趙悅，李佳錦，張希，楊婧娟，馬雅鴿*

云南中醫(yī)藥大學（昆明 650500）

葛根常作為保健食品的原料。葛根中的活性成分有黃酮類化合物（3.78%）[1]、香豆素類、氨基酸類等[2]，而如何提高葛根素提取效率一直是研究熱點。常用的傳統(tǒng)提取法有水提取法、醇提取法[3]和回流法[4]；現(xiàn)代提取工藝有微波輔助提取[5]、超聲提取[6]、酶解法、超臨界流體提取法[7]、半仿生提取法[8]、仿生提取法[9]等。水提和醇提法最為常見，但用這2種方法提取葛根素得率的差異需做進一步試驗研究。葛根素、黃酮類含量常見的檢測方法有高效液相法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]、紫外分光光度法[1]等。葛根素具有廣泛的藥理活性，如降壓[11]、降糖[12]、改善骨質疏松[13]、保護心肌細胞[14]、抗腫瘤[15]、抗血小板聚集等[2,16]。還可用于輔助治療心腦循環(huán)障礙相關疾病[11,17-18]，及慢性酒精誘導的肝損傷[19]、糖尿病[16,20-23]。近年來，對于免疫類疾病的研究也成為熱點，試驗研究更是涉及細胞、動物、通路等，相關研究技術和思路也更加成熟和系統(tǒng)。葛根素也具一定免疫調節(jié)作用，如葛根素可通過NF-κB信號通路減輕高糖誘導的RSC96細胞炎癥[24]，但研究并不全面。

基于此，試驗采用高效液相色譜法[10]測定楚雄葛根粉中葛根素含量；采用均勻設計法[8]，對葛根素及黃酮的水提和醇提工藝進行優(yōu)化和對比研究；以小鼠RAW264.7巨噬細胞為模型，探討2種提取物對RAW264.7的免疫調節(jié)活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楚雄葛根全粉（Chuxiong Radix Puerariae thomsonii Powder，CRPTP，云南省楚雄州姚安縣）；RAW264.7細胞（RAW購自武漢普諾賽生命科技有限公司，源自Abelson鼠科白血病病毒誘導的腫瘤；sIg-、Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。RAW264.7細胞不分泌可檢測到的病毒顆粒，XC斑點形成試驗陰性。RAW264.7細胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖，并且可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細胞。LPS或PPD處理2的、可誘導RAW264.7細胞分解紅血球，但對腫瘤靶細胞無作用）。

蘆丁（99.99%，上海源葉生物科技有限公司）；葛根素（99.99%，上海麥克林生物科技有限公司）；其余試劑均為國產分析純；中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；脂多糖（LPS，純度≥98%，Solarbio）；CCK-8試劑盒（proteintech）；胎牛血清（BI公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國gibico公司）

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（L5S，上海精密儀器儀表有限公司）；電子天平（CP214，上海奧豪斯儀器有限公司）；超聲波清洗機（SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司）；低速離心機（SC-3614，安徽中科中佳科學儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（HGZF-Ⅱ/H-101-3，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；超純水儀（LAB-250SY，南京歐鎧環(huán)境科技有限公司）；高效液相色譜儀（HITACHI L2000，美國安捷倫公司）。

1.3 方法

1.3.1 葛根素和黃酮提取方法

稱取5.000 0 g的葛根粉，配好提取液，頻率40 kHz，功率100 W，室溫，超聲5 min，控制不同條件提取，提取物離心15 min，得到葛根提取液。

1.3.1.1 水提法

采用DPS軟件，以葛根素和總黃酮含量為指標，進行提取時間（X1）、提取溫度（X2）和料液比（X3）的三因素九水平均勻試驗設計，進行試驗，對楚雄葛根水提物中葛根素和黃酮的提取條件進行優(yōu)化。

1.3.1.2 醇提法

采用DPS軟件，以葛根素和總黃酮含量為指標，進行乙醇體積分數(shù)（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）、料液比（X4）的四因素九水平的均勻試驗設計，進行試驗，對楚雄葛根醇提物中葛根素和黃酮的提取條件進行優(yōu)化。

1.3.2 高效液相色譜法測定葛根素含量

色譜條件：ODSHYPERSIL色譜柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μL，檢測波長250 nm。

樣品溶液的制備：準確稱取5.000 g葛根粉，置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 70%的乙醇，在80 ℃水浴鍋中回流提取60 min，提取液以3 000 r/min離心10 min，取上清液，加入70%的乙醇定容至100 mL，待測。

葛根素含量的測定：用雙蒸水將100 mg/mL的葛根素標準品母液，稀釋成質量濃度為10，20，30，40，50，60，80，100，120和200 μg/mL的葛根素標準品使用液。進樣量20 μL，進行HPLC測定。以葛根素含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。取4種市售葛根樣品液，進樣量20 μL，根據(jù)峰面積計算葛根素含量[22]。

