田艾迪，劉瑛，陳葉平，史海粟，岳喜慶，武俊瑞，洛雪

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院 沈陽 110866）

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是由成簇的，具有規(guī)律間隔的短回文重復序列以及多種CRISPR 相關(guān)基因構(gòu)成的一種細菌的免疫系統(tǒng)。約40%細菌和90%古細菌中都存在CRISPR/Cas 系統(tǒng)[1]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)包含重復間隔單元和多種Cas 基因，細胞通過識別Cas 基因編碼的蛋白進行免疫反應，對進入細胞的外源DNA 進行切割來保護自身[2]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù)Cas 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分為三大類型，包含10 個亞型，6 個Ⅰ型，2 個Ⅱ型和2 個Ⅲ型。其中，I 型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)需要多種CRISPR 相關(guān)蛋白（Cas 蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ型系統(tǒng)只需要一種Cas 蛋白即可，因此Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)應用最為廣泛[3-4]。

2013 年2 月，洛杉磯學者們首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 系統(tǒng)[5]。此后，因CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有操作簡便，適用范圍廣，時間短，單個基因的編輯效率高等優(yōu)勢，近年在不同物種中得以發(fā)展應用[6]。目前研究人員己成功利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對斑馬魚[7-8]、大鼠[9]、山羊[10]、大豆[11]、水稻[12]、煙草[13]、芽孢桿菌[14]、酵母菌[3]、大腸桿菌[15]、乳酸菌[16]、擬南芥[17]等物種進行基因敲除。研究人員在CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基礎上研發(fā)了CRISPR Interference 系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能夠僅在mRNA 的層面上進行基因調(diào)控，目前細菌CRISPRi 系統(tǒng)已發(fā)展較為成熟[18]。本文主要綜述CRISPR/Cas9 系統(tǒng)及CRISPRi 系統(tǒng)近年來在芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等生物的應用。

1 II 型CRISPR 系統(tǒng)的原理

Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)包括CRISPR/Cas9 系統(tǒng)、CRISPRi 系統(tǒng)和CRISPRa系統(tǒng)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的工作原理如圖1 所示。

圖1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)原理Fig.1 Principle of the CRISPR/Cas9 system

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracr RNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶Cas9 蛋白在PAM 序列位點處與其結(jié)合，形成RNA-DNA 復合物，進而對DNA 雙鏈進行切割形成雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）[19-20]。隨后激活細胞內(nèi)的免疫反應，對相應基因進行切割，進而達到使靶向基因失活的目的[21]。目前該系統(tǒng)主要是通過人工設計這兩種RNA，形成具有引導作用的sgRNA（single guide RNA），引導Cas9 蛋白對DNA 進行定點切割，從而引起細胞內(nèi)DNA 修復機制的啟動[22-23]。

當使用Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)時，對于基因組中產(chǎn)生的DSB，細菌自身會通過兩種途徑進行修復，一種是非同源末端鏈接（non-homologous end joining，NHEJ）途徑，一種是基于同源DNA 片段的同源重組（homology-directed repair，HDR）途徑[24]。

NHEJ 途徑可以通過以現(xiàn)有的堿基為原料進行雙鏈兩端的修復，可能會對核苷酸產(chǎn)生改變。HDR 途徑利用斷裂位點兩端的同源片段為模板，進行修復，原理如圖2 所示。

圖2 基因修復原理Fig.2 Principle of gene repair

這兩種修復模式擴大了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的適用范圍，使得CRISPR/Cas 系統(tǒng)既可以利用NHEJ 途徑對基因進行定向失活，也可以利用HDR 途徑敲入新基因或者定向替換[25-26]。CRISPRi的原理如圖3 所示，首先使Cas9 蛋白的氨基酸序列發(fā)生（D10A/H840A）突變，使HNH 和RuvC 兩個核酸內(nèi)切酶活性位點失活，得到催化失活的Cas9（dCas9）蛋白，該蛋白雖不能切割雙鏈DNA，但可與DNA 雙鏈結(jié)合。在gRNA 介導下，dCas9 蛋白與位點結(jié)合后，能夠阻礙RNA 聚合酶的通過，有效地抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄[27]。

圖3 CRISPRi 系統(tǒng)原理Fig.3 Principle of the CRISPRi system

2 II 型CRISPR 系統(tǒng)在大腸桿菌中的應用

大腸桿菌是一種常見的革蘭氏陰性菌模式微生物，因具有遺傳背景清晰，代謝途徑大多已探明，生長速度快，容易進行大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點，而通常被選作研究基因的載體。早在2011 年，Rimantas 等[28]就發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 系統(tǒng)可能起到移動基因盒的作用，可以克服遙遠物種之間的障礙。于是，研究人員根據(jù)大腸桿菌的這些特點與CRISPR 系統(tǒng)相結(jié)合，進行一些探索。

