裴真巧，王奇志，楊道茂，于海玲

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021)

勝紅薊(AgeratumconyzoidesL.)是菊科勝紅薊屬一年生草本，具有清熱解毒、消炎止血、抗菌及抗胃潰瘍等藥效[1-4].研究表明，勝紅薊內(nèi)生微生物易產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)[5].勝紅薊內(nèi)生微生物的發(fā)酵液及菌體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)和大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)具有較好的抑菌活性[6-8].前期研究發(fā)現(xiàn)，從勝紅薊中分離出來的內(nèi)生真菌發(fā)酵液的粗提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)表現(xiàn)出良好的抑菌活性[9].

目前，利用微生物進行生物轉(zhuǎn)化的研究逐漸引起人們的廣泛關(guān)注，該方法不僅對環(huán)境的影響小，還可以將廉價的底物轉(zhuǎn)變成高附加值的產(chǎn)物.檸檬烯(limonene)又名苧烯，屬單萜類化合物，是年產(chǎn)量大、價格低廉的農(nóng)業(yè)和工業(yè)副產(chǎn)品，將其作為轉(zhuǎn)化前體用于生物轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有較高的經(jīng)濟價值[10].研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)真菌ColletotrichumnymphaeaeCBMAI 0864轉(zhuǎn)化檸檬烯的產(chǎn)物對病原真菌Cryptococcusneoformans具有較強的抑制作用[11-13].對生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，紫蘇醇、香芹酮、卡維醇、二氫香芹酮和α-松油醇等生物活性豐富的產(chǎn)物[14-15]具有深入研究的價值.

本文從22 株勝紅薊內(nèi)生真菌中篩選具有轉(zhuǎn)化檸檬烯能力的菌株，并考察其生物轉(zhuǎn)化檸檬烯發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、柑橘炭疽病菌(Gloeosporiumfrucrigenum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)和油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)的抑菌活性.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 從外來入侵植物勝紅薊中分離出22 株內(nèi)生真菌[9]，包括從根中分離的5 株內(nèi)生真菌Fusariumsolani(wp02)，Schizophyllumcommune(wp05)，Lasiodiplodiatheobromae(wp04)，Rhizomucorvariabilis(wp03)，Alternariaalternata(wp06)；從花中分離的7 株內(nèi)生真菌Phyllostictacapitalensis(wf06)，F(xiàn)usariumstriatum(wf03)，F(xiàn)usariumoxysporum(wf04)，Curvulariachiangmaiensis(wf01)，Diaporthephaseolorum(wf07)，Diaporthelongicolla(wf02)，F(xiàn)usariumstriatum(wf05)，從莖中分離的5 株內(nèi)生真菌Letendraeasp.(wz06)，F(xiàn)usariumlateritium(wz01)，Paraconiothyriumcyclothyrioides(wz05)，Bartaliniapondoensis(wz03)，Paraconiothyriumcyclothyrioides(wz02)，從葉中分離的5 株內(nèi)生真菌Colletotrichumcobbittiense(wl05)，Botryosphaeriadothidea(wl03)，Diaporthephaseolorum(wl01)，Cercosporakikuchii(wl02)，Phyllostictacapitalensis(wl04).

指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)和柑橘炭疽病菌(Gloeosporiumfrucrigenum)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)龍超安教授提供；油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)由華僑大學(xué)楊道茂博士提供；香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)由華僑大學(xué)王明元副教授提供.

1.1.2 試劑 馬鈴薯葡萄糖(PDB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、青霉素鉀、硫酸鏈霉素、胰蛋白胨、葡萄糖水(深圳市晨泓科技有限公司)；(+)- 檸檬烯、檸檬烯-1，2-二醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97%，美國Sigma有限公司)；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖液體雙抗培養(yǎng)基配方為PDB 40.1 g，蒸餾水1 000 mL，青霉素鉀150 mg，硫酸鏈霉素120 mg.青霉素鉀和硫酸鏈霉素用于抑制芽孢桿菌等細菌的生長，對內(nèi)生真菌的生物活性沒有抑制作用，二者均不能高壓保溫滅菌，需待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃過濾滅菌再加入.

試驗所用物品的滅菌條件均為0.1 TPa，120 ℃滅菌20 min.

1.2 儀器與設(shè)備

GF254硅膠板(50 mm×100 mm，山東省青島海洋化工有限公司)；超凈工作臺(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；GC-MS-QP2010 Ultra型氣質(zhì)聯(lián)用儀(日本Shimadzu公司)；pH計(深圳衡欣科技股份有限公司)；滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；布氏漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物制備 將22 株內(nèi)生真菌分別接種至馬鈴薯葡萄糖液體雙抗培養(yǎng)基中，置28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h活化；取直徑為5 mm的菌塊接入裝有100 mL液體培養(yǎng)液的錐形瓶中，在28 ℃，200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)72 h后，加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的檸檬烯和無水乙醇的混合溶液；繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)96 h后，將各菌株的發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機溶劑蒸干并用甲醇復(fù)溶.經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，將濃縮液置于10 mL的試管中，封閉保存于黑暗條件下，備用.對樣品進行薄層色譜(TLC)分析，以檸檬烯-1，2-二醇標(biāo)準(zhǔn)品為對照，驗證內(nèi)生菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯是否生成檸檬烯-1，2-二醇.

