陳盛仕，劉梓宜，李夢琪，米順利，陳顯強，張 玲,3**

(1.廣西中醫(yī)藥大學科學試驗中心，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院，廣西南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學，廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點試驗室，廣西南寧 530200)

藻藍蛋白(Phycocyanin)是一種存在于藍藻中，含開鏈四吡咯構(gòu)造的天然藍色色素，具有吸收和傳遞功能的性質(zhì)，屬胞內(nèi)蛋白，在螺旋藻中含量較高[1]。由于藻藍蛋白具有極高的營養(yǎng)價值以及抗炎、抗疲勞、抗腫瘤、提高人體免疫力等藥理作用，因而被普遍應(yīng)用于食品、化妝品、保健品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-6]。

目前，藻藍蛋白的提取純化工藝較成熟，但仍僅適用于實驗室操作，工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)仍是其重難點，且價格昂貴。藻藍蛋白提取純化主要分為破壁、粗提和純化3步，其中細胞破碎的方法有溶脹法[7]、超聲波細胞破壁法、凍融法[8]、機械破壁法、化學試劑法[9]、溶酶法[10]等，實驗中常用其中一種或兩種方法聯(lián)用對藻藍蛋白進行破壁[11,12]。藻藍蛋白提取一般采用鹽析法、等電點沉淀法、超濾法[13-17]和吸附法[18-21]，其中吸附法是利用吸附劑吸附雜質(zhì)或蛋白從而提取蛋白，常用的吸附劑有活性炭和殼聚糖。此方法相比鹽析法，所用的試劑價格便宜、不造成環(huán)境污染，少量的吸附劑即可吸附雜質(zhì)，無須大量的硫酸銨;缺點是需要精確控制吸附劑的用量和吸附時間，否則容易將目標蛋白吸附走，降低提取率?？傮w來說此方法有很大的開發(fā)潛力，有望取代鹽析法提取藻藍蛋白，但目前國內(nèi)外對此方法的研究仍較少。

高純度藻藍蛋白的提取成本高，價格昂貴，由于溶脹法、凍融法都具有成本低、操作簡單、條件溫和以及不引入其他化學試劑等優(yōu)點，因此本研究主要對溶脹法中的料液比、溶脹時間、溶脹次數(shù)，凍融法中的不同溶劑、料液比、凍融次數(shù)進行考察，應(yīng)用響應(yīng)面模型設(shè)計試驗，對螺旋藻的兩種破壁方法進行優(yōu)化得到最優(yōu)破壁條件。同時為了克服活性炭容易吸附目的蛋白降低回收率的缺點，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化，考察活性炭目數(shù)、活性炭加入量和吸附時間3個因素對藻藍蛋白純度及回收率的影響，以期獲得最優(yōu)活性炭吸附條件，最后采用一步疏水層析法純化得到食品級和醫(yī)藥級藻藍蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)，由北海生巴達生物科技有限公司提供。粉末活性炭(100目、200目、300目、400目、500目)，購自北京美嘉源環(huán)保工程有限公司；Butyl Fourose 4FF疏水層析填料，購自北京慧德易科技有限責任公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸銨等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

LQ-C3001電子天平，購自深圳市飛亞衡器有限公司；GL224-1SCN電子天平，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；HYCD-205醫(yī)用冷藏冰凍箱，購自青島海爾特種電器有限公司；PHS-25 pH計，購自上海儀電科學儀器股份有限公司； UV-2600紫外-可見光分光光度計，購自島津儀器(蘇州)有限公司；BA2100igital數(shù)碼顯微鏡，購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；BT600-2J精密蠕動泵，購自保定蘭格恒流泵有限公司；SBS-100樣品自動收集器，購自上海瀘西分析儀器廠有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分析方法

藻藍蛋白在620 nm處有最大吸收峰，蛋白在280 nm處有最大吸收峰，別藻藍蛋白在650 nm下有最大吸收峰。根據(jù)該性質(zhì)可使用紫外可見光分光光度計測定蛋白液280 nm、620 nm和650 nm處的吸光度(A)，從而計算出藻藍蛋白的純度、濃度、得率及回收率。