2.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在大腸桿菌中的應用

大腸桿菌是一種在自然界分布廣泛的條件性致病菌，在正常情況下不具有致病性，是人和動物正常的腸道菌群，常作為模式菌種在工業(yè)生產(chǎn)中使用。研究人員為了提高大腸桿菌在工業(yè)上的利用率，利用CRISPR 系統(tǒng)對大腸桿菌進行相應的改造。Tan 等[29]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，通過對TE10 表達、培養(yǎng)基pH 值和C/N 比等條件進行優(yōu)化，提高了Fab 基因的表達，調(diào)節(jié)大腸桿菌中的相關(guān)代謝網(wǎng)絡，最終菌株的生物辛酸產(chǎn)量與野生型相比提高了82%，且能在最低限度的培養(yǎng)基中生產(chǎn)辛酸。王欽[30]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對大腸桿菌進行單基因乃至多基因的敲除，確定對L-酪氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率提高最有效的改造策略，最終得到的菌株L-酪氨酸產(chǎn)量較原始菌株提高了87.2%。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有良好的兼容性，能與其它技術(shù)共同使用，對大腸桿菌進一步改良。王茹[31]將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與常壓室溫等離子體誘變技術(shù)相結(jié)合，敲除了cdd 基因和poxB 基因，阻斷大腸桿菌的胞苷降解途徑，減弱乙酸合成途徑，達到改造胞苷代謝網(wǎng)絡的目的，得到的最終菌株葡萄糖的消耗速率是原始菌株的82.78%和88.3%，胞苷濃度是原始菌株的1.10 倍和1.25 倍，糖苷轉(zhuǎn)化率提高了30.95%和41.18%，最終有效提高大腸桿菌的胞苷產(chǎn)量。然而，由于大腸桿菌中直接應用CRISPR 系統(tǒng)時存在轉(zhuǎn)化效率低、質(zhì)粒不穩(wěn)定等問題，于是研究人員又對大腸桿菌進行二次改造，得到轉(zhuǎn)化效率更高，更適宜工業(yè)生產(chǎn)的菌株，如Wang 等[32]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對大腸桿菌MG1655 基因組的一系列位點進行遺傳修飾，使MCRA、endA 和recA 基因失活，最終轉(zhuǎn)化效率提高168 倍，獲得1 株具有較高轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒穩(wěn)定性的健壯、通用的宿主菌株JW128，該菌株在引入相應的合成途徑后，生產(chǎn)所需化學物質(zhì)。

研究人員發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中存在部分血清型大腸桿菌，具有致病性且多發(fā)現(xiàn)于被污染的食物中，根據(jù)臨床特點、發(fā)病機制以及流行病學等特征分為腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌等5 種類型[33]。當人類感染這些致病性大腸桿菌后，易引起腹瀉，嚴重者甚至會危及生命[34]。研究人員目前的研究重點是探索如何降低毒素型大腸桿菌的毒力。檀克勤等[35]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和λ-RED 級聯(lián)的敲除技術(shù)共同構(gòu)建缺陷菌株，探討ETEC K88 基因在產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中發(fā)揮的作用。富國文等[36]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對大腸埃希氏菌的Irp2 基因進行敲除，發(fā)現(xiàn)菌株的致病力有所降低，其作用機制尚未明確。

綜上所述，研究人員對于非致病性大腸桿菌的研究通常是利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除或修飾對相應的基因，改變代謝通路，提高相關(guān)產(chǎn)物的合成能力，得到更多的代謝產(chǎn)物。在致病性大腸桿菌的研究中，通過對致病基因進行敲除，或?qū)χ虏』虍a(chǎn)物參與的通路進行阻斷，最終降低大腸桿菌的毒力。

2.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在大腸桿菌中的其它應用

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，CRISPR/Cas9的核糖核蛋白（RNP）復合物是一種具有多種生物醫(yī)學應用前景的生物工具。目前仍面臨產(chǎn)率低，核酸酶活性時間短等問題。針對這些問題，研究者對Cas9蛋白的生產(chǎn)方法進行了優(yōu)化。Qiao 等[37]提出一種簡化的方法，通過共表達Cas9 和靶向特異性的單引導RNA，從大腸桿菌中直接生產(chǎn)Cas9 RNPs。利用CL7/Im7 純化技術(shù)，實現(xiàn)了包括常用的Cas9和Cas12a 在內(nèi)的自組裝CRISPR/Cas RNPs 的一步純化，產(chǎn)率比現(xiàn)有方法提高約4 倍。由此建立了一個成本低、耗時短的生產(chǎn)CRISPR/Cas RNP 的平臺，提高了Cas 蛋白的產(chǎn)率。面對核酸酶活性時間短的問題，研究者一直在努力實現(xiàn)對Cas9 核酸酶活性的時間控制，進而解決這個問題。Iwasaki等[38]開發(fā)了一種連接物，將茶堿和3 甲基黃嘌呤（3MX）結(jié)合的適體與sgRNA 結(jié)合，使大腸桿菌能夠進行小分子依賴性編輯。這些可激活的引導RNA 能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)基因編輯的時間和轉(zhuǎn)錄后控制。此外，它們還減少了基因組切割引起的宿主細胞死亡，解除了CRISPR 介導的細菌重組工程的限制，使大腸桿菌的應用更為廣泛。

近年來因抗生素的濫用，故大腸桿菌的耐藥性問題逐漸引起人們的關(guān)注。有研究表明CRISPR-Cas 系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)移有關(guān)，能幫助細菌適應外部環(huán)境。目前二者的關(guān)系尚未明確，于是一些研究人員通過CRISPR-Cas9 系統(tǒng)來探究與耐藥性相關(guān)的基因。李琳等[39]和趙霞[40]通過CRISPR 系統(tǒng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)雞源大腸桿菌中廣泛存在CRISPR 系統(tǒng)且大腸桿菌的CRISPR 還與多重耐藥表型相關(guān)。然而，多重耐藥株Cas 蛋白表達差異不顯著，提示Cas 蛋白的表達可能與大腸桿菌耐藥性不相關(guān)，相關(guān)部分有待探究。

