趙紅，馬尚玄，鐘濤，徐榮，付鎵榕

云南省熱帶作物科學(xué)研究所（景洪 666100）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia spp.）又稱夏威夷果，屬山龍眼科（Proteaceae），澳洲堅(jiān)果屬（Macadamia F.Muell）常綠喬木果樹[1-2]。澳洲堅(jiān)果主要種植在澳大利亞、中國、美國等30余個(gè)國家和地區(qū)，我國種植區(qū)域主要分布在云南、廣西、貴州等省區(qū)[3-4]。澳洲堅(jiān)果富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及鈣、磷、鐵、B族維生素、抗糙皮病的煙酸和酚類物質(zhì)等，具有豐富的藥用保健價(jià)值[5-9]。其中，從澳洲堅(jiān)果中提取的酚類物質(zhì)是天然的抗氧化劑，對(duì)澳洲堅(jiān)果果仁防止氧化起一定保護(hù)作用，并具有抑菌、助消化、降血脂、抗輻射、抗腫瘤等多種功能[10-12]。隨著澳洲堅(jiān)果附屬產(chǎn)品的開發(fā)，對(duì)澳洲堅(jiān)果中的酚類物質(zhì)進(jìn)行深入研究有利于提高澳洲堅(jiān)果的附加值。

多酚含量的測定方法有酒石酸亞鐵法、高錳酸鉀滴定法、Folin-Ciocalteu比色法、普魯士藍(lán)法及氣相、液相色譜法等[13-15]。Folin-Ciocalteu比色法具有操作便捷、成本低廉、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，常用于植物體內(nèi)的多酚化合物的測定[16-19]。試驗(yàn)采用Folin-Ciocalteu比色法測定澳洲堅(jiān)果中多酚成分含量，對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、Na2CO3濃度、試劑用量等測定條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)該法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性等進(jìn)行試驗(yàn)評(píng)價(jià)，旨在建立測定澳洲堅(jiān)果中多酚含量的方法，為澳洲堅(jiān)果產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅(jiān)果青皮樣品：澳洲堅(jiān)果采摘于云南省景洪市景哈鄉(xiāng)云南省熱帶作物科學(xué)研究所澳洲堅(jiān)果試驗(yàn)基地，清洗后脫下青皮，放置恒溫干燥箱中45 ℃烘至恒重，粉碎過篩，取0.9～2.0 mm的青皮粉與0.9 mm以下的青皮粉按1∶1混合，備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；Folin-Ciocaileu試劑（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；無水乙醇、Na2CO3等（國藥集團(tuán)，分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

BGZ-240型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ME204E型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV-1100型紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 方法

1.3.1 澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取液的制備

準(zhǔn)確稱取烘干后粉碎過篩的澳洲堅(jiān)果青皮樣品50 g，用60%乙醇溶液按1∶30 g/mL滲漉提取，減壓蒸餾后定容至500 mL，取上1 mL清液定容至100 mL，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50 mL蒸餾水溶解，移至100 mL容量瓶中，定容搖勻，得質(zhì)量濃度1.00 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取2，3，4，5，6，7和8 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液到100 mL容量瓶中，加蒸餾水至標(biāo)線定容，得質(zhì)量濃度分別為20，30，40，50，60，70和80 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.3 Folin-Ciocalteu比色法測定條件的優(yōu)化

1.3.3.1 檢測波長的確定

分別準(zhǔn)確移取1.0 mL澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取液和1.0 mL 40 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色管中，分別加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 12.5%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h，用紫外分光光度計(jì)在400～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，繪制光譜曲線，以確定最佳波長。

1.3.3.2 顯色時(shí)間的確定

準(zhǔn)確移取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 12.5%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30℃水浴條件下分別反應(yīng)30，40，50，60，70，80和90 min后，取出測定吸光度，以確定最佳顯色時(shí)間。

1.3.3.3 Na2CO3濃度的確定

準(zhǔn)確移取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，分別加入3 mL 5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%，17.5%和20.0%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h后，取出測定吸光度，以確定Na2CO3溶液的最佳濃度。

1.3.3.4 Na2CO3試劑加入量的確定

準(zhǔn)確移取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，分別加入1，2，3，4，5，6和7 mL的15% Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h后，取出測定吸光度，以確定Na2CO3試劑的最佳用量。