①藻藍蛋白純度。

藻藍蛋白的純度(Purity)用P表示，不同純度的藻藍蛋白有不同的用途，P≥0.7時為食品級，P≥3.0時為醫(yī)藥級，P≥4.0時為分析級，根據(jù)Yan等[22]提出的公式進行計算，具體如下：

P=A620/A280。

(1)

②藻藍蛋白濃度。

藻藍蛋白的濃度用C表示，根據(jù)Bennett等[23]提出的公式進行計算，具體如下：

C(mg/mL)=(A620-0.474×A650)/5.34。

(2)

③藻藍蛋白得率。

藻藍蛋白的得率用Y表示，計算公式如下：

Y(%)=(C×V0)/(m0×1000)×100%，

(3)

式中，C是藻藍蛋白濃度(mg/mL)，V0是粗提液體積(mL)，m0是螺旋藻干粉質(zhì)量(g)。

1.2.2 溶脹法

溶脹法是以純水或低鹽溶液為溶劑，螺旋藻吸水漲破細胞，從而流出有效成分的方法。具體操作如下：精密稱取螺旋藻干粉，分別考察料液比(1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶50 g/mL、1∶100 g/mL、1∶200 g/mL)、溶脹時間(6 h、12 h、18 h、24 h、36 h)、溶脹次數(shù)(1次、2次、3次)對藻藍蛋白純度及得率的影響。將以上各個試驗的藻液超聲5 min，4℃靜置12 h，4 000 r/min離心15 min，得上清液，分別測定280 nm、620 nm、650 nm處的吸光度。

采用Design-Expert軟件的Box Behnken設(shè)計優(yōu)化溶脹法破壁參數(shù)，以料液比、溶脹時間、溶脹次數(shù)為自變量，藻藍蛋白得率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面分析法(RSM)試驗。分別給各試驗因素設(shè)置3個水平(表1)，以藻藍蛋白的純度和回收率作為響應(yīng)變量，共17個析因點，其中有5個重復的中心點。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素和水平Table 1 Test factors and levels used for response surface analysis

1.2.3 凍融法

凍融法是將螺旋藻液置于低溫(-20℃)下，使海藻細胞中的水分被迅速冷凍形成冰晶，在室溫下迅速解凍，從而破碎細胞的方法。單因素試驗操作如下：①精密稱取4份1 g螺旋藻干粉，分別加入20 mL純水、0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.05 mol/L PBS緩沖液和0.1 mol/L PBS緩沖液，超聲5 min，-20℃靜置12 h；②精密稱取3份1 g螺旋藻干粉，溶劑為①試驗所得的最優(yōu)溶液，超聲5 min，-20℃分別靜置4 h、8 h、12 h；③精密稱取5份1 g螺旋藻干粉，分別加入最適溶劑，溶劑為①試驗所得的最優(yōu)溶液，使料液比分別為1∶10 (g/mL)、1∶20 (g/mL)、1∶50 (g/mL)、1∶100 (g/mL)、1∶200 (g/mL)，超聲5 min，冷凍時間為②所得的最優(yōu)條件；④精密稱取3份1 g螺旋藻干粉，加入最佳料液比溶劑，凍融次數(shù)分別為1次、2次和3次，超聲5 min，-20℃靜置。上述各個試驗于室溫下解凍，4 000 r/min離心15 min，分別吸取上清液1 mL，稀釋10倍，分別測定280 nm、620 nm、650 nm處的吸光度，分析不同溶劑、冷凍時間、料液比、凍融次數(shù)對藻藍蛋白純度及得率的影響。

采用Design Expert軟件的Box Behnken設(shè)計優(yōu)化凍融法破壁參數(shù)，以料液比、冷凍時間、凍融次數(shù)為自變量，藻藍蛋白得率為響應(yīng)值，設(shè)計RSM試驗。分別給各試驗因素設(shè)置3個水平(表2)，以藻藍蛋白的純度和回收率作為響應(yīng)變量設(shè)計試驗，共17個析因點，其中有5個重復的中心點。

表2 響應(yīng)面分析試驗因素和水平Table 2 Test factors and levels used for response surface analysis

