馬 莉，陳健鑫，康定旭，李鴻博，劉 亭，伍建榕，馬煥成*

(1.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224)

木棉(Bombaxceiba)是木棉科(Bombacaceae)一種落葉深根大喬木，主要生長在熱帶及亞熱帶地區(qū)。木棉不耐寒、不耐水濕、喜光耐熱，在微酸性或中性土壤中生長良好，是熱帶的特征科樹種，多見于干熱條件明顯的干熱河谷地區(qū)。木棉花期在冬季，花大且美觀，樹體高大且枝葉繁茂，適宜種植于光照條件好的地區(qū)，是行道樹的首要選擇。木棉花、葉等部位有較高的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值，是干熱河谷地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一[1]。

在干熱河谷地區(qū)，降雨量少且氣候炎熱，光熱條件充足，氣溫年差小，土壤淺薄，植被生長困難，生態(tài)環(huán)境極其脆弱。而木棉則對干熱河谷的干旱環(huán)境有較高適應(yīng)性，對防止水土流失和恢復(fù)生態(tài)環(huán)境都具有重要作用。

根際微生物是土壤-植物根系中重要的組成部分，參與有機(jī)物質(zhì)與無機(jī)物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化，促進(jìn)植物對土壤養(yǎng)分的吸收與利用，調(diào)控植物的生長發(fā)育與免疫進(jìn)程[2]。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)隸屬于球囊菌門(Glomeromycota)，是一類專性活體營養(yǎng)共生菌，AMF能與80%的陸生維管植物形成共生關(guān)系[3]，可以影響植物的生物量變化、提高植物的水分代謝量、植物對重金屬、鹽漬等污染物的抗逆能力以及改善土壤結(jié)構(gòu)性質(zhì)，還可以保持植物群落體系的穩(wěn)定性、多樣性，在恢復(fù)土地，改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)和穩(wěn)定方面都發(fā)揮著不可替代的作用[4]。馬坤等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AMF改善了木棉根區(qū)土壤和植株體內(nèi)的養(yǎng)分狀況。研究接種AM真菌與干旱脅迫下的植物還有發(fā)現(xiàn)，AMF可提高生物量緩解不同器官水分含量的降低[6-7]。在不同區(qū)域，木棉在AMF的影響下均長勢良好，木棉對不同生境的廣域適應(yīng)性是否與其共生的AMF差異性有關(guān)是本研究關(guān)注的焦點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

干熱河谷地區(qū)氣候炎熱，光熱條件充足，氣溫年較差小，但因?yàn)榻邓?、土層淺薄，導(dǎo)致植被生長困難，生態(tài)環(huán)境較為惡劣，屬于生態(tài)脆弱地區(qū)。我國干熱河谷主要位于西南地區(qū)(23°00′-28°10′ N，98°50′-103°50′ E)，集中分布于橫斷山脈的金沙江、瀾滄江、元江、怒江流域以及珠江流域[8]。

金沙江流域以元謀縣為例，位于云南省境內(nèi)楚雄州西北部，以山地為主，東南高，西北低，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，半干旱區(qū)域；元江流域以元陽縣為例，位于云南省境內(nèi)紅河州的南部，以山地為主，氣候?yàn)閬啛釒降丶撅L(fēng)，屬于半濕潤區(qū)；瀾滄江流域以西雙版納地區(qū)為例，位于云南省境內(nèi)北回歸線以南的熱帶濕潤季風(fēng)區(qū)，屬于濕潤區(qū)；珠江流域以廣西崇左為例，位于廣西西南部，主要是山地丘陵，氣候?yàn)閬啛釒Ъ撅L(fēng)，屬于濕潤區(qū)；怒江流域以保山潞江壩為例，位于云南省境內(nèi)的滇西部，以山地為主，氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)，為半干旱區(qū)。