研究人員根據(jù)CRISPR 系統(tǒng)與細菌之間的關(guān)系，探究其能否消除耐藥性，這是利用CRISPR 系統(tǒng)能夠特異性識別靶基因并將其切割消除的能力。利用噬菌體將CRISPR 系統(tǒng)相關(guān)基因注入細菌內(nèi)，通過CRISPR 系統(tǒng)切割靶質(zhì)粒，導致質(zhì)粒丟失，使得細菌恢復對藥物的敏感性[41]。李培思等[24]利用這個方法建立了一種單質(zhì)粒介導靶向mcr-1基因的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠特異性消除黏菌素耐藥大腸桿菌中的mcr-1 基因，恢復對黏菌素的敏感性。Otoupal 等[42]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)了一種被稱為有機體適應受控障礙的方法，系統(tǒng)地干擾基因在大腸桿菌中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負上位性多肽核酸干擾增加了臨床分離的碳青霉烯耐藥大腸桿菌的抗生素敏感性。提示一種新的治療策略，以限制抗生素耐藥性的演變。這些方法證明CRISPR 系統(tǒng)能夠解決大腸桿菌耐藥性的問題，為后續(xù)研究提供了新思路。

2.3 CRISPRi 系統(tǒng)在大腸桿菌中的應用

CRISPRi 系統(tǒng)能抑制指定目標的編碼或非編碼的DNA 片段的轉(zhuǎn)錄。它是利用催化失活的Cas9（dCas9）能夠到達引導RNA 指定的位點，而不能剪切DNA，當dCas9 結(jié)合到基因組時阻斷轉(zhuǎn)錄機器的結(jié)合，阻止反應的進行。于是，研究人員利用CRISPRi 系統(tǒng)對大腸桿菌的代謝通路進行改造，以期提升相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。Liu 等[43]以大腸桿菌W3110 為目標菌生產(chǎn)L-高絲氨酸，通過敲除META（編碼高絲氨酸O-琥珀?；D(zhuǎn)移酶）和ThrB（編碼高絲氨酸激酶），加強運輸以及刪除ICLR（編碼異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)因子）等來重定向碳流，提高了L-高絲氨酸的產(chǎn)量，最高效價達37.57 g/L，合理整合了葡萄糖吸收和L-谷氨酸的回收。達到提升產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。

CRISPRi 系統(tǒng)也用于改造工業(yè)菌株，提高產(chǎn)量等方面。4-羥基苯乙酸（4HPAA）是合成藥物、農(nóng)藥和生物化工的一種重要原料，NADPH 和ATP等輔因子在4HPAA 生物合成中起重要作用。為了提高4HPAA 的產(chǎn)量，Shen 等[44]開發(fā)了一種新的基于CRISPRi 系統(tǒng)的工程策略（CECRiS）。該策略使大腸桿菌中消耗NADPH 和ATP 的所有酶編碼基因被抑制。其中，NADPH 消耗酶編碼基因yahk和ATP 消耗酶編碼基因fees 的缺失，使4HPAA的產(chǎn)量從6.32 g/L 增到7.76 g/L；又利用EsaPESAS 群體感應抑制系統(tǒng)自動下調(diào)PABA 基因的表達，進一步提高4HPAA 的產(chǎn)量，最終得到的菌株在2 L 生物反應器中，經(jīng)補料分批發(fā)酵，4HPAA 產(chǎn)量為28.57 g/L，產(chǎn)率為27.64%。效價和得率能達到目前的最高值。

CRISPRi 系統(tǒng)作為一種新興工具，可用其對菌株進行聯(lián)合篩查。Stefano 等[45]利用CRISPRi 系統(tǒng)對7 177 個菌株進行聯(lián)合篩查，發(fā)現(xiàn)新陳代謝可緩沖健康缺陷，并闡明3 種基因特異性的緩沖機制，即：鳥氨酸通過增加CarAB 的活性來緩沖對CarAB 的抑制，S-腺苷蛋氨酸通過降低蛋氨酸途徑的表達來緩沖同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶（MEE）的抑制，6-磷酸葡萄糖酸通過抑制6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的表達來緩沖對6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶）的抑制。CRISPRi 篩查可以揭示代謝穩(wěn)健性的全球來源，識別緩沖特定酶減少的局部調(diào)節(jié)機制。綜上，CRISPRi 系統(tǒng)作為新興技術(shù)，在大腸桿菌中的應用較為深入，然而，與發(fā)現(xiàn)較早的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比，仍有較大的發(fā)展空間。

3 II 型CRISPR 系統(tǒng)在乳酸菌中的應用

3.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在乳酸菌中的應用

乳酸菌是一類與人類身體健康密切相連的微生物，廣泛存在于人體腸道。然而，乳酸菌中CRISPR 系統(tǒng)的應用并不多，原因是乳酸菌作為革蘭氏陽性菌，細胞壁較厚，遺傳轉(zhuǎn)化困難，目前發(fā)現(xiàn)的可用抗生素和載體較少，轉(zhuǎn)化效率較低，因此CRISPR 系統(tǒng)在乳酸菌中的應用受到限制。目前大部分針對乳酸菌中的基因編輯的研究停留在初級階段。祁敏[16]建立了用于植物乳桿菌WCFS1 的CRISPR -Cas9 系統(tǒng)，優(yōu)化了Cas 蛋白和質(zhì)粒，為乳酸菌的CRISPR 系統(tǒng)提供一些思路。Yang 等[46]對NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中的68 株干酪乳桿菌進行研究，發(fā)現(xiàn)所有的直接重復序列能形成很好的RNA 二級結(jié)構(gòu)，而且大量的CRISPR 間隔區(qū)與噬菌體和質(zhì)粒序列有很好的同源性。Jia 等[47]首次預測在黏液乳桿菌中有完整的EPS 操縱子，并發(fā)現(xiàn)了IIIA 型CRISPR-Cas 系統(tǒng)。Anderson 等[48]對加瑟氏菌的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)進行鑒定，發(fā)現(xiàn)它在無細胞裂解試驗中有適度的活性，表明了它們移植到真核生物中作為基因編輯工具的重要性。Brandt 等[49]使用模式菌株DSM 20052 作為該物種的典型代表來描述發(fā)酵乳桿菌的基因組特征，揭示9 個分支的遺傳多樣性，內(nèi)容可變，包括可移動的遺傳元件、CRISPR-CAS 免疫系統(tǒng)和基因組島以及大量的基因組重排。其在72%的基因組中發(fā)現(xiàn)I、II 和III 型CRISPR-Cas 系統(tǒng)高頻率出現(xiàn)，具有高度的菌株變異性。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在不同乳酸菌中的應用，大多停留在發(fā)現(xiàn)階段，并未得到很好的利用。