1.2.4 活性炭吸附法提取藻藍蛋白

活性炭吸附法是利用活性炭吸附雜質(zhì)或蛋白從而提取蛋白的方法。單因素試驗操作如下：①取5份20 mL溶脹法所得的海藻液體，分別加入100目、200目、300目、400目、500目活性炭，靜置吸附5 min；②取5份20 mL溶脹法所得海藻液體，分別加入活性炭0.1 g、0.3 g、0.5 g、0.7 g、0.9 g，活性炭目數(shù)為上一步試驗所得的最優(yōu)目數(shù)，靜置吸附5 min；③取5份20 mL溶脹法所得的海藻液體，加入的活性炭量為上一步試驗所得的最優(yōu)條件，分別靜置吸附5 min、10 min、15 min、20 min、25 min。將以上各個試驗海藻液體以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去沉淀，分別吸取上清液1 mL，稀釋適當倍數(shù)，分別測定280 nm、620 nm、650 nm處的吸光度，分析不同活性炭目數(shù)、活性炭加入量、吸附時間對藻藍蛋白純度及得率的影響。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 10.0軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計原理進行響應(yīng)面試驗，選取活性炭目數(shù)、活性炭加入量和吸附時間3個因素作為試驗因素，分別給各試驗因素設(shè)置適宜的3個水平(表3)，以藻藍蛋白的純度和回收率作為響應(yīng)變量設(shè)計試驗，共17個析因點，其中有5個重復的中心點。

表3 響應(yīng)面分析試驗因素和水平Table 3 Test factors and levels used for response surface analysis

1.2.5 疏水層析純化藻藍蛋白

將活性炭吸附法提取得到的藻藍蛋白液，經(jīng)超濾濃縮至一定濃度后，采用0.05 mol/L PBS磷酸緩沖液(含0.6 mol/L 硫酸銨)預(yù)平衡的疏水層析填料進行梯度洗脫，洗脫液梯度依次為0.05 mol/L PBS (含0.6 mol/L硫酸銨)、0.05 mol/L PBS (含0.3 mol/L硫酸銨)、0.05 mol/L PBS、純水，流速控制為2 mL/min，3 min每管，測定各管280 nm、620 nm、650 nm處吸光度，計算純度，分別合并純度1-2、純度2-3和純度大于3的蛋白液，計算純度及回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶脹法結(jié)果分析

2.1.1 料液比、溶脹時間、溶脹次數(shù)對藻藍蛋白純度及得率的影響

隨著料液比的增加，藻藍蛋白的得率顯著上升，而純度顯著下降，且在料液比為1∶200 (g/mL)時，藻藍蛋白得率最高，純度最低[圖1(a)]。說明隨著料液比的增加，螺旋藻細胞內(nèi)外滲透壓差越來越大，細胞壁破碎釋放出的藻藍蛋白增多，同時很多其他蛋白質(zhì)成分可能一起溶脹出來，因此藻藍蛋白得率逐漸增加而純度逐漸減少。料液比太高會造成實際生產(chǎn)成本的增加，故選用1∶50 (g/mL)作為藻藍蛋白料液比的最優(yōu)值。隨著溶脹時間的延長，藻藍蛋白的得率和純度均顯著升高[圖1(b)]。說明隨著溶脹時間的延長，更多藻藍蛋白釋出，但是較長的溶脹時間會造成實際生產(chǎn)成本增加和生產(chǎn)效率降低，故選用24 h作為溶脹時間的最優(yōu)值。隨著螺旋藻溶脹次數(shù)的增加，藻藍蛋白的得率上升，而純度下降[圖1(c)]。根據(jù)實際生產(chǎn)的需要，選擇溶脹2次作為最優(yōu)值。

* indicates significant difference in purity，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；# indicates significant difference in yield，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001，#### P<0.0001圖1 料液比、溶脹時間、溶脹次數(shù)對藻藍蛋白純度及得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio,swelling time and swelling times on the purity and yield of phycocyanin