1.2 樣品采集

2019年12月-2020年2月，在云南和廣西崇左5個典型干熱河谷流域中人為干擾較少的地段采集木棉根際土樣和根樣(表1)。

每個流域采用五點(diǎn)法取樣，在每個采樣點(diǎn)以木棉樹根部為中心的東、南、西和北4個方位去除表面的枯葉及表層腐土后，均勻采集木棉根際5～30 cm土層土壤共1 kg，同時在4個方位剪取木棉的須根。土壤樣品放入低溫泡沫盒，根系樣品放入FAA固定液中保存，樣品保存于西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 AMF孢子的分離

采用略改動的濕篩沉淀法分離土壤中的AMF孢子[9]。方法：稱取20 g土樣，浸泡于500 mL蒸餾水中，適度攪拌后靜置過夜。用緩慢流水沖洗土樣，使其通過40、100、140、200目和300目的細(xì)篩，后用蒸餾水收集篩面顆粒，置于體視鏡挑取各篩目下的孢子并統(tǒng)計數(shù)量。

1.4 AMF孢子的鑒定

分離出來的AMF孢子用Melzre’s試劑作為浮載劑，在光學(xué)顯微鏡(品牌Leica，型號DM750)下觀察拍照，根據(jù)孢子的顏色、形態(tài)大小、孢壁厚度等數(shù)據(jù)，參考Schenck等[10]和相關(guān)學(xué)者的文獻(xiàn)[11-12]，對篩選出來種、屬的孢子進(jìn)行檢索、鑒定。

AMF分子鑒定的方法：在無菌工作臺上挑取單個AMF孢子，用無菌水充分漂洗3次后轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 mL離心管，用OMEGA微量DNA抽提試劑盒提取單孢子總DNA，在-20 ℃保存?zhèn)溆?。以單孢子總DNA為模板進(jìn)行巢氏PCR(Nested-PCR)擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用50 μL體系，第1輪PCR的產(chǎn)物稀釋30倍作為第2輪PCR模板[10]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增正確的條帶委托昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，測通的序列進(jìn)行拼接，并通過鄰接法(neighbor-joining method，NJ)，以1 000作為Bootstrap校驗(yàn)值，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定AMF的分類地位(表2)。

1.5 AMF多樣性分析

用濕篩法分離得到的AMF孢子進(jìn)行個數(shù)、種類及分離頻率等數(shù)據(jù)記錄，通過計算真菌孢子密度、Margalef物種豐富度指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)分析AMF多樣性指標(biāo)[13]。

孢子密度(spore number，SN)

SN=某土樣中AM真菌孢子數(shù)/土樣數(shù)

(1)

物種豐富度指數(shù)(Margale，R)

R=(S-1)/lnN

(2)

Shannon-Wiener指數(shù)

pi=某AMF真菌孢子占該流域所有孢子的比例

(3)

式中:S為物種的數(shù)量，pi為種的個體占全部個體的比例。

1.6 菌根侵染率分析

根據(jù)Grace等[14]的方法做略微改動：取出FAA固定的木棉須根，用蒸餾水清洗干凈，加入15%的KOH于90 ℃水浴解離2 h至根系透明，冷卻后用水清洗4～5次，加入2%的乳酸軟化，后用5%的苯胺藍(lán)溶液90 ℃水浴染色40 min，用乳酸甘油脫色后制成臨時玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄菌絲、泡囊和叢枝等結(jié)構(gòu)，并計算菌根侵染率[13]。