針對CRISPR/Cas9 在乳酸菌中的轉(zhuǎn)化效率低的問題，Ding 等[50]發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌Cas9 融合了高遷移率組蛋白HMGN1 和HMGB1、組蛋白H1 和染色質(zhì)調(diào)節(jié)肽（CMPS）3 類蛋白，可將化膿性鏈球菌Cas9 蛋白的活性提高數(shù)倍，在多個目標的情況下優(yōu)勢更為突出，如在12 個目標中甚至提高5 倍。進一步試驗發(fā)現(xiàn)CMP 融合策略也能有效提高其它Cas9 核酸酶的活性。這項研究為Cas9基因修飾提供了新的方法。

目前的CRISPR 系統(tǒng)直接在乳酸菌中應用的案例較少。Production 等[51]在植物乳桿菌WCFS1中建立了CRISPR/Cas9 輔助的雙鏈DNA（DsDNA）和單鏈DNA（SsDNA）重組工程，成功地在植物乳桿菌中敲除了NAGB 基因，進而消除6-磷酸果糖（F6P）與6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6P）的反向反應。在glmS1 基因中引入核糖開關(guān)替換和點突變來緩解反饋抑制，最終使得工程菌以葡萄糖為唯一碳源，生產(chǎn)797.3 mg/L 的GlcNAc。

乳酸菌不僅存在于自然界中，還存在于人體中。對于在人體中的乳酸菌來說，需克服噬菌體帶來的威脅，人們發(fā)現(xiàn)口腔中的加瑟氏乳桿菌為了克服噬菌體捕食帶來的影響而產(chǎn)生幾種防御系統(tǒng)，其中就包括CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。雖然乳酸菌中具有多種CRISPR 系統(tǒng)，但是MGES 偶爾可以逃脫CRISPR-CAS 系統(tǒng)的定位。于是，Stout 等[52]利用質(zhì)粒干擾試驗研究了CRISPR-CAS 的靶向和逃逸機制，這項研究將有助于更好地理解II 型CRISPR-CAS 系統(tǒng)偶爾失敗的原因，更好地實現(xiàn)CRISPR 系統(tǒng)在乳酸菌中的應用。

總體而言，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在乳酸菌中的使用仍處于起步階段，面臨許多問題。

3.2 CRISPRi 系統(tǒng)在乳酸菌中的應用

CRISPRi 系統(tǒng)作為新興技術(shù)，在乳酸菌中的應用并不多見，僅有少數(shù)研究作為參考。Myrbraten等[53]利用CRISPRi 系統(tǒng)敲除植物乳桿菌中的基因。在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，將dCas9 和sgRNA 分別在不同的質(zhì)粒上表達，發(fā)現(xiàn)可有效抑制任何目的基因的表達，了解了植物乳桿菌細胞周期關(guān)鍵基因的功能。Crawley 等[54]對1 262 個已公開的乳酸菌基因組進行采樣，發(fā)現(xiàn)它們富含CRISPR-Cas 適應性免疫。然而，II-A 型系統(tǒng)在其天然宿主中是自然活躍的，能夠表達并有效靶向侵襲性DNA 和基因組DNA。這些系統(tǒng)增加了Cas9 的靶向空間，并在本地宿主和異源基因組編輯目的中提供更多的可能，提高了CRISPR 系統(tǒng)在乳酸菌中使用的可能性。田開仁等[55]利用CRISPRi 系統(tǒng)，構(gòu)建用于基因篩選以及基因功能驗證的CRISPRi 系統(tǒng)，并驗證其在乳酸乳球菌F44 中的作用，發(fā)現(xiàn)當sgRNA在靶向nisA 基因編碼鏈中的D1 位置時，基因轉(zhuǎn)錄量僅為原始菌株的一半，表明乳酸乳球菌中CRISPRi 系統(tǒng)的成功構(gòu)建并能對細胞中的特定基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。同年，Berlec 等[56]在乳酸乳球菌中開發(fā)了一種新型質(zhì)粒，該質(zhì)粒使兩種重組蛋白在乳酸乳桿菌中共表達，并通過模型蛋白的表達來評估重組蛋白的有效性。

Kong 等[57]證明了CRISPRi 系統(tǒng)具有在濃度梯度中微調(diào)、增量基因調(diào)控的潛力。這項研究中，研究人員利用CRISPRi 系統(tǒng)開發(fā)一種新的微流控平臺，使細胞暴露在濃度梯度的代謝物中，加入瓊脂糖膜作為休眠底物，加上一個溫度控制的環(huán)境小室，可以在穩(wěn)定的生長或抑制條件下培養(yǎng)細胞超過10 h。這項研究證實當CRISPRi 系統(tǒng)與一些低成本的工程工具（如利用雙面膠帶、透明膜、瓊脂糖膜和蓋片制作的三維成像設備，）結(jié)合使用時，有助于發(fā)現(xiàn)新的抗生素敏感性的決定因素，具有在濃度梯度中微調(diào)、增量基因調(diào)控的潛力，并能夠評估抗生素在細菌培養(yǎng)中的長期有效性。這項研究為CRISPRi 系統(tǒng)開啟了一個新的應用方向。