2.1.2 溶脹試驗響應(yīng)面分析法優(yōu)化

采用Design-Expert軟件對表4的試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到藻藍蛋白得率對3個因素的多元二次回歸模型：得率Y=2.28+0.12A+0.22B+0.50C，從二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果可知，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.835 7，P=0.000 1<0.05，失擬項P=0.097 0>0.05，說明回歸方程擬合度和可信度均較高，能較為真實地對最優(yōu)工藝進行預(yù)測。

表4 溶脹法Box-Behnken 試驗分析及結(jié)果Table 4 Analysis and results of Box-Behnken test by swelling method

續(xù)表Continued table

由回歸方程系數(shù)顯著性檢測結(jié)果(表5)可知，因素A、C的P值分別為0.000 6，0.000 1(P<0.01)，BC的P值為0.001 3 (P<0.01)。各影響因素所對應(yīng)的P值越小，F(xiàn)值越大，意味著該因素對響應(yīng)變量的影響越顯著，因此根據(jù)表5中F值大小可以看出，影響溶脹法破壁效果的因素為溶脹次數(shù)>料液比>溶脹時間。

表5 溶脹法提取率回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model for extraction rate by swelling method

2.1.3 溶脹法各因素之間的相互作用

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果作響應(yīng)曲面圖，考察擬合的曲面形狀，分析料液比、溶脹時間，溶脹次數(shù)三者之間交互作用對藻藍蛋白得率的影響(圖2)。由圖2可知，這3個因素之間無相互影響，故根據(jù)每個因素的最佳結(jié)果組合可以得到溶脹法破壁的最佳方案為料液比1∶50 (g/mL)，溶脹時間24 h，溶脹次數(shù)2次。模型預(yù)測純度為0.47，預(yù)測提取率為2.16%。

圖2 料液比、溶脹時間及溶脹次數(shù)的相互影響Fig.2 Interaction of solid-liquid ratio,swelling time and swelling times

2.1.4 驗證性試驗

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得的最優(yōu)破壁條件：料液比1∶50 (g/mL)，溶脹時間24 h，溶脹次數(shù)2次，進行驗證性試驗，重復3次，取平均值，測得藻藍蛋白純度為0.47，得率為2.17%，與模型預(yù)測純度0.47相同，與模型預(yù)測得率2.16%接近，表明該方案穩(wěn)定可靠，具有實用價值。

2.1.5 細胞破碎前后對比

螺旋藻細胞破碎前后的顯微結(jié)構(gòu)如圖3所示。破壁后螺旋藻圓柱形螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了斷裂，同時產(chǎn)生了大量細胞碎片，可見溶脹法破壁效果良好。

圖3 螺旋藻細胞破碎前后的顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of Spirulina cells before and after fragmentation

2.2 凍融法結(jié)果分析

2.2.1 不同溶劑、冷凍時間、料液比、凍融次數(shù)對藻藍蛋白純度及得率的影響

與純水比較，當用0.10 mol/L PBS緩沖液提取藻藍蛋白時，藻藍蛋白的得率和純度極顯著升高，故選擇0.10 mol/L PBS緩沖液作為凍融法提取藻藍蛋白的溶劑[圖4(a)]。冷凍時間從4 h增加到12 h時，藻藍蛋白的得率先上升后下降，而藻藍蛋白的純度緩慢下降[圖4(b)]。隨著時間的增加，螺旋藻細胞會破碎從而釋放出藻藍蛋白，但與此同時其他雜質(zhì)增加導致純度緩慢下降，故選擇8 h作為冷凍時間的最優(yōu)值。料液比從1∶10 (g/mL)變化到1∶200 (g/mL)時，藻藍蛋白的得率逐漸上升，而藻藍蛋白的純度下降但差異不顯著[圖4(c)]，故選用1∶50 (g/mL)作為藻藍蛋白料液比的最優(yōu)值。凍融次數(shù)從2次增加到3次時，藻藍蛋白的得率和純度無顯著性差異[圖4(d)]，說明在凍融2次后大部分藻藍蛋白已釋出，因此選擇2次作為凍融次數(shù)的最優(yōu)值。

