劉陽，臧文靜，梁瀟，王岳，李鮮，孫崇德

（浙江大學(xué)果實品質(zhì)生物學(xué)實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控重點開放實驗室/園藝產(chǎn)品冷鏈物流工藝與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室/園藝植物整合生物學(xué)研究與應(yīng)用浙江省重點實驗室 杭州 310058）

柑橘是世界大宗水果，具有重要的國民經(jīng)濟價值。我國幅員遼闊，有適宜柑橘栽培的多種氣候和土地類型，為多種柑橘資源的積聚提供了良好條件。目前我國柑橘種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，種植面積在2019 年達2 617 000 hm2，產(chǎn)量為4 584.54 萬t[1]。

我國浙-閩-粵柑橘帶作為傳統(tǒng)柑橘產(chǎn)區(qū)，主要種植寬皮橘、柚、雜柑；長江中、上游柑橘帶，即湖北、四川、重慶地區(qū)主要種植甜橙；贛南-湘南-桂北柑橘帶主要種植甜橙及寬皮橘；鄂西-湘西柑橘帶主要種植溫州蜜柑和椪柑[2]。我國柑橘栽培品種豐富，利用價值多樣，為食品和保健領(lǐng)域更高效、更全面利用柑橘資源提供了優(yōu)勢。

柑橘果實富含多種藥用價值的生物活性物質(zhì)，包括類黃酮、酚酸、萜類化合物、類胡蘿卜素、生物堿、精油、果膠、膳食纖維以及VC 等[3]。隨著這些功能組分的生物活性和藥理作用機制的明晰，對柑橘生物活性物質(zhì)的研究受到重視，其中類黃酮作為重要的一類活性物質(zhì)，在不同種類柑橘果實中的研究中均有涉及[4]。類黃酮是指一類具有2-苯基色原酮（C6-C3-C6）為基本骨架的天然酚類化合物（圖1），其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、甲基、甲氧基等取代基團。目前柑橘屬中發(fā)現(xiàn)的類黃酮多以苷的形式存在，主要為黃烷酮、黃酮和黃酮醇[5]。其中，含有4 個及以上甲氧基取代基的類黃酮稱為多甲氧基黃酮（Polymethoxyflavonoids，PMFs），主要分布在柑橘果皮油胞層中[6]，因其富含較多的甲氧基團，親脂性較高，故與一般黃酮相比具有更高的生物利用度，也具有更強的生物活性[7]。

圖1 類黃酮基本結(jié)構(gòu)Fig.1 General structure of flavonoids

類黃酮含量與類型在不同柑橘品種中的差異被大量研究所證實，例如，柚類中主要的類黃酮為柚皮苷、柚皮蕓香苷、圣草枸櫞苷、新橙皮苷和柚皮素[8]。檸檬中橙皮苷與圣草次苷含量較高[9]。寬皮橘果皮中PMFs 含量較高[10]。對我國特有的13 種柑橘屬植物果實進行類黃酮含量分析發(fā)現(xiàn)，在柚類、橙類、寬皮橘類中，柚類果實的柚皮苷含量最高，寬皮橘類和橙類的橙皮苷含量最高[11]。柑橘果實不同組織部位中類黃酮的種類和含量也有較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，將“甌柑”和“胡柚”果實分為油胞層、白皮層、囊衣和汁胞4 個部分，測定類黃酮種類和含量，結(jié)果油胞層中富含PMFs，而白皮層中黃烷酮含量較高[4]。

現(xiàn)代流行病學(xué)研究表明，柑橘果實中豐富的類黃酮具有抗氧化[12]、抗腫瘤[13]、降血脂[14]和抗炎癥[15]等作用。機體的氧化現(xiàn)象主要是因為存在自由基，自由基具有強氧化能力，在機體內(nèi)與功能重要的生物大分子反應(yīng)，使之喪失活性，逐漸引起細胞、機體功能障礙，對機體造成損傷、病變。而類黃酮自身結(jié)構(gòu)賦予獨特的理化性質(zhì)，具有良好的抗氧化活性。類黃酮結(jié)構(gòu)中的羥基不僅具有較強的自由基清除能力[16]，還與金屬離子螯合，減少自由基的產(chǎn)生，達到抗氧化效果[17]。類黃酮也可通過抑制氧化酶活性和促進抗氧化酶活性來抵抗機體氧化損傷[18]。有關(guān)柑橘類黃酮抗氧化活性已有很多研究報道，例如，“甌柑”和“胡柚”4 個部位粗提物均有一定的抗氧化活性，其中，油胞層具有最強的DPPH 自由基清除活性[4]。