綜上，CRISPRi 系統(tǒng)已被證實可應用于乳酸菌的基因編輯中，然而目前的應用較少。

4 II 型CRISPR 系統(tǒng)在芽孢桿菌中的應用

芽孢桿菌是一種生長快，發(fā)酵周期短且易于培養(yǎng)的菌種，與其它原核細菌相比，芽孢桿菌有較強的分泌表達能力，能有效避免細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累和不溶性包涵體的形成，而且芽孢桿菌的遺傳背景清晰，具有開發(fā)成細胞工廠的潛力。鑒于CRISPR 系統(tǒng)在基因工程領域中的作用，研究人員將其用于芽孢桿菌中[58]。Marcus 等[59]就利用Inscripta（CO）發(fā)布的一種的CRISPR 核酸酶MAD7在枯草芽孢桿菌中進行基因編輯，證實了基于CRISPR 的編輯模式可在枯草芽孢桿菌中應用。

4.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在芽孢桿菌中的應用

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為一種新型的基因敲除工具，在芽孢桿菌中的利用，能夠提高芽孢桿菌在逆境中的抗性，或者通過對其代謝通路中的相關(guān)基因進行工業(yè)化改良，使該菌更適用于工業(yè)生產(chǎn)。García 等[60]通過刪除在產(chǎn)孢過程中起重要作用的spoIIAC 基因，并利用雙質(zhì)粒策略，使新培育的枯草芽孢桿菌菌株從表達htp 蛋白快速轉(zhuǎn)變?yōu)樯a(chǎn)htp 蛋白，最終驗證了CRISPR 工具的有效性。檀瑞婷[61]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對枯草芽孢桿菌進行改良，將來源于嗜熱菌的伴侶蛋白基因插入宿主中，與伴侶蛋白Pfefoldinγ 和PPlase 的基因分別結(jié)合，得到的重組菌胞外酶活較初始酶活提升約7.94 倍和8.55 倍。再結(jié)合超高溫酶的相關(guān)特性進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終得到菌株的胞外酶活較初始酶活提高約71.08 倍，有效提升了α-淀粉酶的產(chǎn)量和抗性。李由然等[62]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對枯草芽孢桿菌進行改良，將來源于嗜熱菌的伴侶蛋白基因插入宿主中，與伴侶蛋白Pfefoldinγ 和PPlase 的基因分別結(jié)合，得到的重組菌胞外酶活較初始酶活提升約7.94 倍和8.55 倍。再結(jié)合超高溫酶的相關(guān)特性進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終菌株的胞外酶活較初始酶活提高約71.08 倍，有效提升了α-淀粉酶的產(chǎn)量和抗性。李由然等[63]構(gòu)建了誘導型表達Cas9 蛋白的重組質(zhì)粒，成功實現(xiàn)了地衣芽孢桿菌淀粉酶編碼基因amy L 的敲除，為改造發(fā)酵地衣芽孢桿菌提供了新的方向。

隨著人們生活水平的提高，綠色食品的概念逐漸深入人心，生物農(nóng)藥成為一種常見的化學農(nóng)藥替代品。蘇云金芽孢桿菌為一種生物農(nóng)藥，在產(chǎn)生芽孢過程中產(chǎn)生一種殺蟲蛋白，當害蟲取食含有該細菌的食物時，該菌能夠在害蟲的腸道內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源毒素和外源毒素，最終達到殺蟲的效果。然而，隨著這款農(nóng)藥的使用，一些害蟲對其產(chǎn)生抗藥性，因此，研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對蘇云金芽孢桿菌進行改良，來消減這種抗藥性。Wang等[64]利用CRISPR/Cas9 介導的基因敲除來測試APNs 在Bt 毒素表達過程中的作用。Wang 等[65]也通過CRISPR/Cas9 方法成功獲得1 株ABCC2 缺失突變的純合菌株（OfC2-KO）。敲除菌株OfC2-KO 對Cry1Fa 的抗性超過300 倍，對Cry1Ab 和Cry1Ac 的抗性較低（＜10 倍），而對Cry1Aa 和兩種化學殺蟲劑（阿維菌素和氯氰異丙醇）的毒力沒有顯著影響。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)有利于提高蘇云金芽孢桿菌中殺蟲蛋白的應用，提高殺蟲效果。

4.2 CRISPRi 系統(tǒng)在芽孢桿菌中的應用

CRISPRi 系統(tǒng)作為一種新型的基因工具，在研究下調(diào)基因的方面有良好的效果，CRISPRi 系統(tǒng)應用于枯草芽孢桿菌中取得一定成果。早在2016 年，Zhao 等[66]就利用CRISPRi 系統(tǒng)證明脂質(zhì)循環(huán)中兩種UPP 磷酸酶的冗余。