2.2.2 凍融試驗響應(yīng)面分析法優(yōu)化

采用Design-Expert軟件對表6的試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到藻藍蛋白得率對3個因素的多元二次回歸模型：得率Y=2.30+0.43A+0.055B+0.53C-0.060AB+0.18AC+0.22BC。模擬相關(guān)系數(shù)R2=0.903 0，P=0.000 2<0.05，失擬項P=0.3>0.05，說明回歸方程擬合度和可信度均很高，能較準確地對最優(yōu)工藝進行預(yù)測。因素A、B、C的P值分別為0.001 6，0.155 8，0.000 6，可知試驗中一次項A極顯著(P<0.01)，B不顯著，C極顯著(P<0.01)(表7)。交互項AB、AC、BC的P值分別為0.146 0，0.107 3，0.002 3，可知交互項AB、AC不顯著，BC極顯著(P<0.01)。根據(jù)表7中F值大小，可得出影響凍融法破壁得率的因素為冷凍次數(shù)>料液比>冷凍時間。

表6 凍融法Box-Behnken 試驗分析及結(jié)果Table 6 Analysis and results of Box-Behnken test by freeze-thaw method

表7 凍融法提取率回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model for the extraction rate by freeze-thaw method

2.2.3 凍融法不同因素間的相互作用

根據(jù)Box-Behnken試驗結(jié)果作響應(yīng)曲面圖，考察擬合的曲面形狀，分析冷凍時間、料液比、凍融次數(shù)三者之間交互作用對藻藍蛋白得率的影響(圖5)。各因素及交互作用經(jīng)響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得的最優(yōu)提取條件為料液比1∶50 (g/mL)，冷凍時間8 h，凍融次數(shù)3次。模型預(yù)測純度為0.38，預(yù)測得率為2.24%。

圖5 冷凍時間、料液比、凍融次數(shù)交互作用圖Fig.5 Interaction diagram of freezing time,solid-liquid ratio and freeze-thaw times

2.2.4 驗證性試驗

根據(jù)響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得的最優(yōu)提取條件：料液比1∶50 (g/mL)，冷凍時間8 h，凍融次數(shù)3次，進行驗證性試驗，重復3次，取平均值，測得藻藍蛋白純度為0.34，得率為2.19%，與模型預(yù)測純度0.38、預(yù)測得率2.24%接近，表明該方案穩(wěn)定可靠，具有實用價值。

2.3 活性炭吸附法提取藻藍蛋白

2.3.1 活性炭目數(shù)、活性炭加入量和吸附時間對藻藍蛋白純度和得率的影響

活性炭吸附法各因素對藻藍蛋白純度和得率的影響如圖6所示?；钚蕴磕繑?shù)在300目時，藻藍蛋白的純度最高，得率最低；當活性炭目數(shù)為400目和500目時，純度有下降趨勢，而得率升高[圖6(a)]。

* indicates significant difference in purity，*P<0.05，**P <0.01;# indicates significant difference in yield，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001，#### P<0.0001圖6 活性炭目數(shù)、活性炭加入量、吸附時間對藻藍蛋白純度及得率的影響Fig.6 Effect of active carbon mesh number,active carbon amount and adsorption time on purity and yield of phycocyanin

因此，選擇活性炭目數(shù)300目作為最優(yōu)吸附條件。隨著活性炭加入量的增加，藻藍蛋白純度先顯著增加而后下降，而得率呈顯著下降趨勢[圖6(b)]。當活性炭加入量為0.7 g/20 mL時，純度最高，因此可作為最優(yōu)吸附條件。當吸附時間為10 min時，藻藍蛋白純度處于最大值；隨著吸附時間的延長，得率呈下降趨勢，整體呈“W”型；當吸附時間為10-25 min時，得率差異不顯著[圖6(c)]，因此選擇10 min作為最優(yōu)活性炭吸附時間。

2.3.2 活性炭吸附試驗響應(yīng)面分析法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取活性炭目數(shù)(A)、活性炭加入量(B)和吸附時間(C)3個因素進行Box-Behnken試驗設(shè)計，共17個析因點，其中有5個重復的中心點，試驗設(shè)計方案與結(jié)果如表8所示。