1.3.3.5 顯色溫度的確定

準(zhǔn)確移取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 15%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻分別靜置于20，30，40，50，60，70和80 ℃水浴反應(yīng)1 h后，取出測定吸光度，以確定最佳顯色溫度。

1.3.3.6 Folin-Ciocalteu試劑用量的確定

準(zhǔn)確移取1 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到比色管中，分別加入0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50和1.75 mL的1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 15%的Na2CO3溶液后，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置于40 ℃水浴鍋內(nèi)，待其反應(yīng)1 h后，取出測定吸光度，以確定Folin-Ciocalteu試劑最佳用量。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取1 mL不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蒸餾水替代樣品為空白，采用1.3.3小節(jié)的方法確定的最佳測定條件，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 Folin-Ciocalteu比色法的評(píng)價(jià)

1.3.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備好的澳洲堅(jiān)果青皮滲漉提取液，按照試驗(yàn)確定的最佳測定條件，在與顯示劑反應(yīng)完全后避光靜置0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 h后測定吸光度，根據(jù)吸光度的變化評(píng)價(jià)該比色法在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.3.5.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取5份澳洲堅(jiān)果青皮樣品制備青皮滲漉提取液，按照試驗(yàn)確定的最佳測定條件測定吸光度，并計(jì)算多酚含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該比色法的重現(xiàn)性。

1.3.5.3 精密度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)確定的最佳測定條件，對(duì)同一澳洲堅(jiān)果青皮滲漉提取液平行測定5次吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該比色法的精密度。

1.3.5.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在6份澳洲堅(jiān)果青皮滲漉提取液中分別加入0，10，20，30，40和50 μg的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，測定提取液中的多酚含量，并計(jì)算回收率、平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該比色法的準(zhǔn)確度和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu比色法檢測條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

酚類物質(zhì)與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)后，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸被還原，使W6+變?yōu)閃5+，生成藍(lán)色的化合物，通過在400～800 nm范圍內(nèi)測定藍(lán)色化合物的吸收光譜，選出最大吸收波長為檢測波長[20-21]，不同波長下的檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的吸收光譜

結(jié)果表明，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、澳洲堅(jiān)果青皮提取液反應(yīng)顯色后，兩者均在762 nm處有最大吸收，因此最佳檢測波長為762 nm。

2.1.2 顯色時(shí)間的確定

提取液中的酚類物質(zhì)與加入的Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)需要一定時(shí)間，不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響如圖2所示。

圖2 吸光度隨顯色時(shí)間的變化

結(jié)果表明，吸光度在60 min內(nèi)逐漸增大，顯色反應(yīng)較快，在60 min處達(dá)到最大值，隨后吸光度趨于穩(wěn)定，說明60 min時(shí)反應(yīng)已基本完全，因此最佳顯色時(shí)間為60 min。

2.1.3 Na2CO3濃度的確定

Na2CO3溶液是顯色反應(yīng)中的緩沖液，在提供堿性環(huán)境的條件下使酚類物質(zhì)與顯色劑反應(yīng)顯藍(lán)色，顯色反應(yīng)對(duì)Na2CO3溶液的濃度有一定要求，濃度高低都會(huì)影響顯色體系的穩(wěn)定性[22]，不同Na2CO3濃度對(duì)吸光度的影響如圖3所示。

圖3 吸光度隨Na2CO3濃度的變化

結(jié)果表明，隨著Na2CO3溶液濃度的增加，吸光度呈先上升后下降趨勢，Na2CO3溶液濃度15%時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，因此Na2CO3最佳濃度為15%。

2.1.4 Na2CO3溶液加入量的確定

提取液在堿性的條件下才可以穩(wěn)定顯色，Na2CO3加入量多少將影響提取液堿性的強(qiáng)弱，對(duì)提取液顯色有很大影響。不同加入量15% Na2CO3溶液對(duì)吸光度的影響如圖4所示。