2018 年Wu 等[67]開發(fā)了一個基于木糖誘導的CRISPRi 的枯草芽孢桿菌基因抑制系統(tǒng)，目的是下調(diào)3 個基因（zwf，pfkA，glmM）的表達，這3 個基因控制GlcNAc 合成的主要競爭反應[戊糖磷酸途徑（HMP）、糖酵解和肽聚糖合成途徑（PSP）]，實現(xiàn)葡萄糖和木糖的共同利用。通過CRISPRi 同時抑制這3 個基因，使GlcNAc 滴度提高了13.2%，達（17.4±0.47）g/L，其中葡萄糖和木糖的產(chǎn)量提高了84.1%，達（0.42±0.036）g/g。為進一步實現(xiàn)葡萄糖和木糖的協(xié)同利用，針對這3 個基因的不同sgRNA 陣列，建立一種組合方法。對發(fā)酵體系的時間控制進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)接種6 h 后添加15g/L 木糖，菌株BNX122 在搖瓶培養(yǎng)條件下可合成（20.5±0.85）g/L 的葡萄糖和木糖，產(chǎn)量為（0.46±0.010）g/g葡萄糖和木糖。這些發(fā)現(xiàn)表明，CRISPRi 激活的調(diào)控方法為促進微生物細胞工廠協(xié)同利用多種碳源提供了一種簡單、高效和通用的方法。

2019 年，Wang 等[68]利用CRISPRi 系統(tǒng)，通過抑制氨基酸合成分支代謝途徑上的基因，提高枯草芽孢桿菌表面活性物質(zhì)的產(chǎn)量，從氨基酸的分支代謝途徑中篩選出20 個基因進行單基因CRISPRi 抑制，在得到的重組菌株中，有16 株獲得較高的表面蛋白產(chǎn)量。其中yrpC、RACE 和MurC3 株菌株表現(xiàn)最為明顯，其表面蛋白產(chǎn)量分別提高到0.54，0.41g/L 和0.42g/L。之后，又對3 個基因進行多基因抑制，構(gòu)建了yrpC 和RACE、yrpC和MurC 或RACE 和MurC 的雙基因敲除菌株，使表面素產(chǎn)量分別增到0.75，0.57 g/L 和0.48 g/L，提高了產(chǎn)量。

CRISPRi 系統(tǒng)作為一種新型基因干擾技術(shù)，在芽孢桿菌中取得一定成果。

5 II 型CRISPR 系統(tǒng)在其它細菌中的應用

5.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在其它細菌中的應用

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)因具有效率高，操作簡便等特點，在微生物研究中得到廣泛應用。球菌、梭菌、弧菌等是自然界中常見的細菌種類，在工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛。研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對這些細菌進行改良，來適應社會生產(chǎn)的需要。Tan 等[69]在不影響靶標效率的情況下，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在具有高度特異性全基因組活性的人類細胞中設計一種基于測序（GUIDESEQ）方法和定向深度測序分析的雙鏈斷裂識別SaCas9 的工程變體，這極大地提高了全基因組靶向的準確性。陳相好等[70]成功在艱難梭菌中構(gòu)建了rsb V（編碼anti-anti-sigma 因子）、rsb W（編碼anti-sigma 因子）及sig B 基因（編碼sigma-B因子）的CRISPR-Cas9 敲除載體。張大煒等[71]應用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對艱難梭菌的主要毒力因子tcdB 基因進行切割，最終達到特異性抑制致病艱難梭菌生長的效果。劉永等[72]在紅色糖多孢菌基因組中應用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在工業(yè)菌株Ab（HP）中敲除eryBGC 基因，阻斷了紅霉素的生物合成，激活紅色糖多孢菌中原有的沉默生物合成基因簇，重構(gòu)次級代謝途徑，使紅霉素產(chǎn)量增加，最終構(gòu)建了有效的紅色糖多孢菌的CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)，提高了紅霉素的產(chǎn)量。尹暢等[73]以裂殖壺菌為研究對象，構(gòu)建了相應CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，對裂殖壺菌中與脂肪酸合成相關(guān)的基因進行敲除，并替換為Zeocin 抗性基因片段，說明Pks D 基因的敲除影響脂肪酸的合成。

綜上所述，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有適用范圍廣，操作簡單等優(yōu)勢，在很多細菌中都有廣泛應用。

5.2 CRISPRi 系統(tǒng)在其它細菌中的應用

CRISPRi 系統(tǒng)是由CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中發(fā)展而來，具有CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用范圍廣，操作簡單等優(yōu)點。Tan 等[74]建立了針對假單胞菌（Pseudomonas spp.）基因抑制的CRISPRi 系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)另外兩個PAM 位點NNGCGA 和NNGTAA，擴大了巴氏桿菌dCas9 的可能靶標數(shù)量。劉永等[72]在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用的基礎上用CRISPRi 系統(tǒng)干擾基因表達。利用定點突變的dCas9 構(gòu)建的CRISPRi 系統(tǒng)抑制靶基因的表達，結(jié)合溫度調(diào)控的抑制強度，使紅霉素產(chǎn)量增加。運動發(fā)酵單胞菌是一種很有前途的生物燃料生產(chǎn)菌種，它能高效將糖轉(zhuǎn)化為乙醇且，具有很高的酒精耐受性。Amy等[75]通過靶向在細菌中普遍保守的必需基因，來證明運動鏈球菌中CRISPRi 系統(tǒng)的有效性。最終確定運動發(fā)酵單胞菌與生長、糖發(fā)酵成乙醇和異丁醇抗性有關(guān)的基因特征。建立的Zmobilis CRISPRi 系統(tǒng)可直接定義基因功能，并可應用于改進菌種工程和提高生物燃料產(chǎn)量，為合理設計產(chǎn)量更高的生物燃料生產(chǎn)菌株開辟一條道路。