TLC檢測條件：在硅膠板上，用毛細管(0.5 mm×10 mm)分別吸取上述制備的樣品及底物對照組發(fā)酵液進行點樣，并將其置于體積比為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶4的展開劑中展開；顯色劑為香草醛-硫酸-乙醇溶液(15 g香草醛溶于250 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的濃硫酸-乙醇溶液中).

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物質(zhì)量濃度的測定：根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物是檸檬烯-1，2-二醇，參考杜鋼等[16]的檢測方法，稱取檸檬烯-1，2-二醇標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇配制成不同質(zhì)量濃度(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0 mg·mL-1)的溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和氣相色譜質(zhì)譜測得的相應(yīng)質(zhì)量濃度的峰面積，使用Origin 9.0進行回歸方程的擬合，最終得到回歸方程Y=607 443.39x-228 129.17(R2=0.996 7).將獲得的主產(chǎn)物的峰面積代入回歸方程中，可得內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度.

1.3.2 產(chǎn)物成分分析 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)參考楊道茂等[17]的檢測方法，設(shè)置檢測條件如下：色譜柱為Rxi-5sil MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱箱溫度為70 ℃，進樣口溫度為250 ℃，柱流量1 mL·min-1，分流比1∶2，進樣量1 μL，升溫程序為柱溫60 ℃×3 min→升溫速度10 ℃·min-1→柱溫150 ℃×5 min→升溫速度20 ℃· min-1→柱溫250 ℃×3 min.質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為40～200.將上述制備的樣品及對照組發(fā)酵萃取液用移液槍取1.5 mL置于色譜瓶中，用于產(chǎn)物成分分析.

1.3.3 菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯乙酸乙酯粗提物抑菌活性測定 利用菌絲生長速率法，測定樣品對植物病原菌的抑制作用[18].取體積分?jǐn)?shù)為0.5%(100 μL)的樣品加入體積為20 mL的PDA瓊脂平板中，待凝固后，取直徑為5 mm的病原菌菌塊接種至平板中央，將添加等量乙酸乙酯、空白平板作為對照組.將接種后的平板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組長滿平板時，計算抑菌率，其計算公式為

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果均以 3 次重復(fù)試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.采用Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)意義分析并繪圖.

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 檸檬烯生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選

圖1 勝紅薊內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化檸檬烯薄層色譜圖Fig.1 TLC of limonene biotransformation by endophytic fungi from Ageratum conyzoides

將22個內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化檸檬烯發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物在硅膠板上形成的點與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇形成的點進行比對.勝紅薊內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化檸檬烯薄層色譜圖，如圖1所示.圖1中：編號1～23分別為wp02，wp05，wp04，wp03，wp06，wf06，wf03，wf04，檸檬烯-1，2-二醇，wf01，wf07，wf02，wf05，wz06，wz01，wz05，wz03，wz02，wl05，wl03，wl01，wl02，wl04.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入底物檸檬烯培養(yǎng)4 d后，菌株wp02，wp03，wf03，wf01，wf05，wz01，wl05，wl02，wf07，wp06，wl01，wz03，wf06，wf04具有轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力，其中，菌株wp03，wp06，wf07，wf05，wz03和wl01(紅色圓圈表示的菌株)與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇形成的點的比移植(Rf)相同，因此，推測上述6個菌株具有生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯生成檸檬烯-1，2-二醇的能力.將菌株wp02，wf06，wf03，wf04，wz01，wl05與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇對照組形成的斑點進行比對，發(fā)現(xiàn)它們的斑點較淺，證明這幾個菌株生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯的能力較弱，因此，在后續(xù)的試驗中并未將其作為研究對象.

2.2 菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯產(chǎn)物分析

不同菌株的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖，如圖2所示.圖2中：t為保留時間；δ為絕對豐度.

(a) 菌株wf05 (b) 菌株wf07

(c) 菌株wl01 (d) 菌株wp03

(e) 菌株wp06 (f) 菌株wz03

(g) 標(biāo)準(zhǔn)品底物檸檬烯 (h) 標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯圖2 不同菌株的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagrams of gas chromatography-mass spectrometry of different strains

圖3 不同菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度Fig.3 Mass concentration of transformation products of different strains

將菌株wp03，wp06，wf07，wf05，wz03，wl01的生物轉(zhuǎn)化的乙酸乙酯粗提物與底物檸檬烯和產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖進行對比分析發(fā)現(xiàn)，菌株具有轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力，該結(jié)果與薄層色譜的結(jié)果(圖1)一致，并且生成了檸檬烯-1，2-二醇.其中，菌株wf07，wp06，wl01，wz03形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(檸檬烯-1，2-二醇)峰信號不僅比菌株wp03和wf05強，而且對應(yīng)的底物(檸檬烯)的峰信號也低，證明它們轉(zhuǎn)化檸檬烯生成新物質(zhì)的能力較強.