表8 Box-Behnken試驗分析結(jié)果Table 8 Box-Behnken test analysis results

采用Design-Expert 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到回歸模型為藻藍蛋白純度P=0.66-0.042A+3.750×10-3B+6.250×10-3C+0.045AB+0.030AC+0.017BC+0.063A2+0.010B2-4.750×10-3C2(R2=0.910 2)，藻藍蛋白回收率RP=71.91+2.61A-4.01B-0.90C+1.78AB+2.41AC- 0.43BC-5.20A2-2.23B2+0.93B2(R2=0.980 4)。

藻藍蛋白純度和回收率的回歸方程及偏回歸系數(shù)方差分析分別見表9和表10。從表9可以看出，純度模型P<0.05，表明該模型可靠，達到了顯著水平，決定系數(shù)R2=0.910 2，說明該模型可以解釋91.02%的響應(yīng)值變化，擬合度較精確；該模型失擬項P>0.05，不顯著，說明整個模型在該回歸區(qū)域內(nèi)合理，可用來分析藻藍蛋白純度結(jié)果。根據(jù)F值大小可得出影響藻藍蛋白純度的因素為活性炭目數(shù)>吸附時間>活性炭加入量。

表9 藻藍蛋白純度回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model for phycocyanin purity

表10 藻藍蛋白回收率方差分析Table 10 Variance analysis of phycocyanin recovery rate

從表10可以看出，回收率模型P<0.05，表明該模型可靠，達到了顯著水平，決定系數(shù)R2=0.980 4，說明該模型可以解釋98.04%的響應(yīng)值變化，擬合度非常精確；該模型失擬項P>0.05，不顯著，說明整個模型在該回歸區(qū)域內(nèi)合理，可用來分析藻藍蛋白回收率結(jié)果。根據(jù)F值大小可得出影響藻藍蛋白回收率的因素為活性炭加入量>活性炭目數(shù)>吸附時間。

由圖7中純度和回收率預(yù)測值和實際值的對比結(jié)果可以看出，本次試驗回收率的預(yù)測值和實際值比較接近，而純度的預(yù)測值和實際值有一定差距，可能是由于在各個條件下純度的變化范圍較小，導致結(jié)果較難預(yù)測，從而造成一定誤差，但總體上模型可靠。

圖7 純度和回收率預(yù)測值與實際值對比Fig.7 Comparison of predicted values with actual values of purity and recovery rate

2.3.4 活性炭吸附法不同因素間的相互作用

活性炭加入量與吸附時間交互作用的響應(yīng)面圖如圖8、圖9所示。通過響應(yīng)面的最優(yōu)組合分析可得到活性炭吸附法粗提藻藍蛋白的最優(yōu)條件為300目活性炭，活性炭加入量0.5 g/20 mL，吸附時間10 min。預(yù)測值純度為0.80，回收率為70.56%。

圖8 純度模型中活性炭加入量與吸附時間交互作用圖Fig.8 Interaction diagram of active carbon added amount and adsorption time in purity model

圖9 回收率模型中活性炭加入量與吸附時間交互作用圖Fig.9 Interaction diagram of active carbon added amount and adsorption time in the recovery rate model

2.3.5 驗證性試驗

采用響應(yīng)面優(yōu)化法所得的最優(yōu)提取條件：300目活性炭，活性炭加入量0.5 g/20 mL，吸附時間10 min，進行驗證性試驗，重復3次，取平均值，測得藻藍蛋白純度為0.80，回收率為73.23%。表明該方案穩(wěn)定可靠，具有實用價值。

2.4 疏水層析洗脫結(jié)果及其光譜圖分析

對藻藍蛋白依次進行洗脫，首先，采用0.05 mol/L PBS緩沖液(含0.6 mol/L PBS硫酸銨)洗脫，得到近200mL黃綠色藻液；其次，采用0.05mol/L PBS緩沖液(含0.3 mol/L PBS硫酸銨)洗脫，得到亮藍色藻液；再次，采用0.05 mol/L PBS緩沖液洗脫，得到亮藍色藻液；最后，采用純水洗脫，得到藍綠色藻液。將依次洗脫得到的各藻液進行紫外測定，分別合并純度1-2、純度2-3和純度大于3的藻液，各藻液全波長掃描光譜見圖10。采用0.05 mol/L PBS緩沖液(含0.6 mol/L PBS硫酸銨)以及最后采用純水洗脫出的物質(zhì)主要是葉綠素、雜蛋白等雜質(zhì)；采用0.05 mol/L PBS緩沖液(含0.3 mol/L PBS硫酸銨)和0.05 mol/L PBS緩沖液梯度洗脫出來的物質(zhì)主要是藻藍蛋白。