1.3.3 分光光度法測定葛根素含量

用30%乙醇配制100 mg/mL葛根素標準液，稀釋成質量濃度為0，10，20，30，40，50，60，80，100和120 μg/mL的葛根素標準品使用液。在波長250 nm處，測定吸光度。以葛根素濃度為橫坐標，250 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線。用紫外可見分光光度計在波長250 nm處，測定葛根提取液的吸光度，將吸光度代入葛根素標準曲線，計算樣品中葛根素含量。

1.3.4 分光光度法測定總黃酮含量

用80%乙醇體積分數(shù)配制質量濃度100 μg/mL的蘆丁標準液母液，稀釋成質量濃度為0，20，30，40，50，60，70和80 μg/mL的蘆丁標準系列使用液。在波長510 nm處測量吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，A510nm為縱坐標繪制標準曲線。在波長510 nm處，測定葛根提取液的吸光度，將吸光度代入蘆丁標準曲線，計算樣品中黃酮含量。

1.3.5 葛根粉水提物和葛根粉醇提物對RAW264.7細胞增殖作用的影響

將長勢良好的RAW264.7細胞以1×105CFU/mL的密度取200 μL接種到96孔板[25]，在5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。設置空白組（NG）、陽性對照組（LPS）、給藥組，給藥組分別加入葛根水提物（pueraria aqueous extract，PAE）和葛根醇提物（pueraria ethanol extract，PEE）且分別設低、中、高劑量組，濃度分別為50，200和800 μg/mL，每組5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，并加培養(yǎng)液至100 μL，將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度，按式（1）計算細胞增殖率，即細胞活力。

1.3.6 葛根水提物及醇提物對RAW264.7細胞吞噬作用的影響

將長勢良好的RAW264.7細胞以1×105CFU/mL的密度，取200 μL接種到96孔板，在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)液，設置空白組（NG）、陽性對照組（LPS）、給藥組，給藥組分別加入PAE和PEE，且分別設低、中、高劑量組，每組5個復孔。培養(yǎng)12 h后，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗1次，加入50 μL中性紅染色液，染色20 min，棄去染色液，用PBS緩沖液清洗2次，在顯微鏡下檢測細胞染色情況。加入200 μL中性紅檢測裂解液，室溫振蕩裂解10 min，裂解50 min，用酶標儀在540 nm處測定吸光度，按式（2）計算吞噬率。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗采用DPS 9.50軟件對所有數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合出變量之間的方程，用于最優(yōu)條件的選擇，其他所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（SD）表示。數(shù)據(jù)采用一般線性模型和單因素方差分析，組間差異采用Duncan’s multiple range檢驗，采用SPSS軟件。每個試驗至少重復3次。差異顯著，P＜0.05，差異極顯著，P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 HPLC法測定種植楚雄葛根全粉中葛根素含量結果與分析

不同標準品濃度測得葛根素標準曲線方程y=51.853x+114.48，相關系數(shù)R2=0.998 8，說明該標準曲線的線性相關性良好，可用于葛根素含量10～200 μg/mL的樣品測定，見圖1。根據(jù)色譜條件測定楚雄葛根全粉中葛根素峰面積，見圖2，計算出樣品中葛根素含量，如表1所示。

圖1 葛根素標準曲線的高效液相色譜圖

圖2 楚雄葛根全粉中葛根素含量的高效液相色譜圖

表1 楚雄葛根全粉中葛根素含量測定結果

經(jīng)過對楚雄姚安的葛根全粉中葛根素含量的測定，結果得出其葛根素含量為4.05 mg/g。

2.2 楚雄葛根中葛根素和黃酮水提工藝的優(yōu)化結果與討論

測得葛根素含量標準曲線方程y=0.033 5x+0.115 9，相關系數(shù)R2=0.995 2，說明該標準曲線的線性相關性良好，可用于葛根素含量10～100 μg/mL的樣品測定。蘆丁含量標準曲線方程為y=0.011 1x+0.003 3，相關系數(shù)R2=0.995 4，說明該標準曲線的線性相關性良好，可用于黃酮含量20～80 μg/mL的樣品測定。楚雄葛根水提物中葛根素和黃酮含量如表2所示。

表2 均勻試驗設計水提葛根中葛根素和黃酮測定結果（以干重計）

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中二次多項式逐步回歸分析法對在各試驗方案下所得含量進行分析，得到水提物葛根素和黃酮含量回歸方程：Y1=557.96+82.11X1+63.58X3-29.41X22-30.60X32+28.14X1X3+79.28X2X3；Y2=647.10-250.68X2-61.08X3+30.48X22-5.85X1X2+2.87X1X3+10.79X2X3。

Y1相關系數(shù)R=0.996 7，顯著水平P=0.019 4，Y2相關系數(shù)R=0.994，顯著水平P=0.035 6，說明2個回歸方程相關性較好。通過回歸方程分析，預測的葛根素水提的最優(yōu)工藝條件為提取時間135 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶50（g/mL），葛根素含量最高提取值為1 156.05 μg/g。預測的黃酮水提的最優(yōu)工藝條件為提取時間15 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶48（g/mL），黃酮含量最高提取值為5 221.02 μg/g。