據(jù)目前研究現(xiàn)狀，基因的傳遞條件限制了CRISPRi 靶向基因表達的能力?，F(xiàn)有構(gòu)建的傳遞物太大，不適合一些病毒的包裝。研究人員對CRISPRi 組分進行優(yōu)化，生成一個包含所有功能元件的單一AAV 載體，并有效下調(diào)了內(nèi)源基因在體內(nèi)的表達。Jon 等[76]利用螺旋接頭和c-Myc 核定位信號，將失活的金黃色葡萄球菌Cas9（SadCas9）的核靶向性提高4 倍。之后，發(fā)現(xiàn)氨基末端Krüppel 關(guān)聯(lián)盒（KRAB）在體外有效降低靶基因的表達。最后，優(yōu)化了GUIDE RNA 的啟動子，并對KRAB-SadCas9 在肝細胞中表達的微型啟動子進行評價。構(gòu)建的重組質(zhì)粒在體外可使（PCSK9）mRNA 和分泌蛋白減少5 倍。相應的AAV2/8 載體定位于肝細胞核內(nèi)，體內(nèi)PCSK9mRNA 和血清蛋白水平降低30%。

在最近的研究中，研究人員開始研究抗CRISPR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)對水平基因的轉(zhuǎn)移起到一定的促進作用。研究的主要方向是ACRs，它是一種能抑制RNA 引導的CRISPR-Cas 酶的DNA 靶向活性的小蛋白。ACRs 由噬菌體和噬菌體衍生的細菌基因編碼，可以阻止CRISPR 介導的噬菌體感染抑制，也可阻止CRISPR-Cas 介導的真核細胞基因組編輯。Watters 等[77]為了鑒定能夠抑制金黃色葡萄球菌Cas9（SauCas9）的ACR，使用自靶CRISPR 篩選和內(nèi)疚關(guān)聯(lián)基因組搜索的策略。結(jié)果證實了一種新的發(fā)現(xiàn)ACR 的方法，并將AcrIIA13-AcrIIA15 確立為SauCas9 的獨特雙功能抑制劑。

利用CRISPRi 系統(tǒng)，能夠?qū)毦拇x通路做出一些調(diào)整，增加需求物質(zhì)產(chǎn)量，具有操作簡便，應用范圍廣的優(yōu)點。

6 CRISPR 系統(tǒng)在酵母菌中的應用

6.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在酵母菌中的應用

利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對于酵母的研究主要集中在兩個方面：1）從基礎代謝等方面與CRISPR系統(tǒng)相結(jié)合并進行改良。2）結(jié)合CRISPR 系統(tǒng)對現(xiàn)有菌種進行改良，提高相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)量。

酵母菌作為一種常用的真菌型模式微生物，具有完整的細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，對于一些體內(nèi)物質(zhì)合成（如萜類物質(zhì)等）具有明顯優(yōu)勢，常用來作為底盤宿主。其中，釀酒酵母是在工業(yè)中運用廣泛的菌種。路曼等[78]利用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在釀酒酵母中抑制了IDH2 和PGII 兩個基因，提高了脂肪酸通路中乙酰輔酶A 以及NADPH 的供應量，得到的最佳工程菌的脂肪酸產(chǎn)率相較于原始菌株提高了22%。利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在刪除了合成磷脂酶途徑、磷脂走向三?；视屯緩?、脂肪酸分解代謝的β 氧化途徑和促進甾醇合成途徑中的關(guān)鍵酶基因后，使碳流向脂肪酸的合成和積累路徑發(fā)生改變，從而增加了脂肪酸的產(chǎn)量。酵母菌具有完整的細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，有利于對酵母細胞中的基因功能進行判斷，也同樣適合代謝通路的研究。陸海燕等[79]利用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)對安琪酵母工業(yè)菌株衍生菌株K-a 進行基因修飾，失活靶向基因，得到的目的菌株比例高達74.4%。初步建立了適于利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進行基因修飾的工業(yè)菌株宿主平臺和相應的基因修飾的操作系統(tǒng)流程。贠小蕓[80]用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對釀酒酵母WAT11 內(nèi)源MVA 途徑的萜類通路相關(guān)基因tHMGR1、ERG20、ERG9、BTS1 進行調(diào)控，利用角鯊烯作為標志物，引入腸沙門氏菌乙酰輔酶A 合成酶基因SeACSL641P、大腸桿菌IDI1 基因、枯草芽孢桿菌IDI2 基因，進而觀察釀酒酵母細胞內(nèi)的萜類化合物代謝流向，找出最優(yōu)菌株，成功構(gòu)建高效合成α-香樹脂醇（α-amyrin）的酵母工程菌，為α-香樹脂醇以及其衍生物的生物合成奠定基礎，也為后期CYPs、UTGs 的功能鑒定搭建了平臺。謝文娟等[81]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，通過改造代謝工程，減少黃酒發(fā)酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的形成，提高了其構(gòu)造的釀酒酵母工業(yè)化應用的可能性。這些研究都是利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對相關(guān)基因進行敲除，進而影響酵母菌的代謝通路來對酵母進行改良。酵母菌作為一種工業(yè)用模式菌株，當人們對新產(chǎn)品產(chǎn)生需求時，采用CRISPR 系統(tǒng)對酵母菌株進行改造，得到新型的酵母菌株。李夢琦等[82]在Lager 型啤酒酵母中構(gòu)建CRISPR-Cas9 基因敲除系統(tǒng)。Zool 等[83]從油棕櫚堆肥中分離到1 株能利用長鏈脂肪酸為唯一碳源的脂肪分解酵母Candida aaseri SH14。之后，利用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建一個遺傳操作系統(tǒng)，開發(fā)該菌株作為以可再生植物油為原料生產(chǎn)生物基化學品的平臺酵母。利用CRISPR-CAS9 系統(tǒng)，效率達到60%，最終證明這一基因組工程工具可以加速紅曲霉SH14 的工業(yè)化應用。陳紅[84]利用CRISPR 系統(tǒng)敲除了己糖激酶同工酶2，降低了釀酒酵母對果糖的代謝，成功實現(xiàn)以釀酒酵母為宿主，以果糖為底物，高附加值D-阿洛糖的生產(chǎn)。劉磊等[85]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除了釀酒酵母甘油-3-磷酸脫氫酶基因（gpd2），甘油和2，3-丁二醇產(chǎn)量下降，乙醇產(chǎn)量提高。為進一步探究釀酒酵母其它代謝產(chǎn)物與2，3-丁二醇合成之間的關(guān)系具有借鑒意義?；趯γ篮铆h(huán)境的需求，人們倡導綠色能源，生物燃油成為人們的研究熱點。研究人員利用酵母和CRISPR系統(tǒng)的結(jié)合，對生物燃油進行了研究。黃河浪等[86]利用CRISPR 系統(tǒng)在釀酒酵母中導入植物乳桿菌的阿拉伯糖代謝途徑，構(gòu)建1 株能有效利用阿拉伯糖并能將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的重組釀酒酵母菌株KAX3-2，為以秸稈等木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為原料生產(chǎn)液體生物燃料——乙醇的研究提供了一些參考。如Li 等[87]利用CRISPR 系統(tǒng)和耐壓酵母創(chuàng)建一個帶有重構(gòu)莽草酸途徑的菌株文庫，用于生物合成2-PE。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對單個基因的敲除十分方便、快捷，然而，同時對多個基因進行靶向敲除，步驟繁瑣，效率降低。研究人員對系統(tǒng)進行了改進，如汪娟[88]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建新的gRNA-tRNA 陣列CRISPR 系統(tǒng)（gRNAtRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9），簡稱GTR-CRISPR，該系統(tǒng)可快速實現(xiàn)釀酒酵母對1 對多靶點基因的敲除。Zhang 等[89]利用gRNA，使GTR-CRISPR 以87%的效率同時破壞8 個基因。其還研究一種Lightning GTR-CRISPR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)刪除了在大腸桿菌中克隆的步驟。此方法將GTR-CRISPR 系統(tǒng)用于簡化酵母脂質(zhì)網(wǎng)絡，10 d 內(nèi)使游離脂肪酸的產(chǎn)量增加30 倍。