圖10 各藻液的紫外光譜圖Fig.10 Ultraviolet spectrum of each algal liquid

藻藍蛋白提純結(jié)果如表11所示，經(jīng)過溶脹-活性炭吸附-疏水層析三步提純藻藍蛋白后，純度1-2的藻藍蛋白回收率為14.63%，純度2-3的藻藍蛋白回收率為37.49%，純度>3的藻藍蛋白回收率為9.03%，總回收率為61.15%。純度2-3的藻液可用于后續(xù)純化，以得到更高純度的藻藍蛋白。

表11 藻藍蛋白提純工藝結(jié)果Table 11 Results of phycocyanin purification process

3 討論

藻藍蛋白是螺旋藻中的一種天然藍色色素，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值[24]，總蛋白質(zhì)含量高達55%-65%[12]，但是其來源單一，純化難度較大，生產(chǎn)成本較高[25]。為進一步提高螺旋藻的破壁效率，降低提取成本，提高產(chǎn)品回收率和純度，分離出醫(yī)藥級藻藍蛋白，本研究以響應(yīng)面分析法優(yōu)化藻藍蛋白的破壁條件和提取方法。

溶脹法和凍融法提取藻藍蛋白所需設(shè)備簡單，操作性強[26,27]。本研究通過對溶脹法和凍融法中不同破壁影響因素進行響應(yīng)面模型設(shè)計試驗，結(jié)果表明溶脹法優(yōu)于凍融法，凍融法規(guī)?；a(chǎn)時間長，難以實現(xiàn)。高濃度的硫酸銨溶液(飽和度大于40%)可以沉淀藻藍蛋白，缺點是引入大量的硫酸銨，易使土壤酸化板結(jié)，為后續(xù)的處理帶來麻煩[12,26]，而活性炭相比硫酸銨具有價廉易得、安全無污染、比表面積較大、吸附能力強和吸附時間短等特點[7,28]。本研究通過采用活性炭代替?zhèn)鹘y(tǒng)鹽析法所用的硫酸銨，可有效去除藻藍蛋白粗提液中的雜蛋白與小分子雜質(zhì)，不必經(jīng)過透析等特殊處理即可上柱純化，提升藻藍蛋白純度，使提取過程更加簡單可行，同時在使用過程中不會影響提取物的性質(zhì)，為后期規(guī)?；囼灥拈_展以及生產(chǎn)線的建設(shè)提供了參考。但活性炭吸附法仍存在吸附條件難以控制、吸附雜質(zhì)選擇性機理尚不明確等缺點，還有待進一步改進。

柱層析法存在進口填料昂貴、清洗不方便、上樣量低等缺陷，本研究采用北京生產(chǎn)的疏水層析填料進行藻藍蛋白純化，不僅降低了成本，而且獲得了醫(yī)藥級藻藍蛋白，但未能得到試劑級藻藍蛋白，后續(xù)試驗考慮將藻藍蛋白液進行二次過柱以提高純度。目前，本研究提出的藻藍蛋白提取純化工藝仍存在提升空間，后續(xù)將進一步綜合考察各類方法，篩選出更適合藻藍蛋白工業(yè)化生產(chǎn)的提純工藝，為藻藍蛋白的提取工藝優(yōu)化提供理論參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過溶脹法破壁-活性炭吸附法提取-疏水層析純化三步提純藻藍蛋白的工藝優(yōu)化后，從鈍頂螺旋藻中可分離出醫(yī)藥級(P≥3.0)藻藍蛋白，所用試劑及耗材價廉易得、安全無污染、提取成本較低，為日后的深加工與應(yīng)用提供了前期基礎(chǔ)。