菌根侵染率=菌根侵染的交叉點(diǎn)數(shù)和/總交叉點(diǎn)數(shù)×100%

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 木棉根際AMF的分離

從5種典型干熱河谷流域的木棉根系中分離的孢子總共7科7屬17種，其中，球囊霉屬5種：凹坑球囊霉(Glomusmultiforum)(圖1A)、層狀球囊霉(G.lamellosum)、地球囊霉(G.geosporum)、大果球囊霉(G.macrocarpum)、單孢球囊霉(G.monosporum)；根生囊霉屬2種，透光根生囊霉(Rhizophagusdiaphanws)(圖1B)和聚叢根孢囊霉(R.aggregatnm)，盾巨孢囊霉屬2種：黑盾果孢囊霉(Suctellosporanigra)和美麗盾巨孢囊霉(S.calospora)(圖1C)；和平球囊霉屬1種玻利維亞和平球囊霉(Pacisporaboliviana)(圖1D)；無梗囊霉屬4種：大型無梗囊霉(Acaulosporacolossica)(圖1E)、孔窩無梗孢囊(A.foveata)，蜜色無梗囊霉(A.mellea)，皺壁無梗囊霉(A.rugosa)；多樣孢囊霉屬2種：幼套多孢囊霉(Diversisporaetunicaum)和沙生多樣孢囊霉(D.arenorio)(圖1F)；巨孢囊霉屬1種：易誤巨孢囊霉(Gigasporadecipiens)。

通過濕篩分離土壤孢子并進(jìn)行形態(tài)鑒定，發(fā)現(xiàn)球囊霉屬和無梗囊霉屬的種類較多，分別有5種和4種。統(tǒng)計各個流域AMF孢子種類，根生囊霉屬、玻利維亞和平球囊霉和易誤巨孢囊霉只在珠江流域出現(xiàn)。金沙江、怒江、瀾滄江、紅河在地形上屬于橫斷山脈地區(qū)，具有相似的AMF物種組成，而珠江流域?qū)儆谠瀑F高原，具有特殊的AMF組成，其中根生囊霉屬、玻利維亞和平球囊霉和易誤巨孢囊霉在其他流域沒有出現(xiàn)(表2)。

2.2 AMF單孢子的分子鑒定

以單孢子總DNA為模板進(jìn)行Nested-PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出500～750 bp的目標(biāo)產(chǎn)物(圖2)，拼接后的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示目標(biāo)產(chǎn)物與球囊霉目的真菌具有較高的相似度。

將目標(biāo)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示AMF孢子系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為兩大進(jìn)化支，其中BS001與MT108833P.scintillans聚為一支，支持率87%，相似性98.0%；GX002與FJ009672S.calospora聚為一支，支持率97%，相似性99.90%；YM001與FJ009670A.mellea聚為一支，序列支持率95%，相似性97.50%；YY001與AB326023Glomussp.聚為一支，支持率為99%，相似性為100%；BN002與HF970325Rhizophagussp.聚為一支，支持率100%，相似性99.80%；GX001與MT765703D.sporocarpia聚為一支，支持率95%，相似性為98.80%；BN001與AJ504639.1G.rosea聚為一支，支持率100%，相似性98.90%。

注：A.凹坑球囊霉(G.multiforum) B.透光根生囊霉(R.diaphanws)C.美麗盾巨孢囊霉(S.calospora) D.玻利維亞和平囊霉(P.boliviana) E.大型無梗囊霉(A.colossica) F.沙生多樣孢囊霉(D.arenorio)

表2 不同流域AMF種類統(tǒng)計

圖2 部分AMF孢子電泳圖譜

圖3 基于AM真菌18SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 木棉的根系侵染率的測定

叢枝和泡囊是AMF真菌定殖植物根系的重要結(jié)構(gòu)，苯胺藍(lán)染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，木棉根系中發(fā)現(xiàn)菌絲、叢枝及泡囊等結(jié)構(gòu)(圖4)，說明木棉與叢枝菌根真菌互利共生。金沙江、元江、瀾滄江、怒江、珠江流域木棉根系A(chǔ)MF侵染率分別是67.50%、66.20%、43.30%、42.83%和31.00%(表3)。

AMF侵染率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性分析結(jié)果表明，干熱地區(qū)的元江流域和金沙江流域侵染率較高，半干旱區(qū)的瀾滄和怒江流域的侵染率居中，而濕潤區(qū)的珠江流域AMF侵染率較低，不同流域的AMF菌根侵染率存在差異。