目前，柑橘果實類黃酮的鑒定方法主要有色譜法、分子質(zhì)譜法、核磁共振法、紫外-可見光吸收光譜法等。在柑橘類黃酮鑒定方面，色譜法應(yīng)用較廣泛，紫外-可見吸收光譜法應(yīng)用相對較少。以往關(guān)于柑橘果實中類黃酮的研究，特別是不同柑橘品種果實中類黃酮的種類、含量及相關(guān)活性評價等，大多利用HPLC 通過比對標準品對已知結(jié)構(gòu)類黃酮進行分析，而利用高分辨質(zhì)譜等技術(shù)鑒別不同種類柑橘果實中的類黃酮研究較少。

本文以23 個品種的柑橘為材料，比較柑橘果實的品質(zhì)。采用超高效液相色譜、高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用等多種技術(shù)，對柑橘果實油胞層中的類黃酮進行鑒定和抗氧化評價。從組分和活性角度挖掘柑橘組分和抗氧化活性信息，為其活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

試驗材料：23 個柑橘品種如圖2 所示，于2017—2018 年果實商業(yè)采收期采集，挑選大小、色澤均勻，無機械傷、無病蟲害的單果為試驗材料。取果實油胞部分，用液氮處理后冷凍干燥至恒重，干樣磨成粉末儲存于-40 ℃條件下，備用。

圖2 本試驗用不同品種柑橘果實Fig.2 Different citrus varieties used in the present study

試驗試劑：無水乙醇、甲醇、三氯甲烷、飽和碳酸鈉、氯化氫、氯化鐵、醋酸鈉、二硫酸鉀、氫氧化鉀、磷酸二氫納、磷酸氫二鈉均為分析純級試劑，上海國藥控股股份有限公司；Folin-Ciocalteu 試劑、沒食子酸（Gallic acid）、1-二苯基-2-2 三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、Trolox、ABTS、熒光素鈉、AAPH，美國Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈為色譜純級，Sigma-Aldrich 公司。

試驗設(shè)備與儀器：真空冷凍干燥機（FM 25EL -85），SP Scientific；超聲波清洗器（SK8200G），上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；渦旋振蕩器（Vortex-Genie2），美國Scientific Industeries；超速離心機（Eppendorf AG22331），德國；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Heidolph LABOROTA 4000-efficient，德國；固相萃取真空裝置，Agela technologies；SPE 固相萃取柱，美國Waters；真空離心濃縮儀（Eppendorf centrifuge 5810Rz），德國；96 孔板，美國Corning；電子天平（BSA224S-CW），賽多利科學(xué)儀器北京有限公司；臺式酶標儀，美國Biotek；一次性使用無菌注射器，江西洪達醫(yī)療器槭集團有限公司；一次性針頭式過濾器（孔徑0.22 μm），浙江同力信息科技有限公司；液相小瓶、LC-Q-TOF-MS/MS，美國Waters Corp.。

1.2 不同品種柑橘果實類黃酮抗氧化活性測定

1.2.1 類黃酮提取液的制備 稱取23 個品種柑橘油胞層凍干粉0.2 g，按料液比1∶20 加入80%乙醇，超聲輔助提取30 min（超聲頻率60 kHz，功率30 W），5 000 r/min 離心8 min，收集上清液。重復(fù)提取3 次，收集上清液用于后續(xù)總酚含量、抗氧化活性測定。設(shè)置3 個重復(fù)試驗。

1.2.2 總酚含量測定 總酚含量測定采用Ghafoor 等[19]的方法并適當修改。在已添加4 mL 雙蒸水的離心管中加入0.5 mL 稀釋適當倍數(shù)的提取液，混合均勻后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu（0.5 mol/L）試劑，靜置3 min，加入1 mL 7%碳酸鈉溶液，搖勻后在30 ℃水浴條件下靜置2 h。待反應(yīng)完全后，取200 μL 反應(yīng)液加入96 孔板，用酶標儀在A760nm處測定吸光值。以沒食子酸（Gallic acid）為標準品繪制標準曲線，計算各樣品總酚含量，單位mg Gallic acid equivalent（GAE）/g DW。設(shè)置3 次重復(fù)試驗。

1.2.3 抗氧化活性測定

1）DPPH法采用Zhang 等[20]的方法并適當改進。在無色96 孔板中加入2 μL 稀釋適當倍數(shù)的提取液，再加入200 μL 60 mmol/L DPPH 溶液混勻，室溫條件下避光反應(yīng)2 h，使用酶標儀測定A517nm處吸光值。

