O 產(chǎn)生法的最優(yōu)條件為次氯酸鈉濃度為30 mmol/L，NaOH濃度為10 mol/L。反應(yīng)體系中總氮量不再是銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成的N2O氣體產(chǎn)率的制約因子，僅需保證反應(yīng)體系銨態(tài)氮濃度為5 μmol/mL及以上，銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為N2O的產(chǎn)率可達60%以上，且測定不同15N豐度的標(biāo)準(zhǔn)樣品均能獲得較理想的分析精度和準(zhǔn)確度，無分餾現(xiàn)象發(fā)生?；趦?yōu)化后的前處理方法建立的銨態(tài)氮中氮穩(wěn)定同位素豐度分析系統(tǒng)測定精度優(yōu)于原方法，且前處理分析時間短，測試樣品通量大，降低了測試精密度對人員操作熟練程度的依賴。新方法的建立將有助于推進土壤有機氮礦化、周轉(zhuǎn)及其影響機制等研究的開展。