2.4 不同流域木棉根際土樣AM真菌多樣性分析

干熱條件突出的金沙江流域孢子密度35.07個·g-1，豐富度23.00種，Shannon指數(shù)2.80；相似條件下的元江流域孢子密度34.98個·g-1，豐富度22.92種，Shannon指數(shù)2.69；半濕熱的瀾滄江流域孢子密度27.68個·g-1，豐富度16.17種，Shannon指數(shù)2.60；相似條件下的怒江流域孢子密度29.50個·g-1，豐富度17.00種，Shannon指數(shù)2.40；濕潤條件下的珠江流域孢子密度18.52個·g-1，豐富度12.00種，Shannon指數(shù)2.18(表3)。

結(jié)果表明，干熱條件突出的金沙江流域和元江流域AMF孢子密度高于半濕潤及濕潤流域區(qū)；AMF孢子豐富度在干熱條件突出的金沙江流域指數(shù)較高；Shannon-Wiener指數(shù)結(jié)果顯示，金沙江流域和元江流域指數(shù)較高，且不同流域間存在顯著性差異。

圖4 木棉根系皮層細(xì)胞中共生的AMF泡囊、菌絲及叢枝結(jié)構(gòu)

表3 不同流域菌根真菌侵染率、土樣孢子密度、種的豐度和Shannon指數(shù)

2.5 不同流域影響因子與AMF多樣性的主成分分析

AMF多樣性各項(xiàng)影響因子指標(biāo)的公因子方差較大，其中經(jīng)度的公因子方差最小為0.783。按照特征值>1的原則，提取了2個主成分(3.615和1.695)。這2個主成分的貢獻(xiàn)率為57.669%和30.829%，累計貢獻(xiàn)率88.498%(>85%)，說明這2個主成分是AMF多樣性變化的影響因素(表4)。

表4 AMF多樣性影響因子載荷矩陣及主成分貢獻(xiàn)率

由主成分的初始因子載荷矩陣可見，緯度、海拔、年均降水量、年均蒸發(fā)量與第1主成分呈正相關(guān)，經(jīng)度、年均溫度與第2主成分呈正相關(guān)，即緯度、海拔、年均降水量、年均蒸發(fā)量可作為AMF多樣性的主要指標(biāo)。說明干熱河谷與經(jīng)緯度有關(guān)的地帶性氣候和與海拔有關(guān)的局部地形對該地區(qū)的AMF多樣性有直接的影響。

3 結(jié)論與討論

從不同流域干熱河谷地區(qū)木棉根際土壤里分離出7科7屬17種叢枝菌根真菌，其中球囊霉屬及無梗囊霉屬為干熱河谷地區(qū)AMF的優(yōu)勢群落。研究證實(shí)了在干熱河谷地區(qū)木棉根系能與AMF建立共生關(guān)系。且在不同水熱條件下，AMF孢子密度、菌根侵染率及孢子多樣性也有差異，整體看，各流域木棉根系中AMF孢子密度、菌根侵染率及孢子多樣性在干熱地區(qū)>半濕潤地區(qū)>濕潤地區(qū)。景躍波[15]研究發(fā)現(xiàn)云南熱區(qū)西南樺根際AMF優(yōu)勢類群為球囊霉屬，伍建榕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在云南干熱河谷地區(qū)摩西球囊霉與幼套球囊霉孢子數(shù)量較多，頻率更高，前人研究證實(shí)了球囊霉屬真菌具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和繁殖特性[17]，本研究對干熱河谷木棉根系A(chǔ)MF優(yōu)勢種的研究也與前人的結(jié)果相符。琚淑明等[18]研究表明，喜樹在干旱脅迫下接種AMF降低膜透性，提高水分利用率，進(jìn)而提高抗旱能力。胡亞軍[19]研究表明，在北方干旱與半干旱草原中AMF菌絲密度與年均溫顯著正相關(guān)，且在貧瘠的土壤中AMF的生物量增加。大量研究表明，干旱條件下，AMF通過提高多樣性來適應(yīng)環(huán)境從而促進(jìn)植物的生長。