綜合考慮，在時間135 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶50（g/mL）條件下，各進行3次平行試驗，水提物葛根素平均含量為809.42±11.32 μg/g，黃酮平均含量為3 848.08±23.43 μg/g。將葛根素和黃酮的平均值與最高含量預測值進行比較，即此條件下所得葛根素含量為預測值的70.00%，黃酮含量為預測值的73.70%。2個預測值誤差較大，但仍能接受。

2.3 楚雄葛根中葛根素和黃酮醇提工藝的優(yōu)化結果與討論

楚雄葛根醇提物中葛根素和黃酮含量如表3所示。

表3 均勻試驗設計醇提葛根中葛根素和黃酮測定結果（以干重計）

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中二次多項式逐步回歸分析法對在各試驗方案下所得含量進行分析，得醇提葛根素和黃酮含量回歸方程：Y1=-172.64+155.48X3+755.11X4-32.46X32-46.06X42-4.85X1X2+1.05X1X4-0.30X3X4；Y2=666.16-134.67X1-26.00X2-12.30X4+7.61X12+3.68X22+1.82X42-0.11X1X4

Y1相關系數(shù)R=1，顯著水平P=0.05，Y2相關系數(shù)R=1，顯著水平P=0.002 9，說明2個回歸方程相關性較好。通過回歸方程分析可知，在此方案下醇提葛根素的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)90%、提取時間15 min、溫度33.5 ℃、料液比1∶48（g/mL）。醇提黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)60%、提取時間135 min、溫度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）。在此工藝條件下，預測的葛根素含量和黃酮含量最高提取值分別為638.67和3 136.78 μg/g?？蓪Υ嗽囼灧桨赶滤米罴阎笜说脑囼灧桨高M行驗證。

綜合考慮，在乙醇體積分數(shù)60%、提取時間135 min、溫度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）條件下，分別進行3組平行試驗，葛根素含量為590.21±21.44 μg/g，黃酮含量為3 089.72±45.36 μg/g。分別將葛根素和黃酮的平均值與最高含量預測值進行比較，即此條件下所得葛根中葛根素含量為預測值的92.41%，黃酮含量為預測值的98.50%。在誤差允許的范圍內驗證成功。

在水提法和醇提法2種最優(yōu)工藝條件下，水提物葛根素平均含量為809.42±11.32 μg/g，黃酮平均含量為3 849.08±23.43 μg/g，醇提物葛根素平均含量為590.21±21.44 μg/g，黃酮平均含量為3 089.72±45.36 μg/g。結果表明在最佳工藝條件下水提所得到的葛根素和黃酮含量都略高，但是差異不顯著。

2.4 PAE及PEE對RAW264.7細胞的增殖作用影響

由圖3（A）可知，與NG組比較，LPS組，100，200和400 μg/mL PAE對RAW264.7細胞的促進作用具有顯著性差異，提示PAE對RAW264.7細胞的增殖均有一定促進作用。由圖3（B）可知，與空白組比較，LPS組，200，400和800 μg/mL葛根水提物對RAW264.7細胞的促進作用具有顯著性差異，PEE對RAW264.7細胞的增殖均有一定促進作用。同時，隨著濃度的增加，PAE和PEE對細胞的增殖作用都呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，但是兩者增殖作用的差別不顯著。PAE最佳濃度為200 μg/mL，PEE最佳濃度為400 μg/mL。

圖3 PAE（A）和PEE（B）對巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

2.5 PAE和PEE對RAW264.7細胞中性紅吞噬作用影響

由圖4可知，與NG組比較，陽性組能極顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力，PAE濃度50和200 μg/mL，PEE濃度200 μg/mL時能極顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力，且隨著濃度的增加，對RAW264.7細胞吞噬能力的作用呈先上升后下降趨勢。低濃度時，PAE大于PEE；高濃度時，PAE小于PEE，但兩者吞噬作用的差別不顯著。結果表明PAE及PEE均能有效激活RAW264.7細胞發(fā)揮吞噬作用，而且兩者的差異不顯著。

圖4 PAE和PEE對巨噬細胞RAW264.7吞噬作用的影響（平均值）

3 結論

由試驗結果可知，水提法在最優(yōu)提取工藝下所得葛根素和黃酮含量都略高。由此可見，不同提取方法下的葛根素得率存在一定差異，因此，實際生產過程中應確定最佳提取方法，才能提高生產效率，避免原料、人工、資金等的浪費。通過PAE和PEE刺激RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)兩者在促進RAW264.7細胞的增殖和吞噬能力方面不存在顯著差異，但試驗并未進一步研究葛根提取物提高免疫的機制，后續(xù)試驗可將細胞因子及相關通路中蛋白的表達作為檢測指標，深入探索葛根提取物通過調控具體通路及通路蛋白發(fā)揮免疫作用的機理。綜上，實際生產中可用PAE作為原料，開發(fā)具有免疫調節(jié)功能的食品，以滿足市場需求，為功能食品工藝研究、質量控制標準的制定和開發(fā)其免疫相關功能食品奠定理論基礎。