圖4 吸光度隨Na2CO3溶液加入量的變化

結(jié)果表明，隨著15% Na2CO3溶液加入量的增加，吸光度總體呈先上升后下降趨勢，在用量3 mL時(shí)達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)槌跏糔a2CO3溶液加入量不足導(dǎo)致顯色不完全，而過量的Na2CO3溶液會(huì)影響顯色體系不穩(wěn)定也會(huì)導(dǎo)致顯色不完全[23]。因此15% Na2CO3溶液最佳加入量為3 mL。

2.1.5 顯色溫度的確定

顯色溫度的高低會(huì)影響有色物質(zhì)的穩(wěn)定性和Na2CO3的溶解度，不同顯色溫度對(duì)吸光度的影響如圖5所示。

圖5 吸光度隨反應(yīng)溫度的變化

結(jié)果表明，隨著溫度的升高，吸光度呈現(xiàn)先上升趨勢，在40 ℃時(shí)吸光度達(dá)到最大值，隨著反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，吸光度呈下降趨勢，這可能是隨著反應(yīng)溫度的升高部分生成的有色物質(zhì)被破壞分解所致[24]，因此最佳顯色溫度為40 ℃。

2.1.6 Folin-Ciocalteu試劑加入量的確定

Folin-Ciocalteu試劑與多酚反應(yīng)后產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)特定波長的光有最大吸收，所以Folin-Ciocalteu試劑加入量的多少?zèng)Q定著顯色反應(yīng)是否完全[25]。不同F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑加入量對(duì)吸光度的影響如圖6所示。

圖6 吸光度隨Folin-Ciocalteu試劑加入量的變化

結(jié)果表明，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑加入量在0.25～1 mL時(shí)，顯色劑增加吸光度也逐漸增加，加入量達(dá)到1 mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，之后吸光度緩慢下降，因此Folin-Ciocalteu試劑最佳加入量為1 mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)試驗(yàn)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒食子酸濃度為X軸、吸光度為Y軸建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。回歸方程式為y=0.012 3x+0.005 9，沒食子酸質(zhì)量濃度在20～80 μg/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.999 0），該方程可用于澳洲堅(jiān)果青皮中多酚的定量測定。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 Folin-Ciocalteu法測定澳洲堅(jiān)果青皮多酚方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備好的澳洲堅(jiān)果青皮滲漉提取液，按照最佳測定條件進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，在與顯示劑反應(yīng)完全后避光放置在不同時(shí)間后取出測定吸光度見表1。隨著時(shí)間的延長，吸光度有緩慢上升趨勢，但幅度不大，相對(duì)偏差為2.05%，說明該方法在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取5份澳洲堅(jiān)果青皮樣品制備青皮滲漉提取液，用Folin-Ciocalteu比色法測定其多酚含量進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，結(jié)果見表2。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80%，說明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

2.3.3 精密度試驗(yàn)

根據(jù)最佳測定條件進(jìn)行精密度試驗(yàn)，對(duì)同一澳洲堅(jiān)果青皮滲漉提取液平行測定5次吸光度，分別為0.504，0.492，0.496，0.495和0.493，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.96%。說明該方法具有較高的精密度，能滿足澳洲堅(jiān)果青皮多酚的測定要求。

2.3.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在6份澳洲堅(jiān)果青皮滲漉提取液中分別加入0，10，20，30，40和50 μg的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，由表3可知，加標(biāo)回收試驗(yàn)的最高回收率為102.40%，最低回收率為99.19%，平均回收率為100.65%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%。說明完全可用于澳洲堅(jiān)果青皮多酚的測定。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

3 結(jié)論

澳洲堅(jiān)果青皮中的酚類成分具有較好的抗氧化活性，在抗衰老、抗炎癥等方面可發(fā)揮作用[26-27]。試驗(yàn)探究Folin-Ciocalteu比色法測定澳洲堅(jiān)果青皮中的多酚含量，確定最優(yōu)檢測條件：加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL，15%的Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水定容至10 mL后置于40 ℃水浴鍋內(nèi)，待其反應(yīng)60 min后在762 nm波長處測定吸光度，沒食子酸質(zhì)量濃度在20～80 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.999 0），平均回收率為100.65%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%。結(jié)果表明該檢測方法操作過程簡單、便捷，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，精密度、回收率高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為澳洲堅(jiān)果研究提供試驗(yàn)參考。