金沙江、怒江、瀾滄江、紅河在地形上屬于橫斷山脈地區(qū)，具有相似的AMF物種組成，而珠江流域?qū)儆谠瀑F高原，具有特殊的AMF組成，其中根生囊霉屬、玻利維亞和平球囊霉和易誤巨孢囊霉在其他流域沒有出現(xiàn)。這種現(xiàn)象說明與地形有關(guān)的氣候因素對AMF組成產(chǎn)生直接影響。本研究從不同環(huán)境因子主成分分析得出，緯度、海拔、年均降水量、年均蒸發(fā)量均可以影響AMF的種類及多樣性。且由主成分的初始因子載荷矩陣可以看出，緯度、海拔、年均降水量、年均蒸發(fā)量與第1主成分呈正相關(guān)，經(jīng)度、年均溫度與第2主成分呈正相關(guān)，即緯度、海拔、年均降水量、年均蒸發(fā)量可作為AMF多樣性的主要指標(biāo)。說明干熱河谷與經(jīng)緯度有關(guān)的地帶性氣候和與海拔有關(guān)的局部地形對該地區(qū)的AMF多樣性有直接的影響。在橫斷山脈地區(qū)的流域范圍內(nèi)，氣候相對干旱，干熱河谷地區(qū)海拔較低，年降水量較小，則AMF孢子密度較大。而云貴高原的珠江流域海拔較高，降水豐富，AMF的多樣性出現(xiàn)下降現(xiàn)象。前人的研究發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高，AMF 群落多樣性呈現(xiàn)下降的趨勢[20]，AMF的物種多樣性的多個指標(biāo)都與年均降水量與蒸發(fā)量呈正相關(guān)[21]。

目前，AMF真菌的鑒定大多基于形態(tài)描述與核糖體rDNA片段的分子鑒定，但在近緣種屬的區(qū)分中是充分的。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基因的擴(kuò)增及高通量測序技術(shù)在近緣種屬的區(qū)分中顯示出了更大的優(yōu)勢[22-24]。AMF與植物根系形成共生系統(tǒng)，增強(qiáng)植物的抗旱性與抗逆性等促進(jìn)植物的生長發(fā)育，這對生長在干熱河谷地區(qū)的植物尤為重要[25-26]。木棉生長過程與AMF相互聯(lián)結(jié)影響關(guān)系密切。韋素貞等[27]研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF可改善寧夏枸杞營養(yǎng)狀況及光能效率，提高抗逆性，有利于在干旱環(huán)境中生長。在干熱條件突出的金沙江流域和元江流域，AMF多樣性和菌根侵染率較高，隨著AMF多樣性和侵染率的增加，有助于木棉對土壤中P元素的吸收，又促進(jìn)側(cè)根生長，即增加根系的表面積，改善木棉根系對土壤養(yǎng)分的吸收與利用[28]。木棉之所以能在干熱河谷區(qū)穩(wěn)定生存并建立較穩(wěn)定的種群，與叢枝菌根抗旱性與抗逆性有密切的關(guān)系。干熱條件下木棉受到的干旱脅迫越強(qiáng)，植物生存所需水分更多，因此土壤叢枝菌根侵染率及AMF多樣性提高能增強(qiáng)木棉的抗逆性，保證木棉在干熱條件下維持生長。趙高卷等[29]研究發(fā)現(xiàn)木棉在不同的環(huán)境中均可以生長，在困難的環(huán)境中產(chǎn)生抗旱能力。張菲等[30]發(fā)現(xiàn)，枳在干旱條件下，AM真菌參與植物生長，改變植物體內(nèi)激素平衡，增強(qiáng)植物抗旱性。大量研究已證實(shí)，AMF對促進(jìn)植物生長，改善植物品質(zhì)，增強(qiáng)植物對水分、養(yǎng)分的吸收和提高植物的抗逆性等有顯著作用[13]。研究也將為后續(xù)在干熱河谷中木棉的生長與AMF多樣性研究提供理論依據(jù)。