不同菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，如圖3所示.圖3中：ρ為檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度；相同字母表示數(shù)據(jù)之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，不同字母(a，b，c)之間表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05.由圖3可知：菌株wl01，wp06，wz03轉(zhuǎn)化檸檬烯生成檸檬烯-1，2-二醇質(zhì)量濃度的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，其生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯生成檸檬烯-1，2-二醇的能力強于菌株wf05，wf07，wp03，且菌株wl01轉(zhuǎn)化檸檬烯生成的檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度最高，為3.43 mg·mL-1；菌株wf05和wf07轉(zhuǎn)化檸檬烯生成檸檬烯-1，2-二醇質(zhì)量濃度的差異也不具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2.3 菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯的乙酸乙酯粗提物的抑菌活性

勝紅薊內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化檸檬烯乙酸乙酯粗提物對柑橘炭疽病菌、意大利青霉和指狀青霉等致病菌具有一定的抑菌活性.不同菌株轉(zhuǎn)化發(fā)酵液對5 種植物病原真菌的抑菌活性，如表1所示.表1中：“-”表示無抑菌活性.由表1可知：菌株wp06轉(zhuǎn)化檸檬烯的乙酸乙酯粗提物對意大利青霉的抑菌率最高，其值為(40.03±3.58)%(P<0.05)；菌株wz03轉(zhuǎn)化檸檬烯的乙酸乙酯粗提物對柑橘炭疽病菌的抑制率達到(28.69±1.03)%(P<0.05)；菌株wf05對指狀青霉的抑菌率為(27.17±1.75)%；而菌株wz03對香蕉枯萎病菌抑菌率僅有(2.36±0.68)%；內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化檸檬烯的乙酸乙酯粗提物對油茶炭疽病菌無抑菌活性.

表1 不同菌株轉(zhuǎn)化發(fā)酵液對5 種植物病原真菌的抑菌活性Tab.1 Antifungal activity of fermentation broth transformed by different strains against five plant pathogenic fungi

3 結(jié)論

從22 個勝紅薊內(nèi)生真菌中共篩選得到14 個具有轉(zhuǎn)化檸檬烯能力的菌株，其中，菌株Fusariumstriatum(wf05)，Diaporthephaseolorum(wf07)，Diaporthephaseolorum(wl01)，Rhizomucorvariabilis(wp03)，Alternariaalternata(wp06)，Bartaliniapondoensis(wz03)轉(zhuǎn)化檸檬烯產(chǎn)物是檸檬烯-1，2-二醇.菌株wf05，wf07和wl01同屬的真菌也能轉(zhuǎn)化生成檸檬烯-1，2-二醇[19-21]，菌株ColletotrichumnymphaeaeCBMAI 0864[11，22]，Phomopsissp.[23]，Aspergilluscellulosae[24]通過生物轉(zhuǎn)化檸檬烯也可以生成檸檬烯1，2-二醇.間座殼屬的wl01和wf07、鏈格孢屬的wp06、頂多毛孢屬的wz03菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力較強.GC-MS檢測結(jié)果表明，菌株wf05，wf07，wl01，wp03，wp06，wz03轉(zhuǎn)化檸檬烯的主要產(chǎn)物是檸檬烯-1，2-二醇，其中，菌株wl01轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力最強，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度為3.43 mg·mL-1，高于其同屬(間座殼屬)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇的質(zhì)量濃度(3.02 mg·mL-1)[14].Sales等[11]對生物轉(zhuǎn)化檸檬烯工藝進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檸檬烯-1，2-二醇的最高質(zhì)量濃度為4.19 g·L-1.因此，可以對菌株wl01轉(zhuǎn)化檸檬烯的工藝進行優(yōu)化，從而提高其轉(zhuǎn)化生成檸檬烯-1，2-二醇的能力.

研究結(jié)果表明：萜類化合物具有抗菌和消炎等生物活性[25-26]，而檸檬烯-1，2-二醇作為其衍生物，對新生隱球菌(Crytococcusneoformans)具有較好的抑制作用[21，27].此外，抑菌活性測定結(jié)果表明，菌株wp06轉(zhuǎn)化檸檬烯的發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對意大利青霉的抑菌作用顯著((40.03±3.58)%)，菌株wz03對柑橘炭疽病菌的抑菌率較好((28.69±1.03)%)，菌株wf05對指狀青霉具有一定抑菌效果((27.17±1.75)%)；僅有菌株wz03對香蕉枯萎病菌有微弱的抑菌作用((2.36±0.68)%)；菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物對油茶炭疽病菌沒有抑菌作用.

綜上所述，從勝紅薊中分離出的內(nèi)生真菌具有轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對意大利青霉類柑橘致病菌具有較好的抑菌活性.然而，具體發(fā)揮抑菌作用的是粗提物還是單體物質(zhì)有待進一步深入研究.