2）FRAP法采用Zhang 等[20]的方法并適當改進。FRAP 工作液的制備：10 mmol/L TPTZ 溶液（使用40 mmol/L HCl 溶解）、20 mmol/L FeCl3溶液、300 mmol/L 醋酸鈉緩沖液（冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至3.6）按照體積比1∶1∶10 混合，37 ℃孵育。在無色96 孔板中加入10 μL 稀釋適當倍數(shù)的提取液，再加入90 μL FRAP 工作液，混勻，室溫條件避光反應(yīng)5 min，使用酶標儀在A593nm處測定吸光值。

3）ABTS法采用Floegel 等[21]方法并適當改進。ABTS 工作液的制備：7 mmo/L ABTS 溶液與2.6 mmo/L K2S2O8按體積比1∶1 混合，在室溫條件下避光反應(yīng)12h 后稀釋28 倍。在無色96 孔板中加入10 μL 稀釋適當倍數(shù)的提取液，再加入200 μL ABTS 工作液，混勻，室溫條件放置5 min，使用酶標儀在A734nm處測定吸光值。

4）ORAC法采用Roy 等[22]的方法并適當改進。在黑色96 孔板中加入25 μL 稀釋適當倍數(shù)的提取液，接著加入150 μL 40 nmol/L 熒光素鈉溶液（磷酸緩沖液溶解），在37℃條件下靜置10 min，加入25 μL 150 mmol/L AAPH 溶液（磷酸緩沖液溶解），使用酶標儀在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長535 nm 處測定熒光強度，每2 min 記錄讀數(shù)，總測定時長為2 h。以25 μL 磷酸緩沖液為樣品替代液（陰性對照），以25 μL，0～1 mg/mL Trolox 為標準品（對照），初始熒光值讀數(shù)孔設(shè)定為不加AAPH 孔的讀數(shù)。第n 次讀數(shù)的相對熒光值計算公式：fn=第n 次熒光值（Fn）/初始熒光值（F0）。AUC=2×（f0+f1+...+fn）-fn-f0；Net AUC=AUCsample-AUCAAPH+。

以上試驗均以Trolox 為標準品繪制標準曲線，計算各樣品抗氧化能力。設(shè)置3 次重復(fù)試驗。利用綜合抗氧化能力復(fù)合指數(shù)（Antioxidant potency composite index，APC）[23]對23 個柑橘品種抗氧化能力進行綜合評價。抗氧化方法測定結(jié)果中，抗氧化指數(shù)得分（APC 指數(shù)）=（樣品值/最高樣品值）×100，最終結(jié)果使用的APC 指數(shù)為4 種抗氧化方法APC 指數(shù)得分的平均值。

1.3 不同品種柑橘果實類黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.1 樣品制備 稱取23 個品種柑橘果實油胞層凍干粉各0.2 g，按料液比1∶20 加入80%乙醇，用超聲波清洗器超聲30 min（超聲頻率60 kHz，功率30 W）后，5 000 r/min 離心8 min，收集上清液。重復(fù)提取3 次，收集上清液。使用旋轉(zhuǎn)濃縮儀去除乙醇，用水溶液將梨形瓶中殘留物質(zhì)轉(zhuǎn)移至離心管中。使用固相萃取真空裝置，SPE Vac 12cc C18 柱（Waters，2g）經(jīng)活化（12 mL 甲醇）、平衡（12 mL 去離子水）、上樣、淋洗（100 mL 去離子水）、洗脫（10 mL 甲醇）5 個步驟，去除殘留物質(zhì)中糖酸等物質(zhì)。將所得去糖樣品置真空離心濃縮儀中，在30 ℃條件下濃縮得到粗提物粉末，存于4 ℃冰箱中，備用。

檢測時，稱取0.1 g 粗提物粉末溶于1 mL 色譜甲醇，充分溶解后使用一次性針頭式過濾器（孔徑0.22 μm）過濾，濾液加入液相小瓶中待用。

1.3.2 UPLC-Q-TOF-MS 檢測方法 UPLC 部分使用Waters UPLC 系統(tǒng)，配備FTN 自動進樣器，四元泵及UV 檢測器。使用C18 色譜柱（2.1 mm×150 mm）。液相色譜（LC）條件：進樣量3 μL；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；UV 檢測器設(shè)在280 nm；流動相：A 相為去離子水，B 相為色譜乙腈（流動相均經(jīng)30 min 超聲波清洗器脫氣模式脫氣），線性梯度程序：0 min：3% B；0～5 min：3%～7% B；5～23 min：7%～20% B；23～28 min：20%～30% B；28～40 min：30%～55% B；40～42 min：55%～100% B；42～43 min：100%～3% B；45 min：3% B。