gRNA 的高效表達對CRISPR 系統(tǒng)的應用具有重要意義。這種改良的CRISPR 系統(tǒng)能夠提高多基因編輯的效率，大大縮短了操作時間，降低操作難度。Larroude 等[90]構(gòu)建6 個CRISPR/Cas9 載體，創(chuàng)建一套通用的、模塊化的CRISPR/Cas9 載體，可快速編輯任何溶脂耶爾森氏菌菌株；該工具有助于對任何有研究意義的原生菌野生型菌株進行試驗，加快了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的速率。

6.2 CRISPRi 系統(tǒng)在酵母菌中的應用

CRISPRi 作為以CRISPR/Cas9 為基礎的基因組編輯系統(tǒng)，極大地促進了工業(yè)酵母菌株的基因工程。Elena 等[91]報道了一個多倍體工業(yè)酵母菌株CRISPR 激活和干擾工具箱（CRISPRa/I）的構(gòu)建。在高拷貝和低拷貝變體中獲得的CRISPRa/i 質(zhì)粒中，dCas9 單獨表達，或與激活或抑制結(jié)構(gòu)域VP64、VPR 或Mxi1 融合表達。通過體內(nèi)同源定向修復將sgRNA 從雙鏈寡核苷酸導入CRISPRa/I質(zhì)粒，無需克隆就可以快速轉(zhuǎn)錄調(diào)控新的靶基因。CRISPRa/I 工具箱的特征是熒光蛋白編碼基因在兩個不同啟動子的作用下表達發(fā)生改變，使表達改變達到原來的2.5 倍。CRISPRa/i 工具包利用新型的基因干擾系統(tǒng)對酵母菌的改良是研究熱點。CRISPRi 系統(tǒng)可廣泛用于評估菌株改良的程度，進而加快對新的工業(yè)用菌株的開發(fā)與使用。

7 結(jié)語

II 型CRISPR 系統(tǒng)作為目前應用最廣泛、最頻繁的基因編輯技術(shù)，相較于之前使用的，如鋅指核酸酶系統(tǒng)、ZEN 系統(tǒng)等，具有編輯效率高，操作簡單等優(yōu)勢。未來CRISPR 系統(tǒng)仍是熱門的基因編輯系統(tǒng)，在乳酸菌、芽孢桿菌等模式生物中有很大的操作空間。

目前CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通常用于對一些不明基因進行功能鑒定，通過對代謝通路上的相關(guān)基因進行敲除或替換來增加產(chǎn)品產(chǎn)量，或減少毒性，或通過敲入新基因使原有的宿主產(chǎn)生新的功能或特質(zhì)，進而成功應用于工業(yè)生產(chǎn)。

CRISPRi 系統(tǒng)作為新興的基因干擾系統(tǒng)，相較于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，更適用于分析耐藥性，研究長鏈非編碼RNA 等方面。與傳統(tǒng)的RNAi 系統(tǒng)相比具有脫靶風險低，干擾效率高等優(yōu)點，缺點是操作復雜，目前應用范圍較窄。