質(zhì)譜使用AB Triple TOF 5600Plus系統(tǒng)。最佳MS 條件：氣體1（空氣）和氣體2（空氣）的壓力設(shè)定為50 psi（344 737.95 Pa），簾式氣體（N2）的壓力設(shè)定為35 psi（241 316.57 Pa）。負離子模式：源電壓-4.5 kV，源溫度550 ℃。正離子模式（ESI）：源電壓+5.5 kV，源溫度600 ℃。允許的最大誤差設(shè)置為±5 ppm。去聚集電位（DP）100 V；碰撞能量（CE）10 eV?；贗DA 的自動MS2在全掃描（1s）循環(huán)中針對8 種最強的代謝物離子進行掃描。前體離子和產(chǎn)物離子的m/z 掃描范圍分別設(shè)定為100～1 500 u 和50～1 500 u。對于MS/MS 采集模式，參數(shù)幾乎相同，只是將碰撞能量（CE）設(shè)置為（40 ±20）eV，離子釋放延遲（IRD）設(shè)置為67，離子釋放寬度（IRW）設(shè)置為25。精確質(zhì)量在使用自動校準傳遞系統(tǒng)進行分析前自動校準。

1.4 不同品種柑橘果實類黃酮含量測定

1.4.1 樣品制備 樣品制備方法同1.3.1 節(jié)。

1.4.2 UPLC 檢測方法 UPLC 體系：進樣量2 μL；柱溫25 ℃；流速0.3 mL/min；PDA 檢測器檢測280 nm 及330 nm；流動相：A 相為去離子水，B 相為色譜乙腈（流動相均經(jīng)30 min 超聲波清洗器脫氣模式脫氣），線性梯度程序同1.3.2 節(jié)。

1.4.3 標曲制作 精準稱取標準品，用甲醇溶解，配得1 mg/mL 母液。依次將母液對半稀釋，配制8個濃度梯度。使用上述UPLC 檢測方法，分別進樣。以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種柑橘果實油胞層總酚含量和抗氧化活性

23 個柑橘品種果實油胞層總酚含量與抗氧化活性比較見表1，不同品種的總酚含量和抗氧化活性存在顯著差異。不同品種柑橘果實油胞層總酚含量在4.38～21.10 mg GAE/g DW 之間，其中總酚含量最高品種為“桃葉橙”（21.10 mg GAE/g DW），“愛媛38” 總酚含量最低（4.38 mg GA/g DW）。

柑橘油胞層抗氧化活性各品種間差異顯著。DPPH 自由基清除能力較強的品種為 “桃葉橙”（40.11 mg TEAC/g DW），較弱的品種為“愛媛38”（5.28 mg TEAC/g DW）。在FRAP 方法中，抗氧化能力較強的品種為 “本地早”（18.46 mg TEAC/g DW），較弱的品種為 “沙田柚”（5.82 mg TEAC/g DW）。ORAC 方法中，抗氧化能力較強的為“新會甜橘”（194.25 mg TEAC/g DW），較弱的為“愛媛38”（26.39 mg TEAC/g DW）。ABTS 方法中，抗氧化能力較強的品種為 “新會甜橘”（31.67 mg TEAC/g DW），最弱的 為 “愛媛38”（4.93 mg TEAC/g DW）?？寡趸Я?fù)合指數(shù)分析表明（圖3），油胞層中抗氧化能力最強的品種為“本地早”（APC=96.25），最弱的品種為“愛媛38”（APC=18.54）。

圖3 23 個品種柑橘油胞層抗氧化效力復(fù)合指數(shù)Fig.3 APC Index in flavedo of 23 citrus cultivars

2.2 柑橘類黃酮UPLC 檢測體系的優(yōu)化

使用柑橘果實中具有代表性的類黃酮標準品對體系進行檢測，結(jié)果顯示：在280 nm 處，各標準品分離度較好。將標準品配成8 個濃度梯度后進行UPLC 檢測，以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到曲線R2均大于0.99，線性良好，表明本試驗用UPLC 體系可用于柑橘提取液的定量、定性檢測。

利用上述UPLC 體系建立的UPLC-Q-TOFMS 檢測方法，對23 個柑橘品種果實油胞層的黃酮類粗提物進行鑒定。共鑒定出5 種黃酮-C-糖苷，4 種黃酮-O-糖苷，12 種黃烷酮-O-糖苷，32種PMFs 在內(nèi)的53 種類黃酮（圖4 和表2）。

圖4 正離子模式下物質(zhì)1～53 出峰順序（280 nm）Fig4 .The peak number of substances 1-53 under positive ion mode（280 nm）

如表2 所示，鑒定出5 種黃酮-C-糖苷，鑒定物質(zhì)1 為新西蘭牡荊苷（Vicenin-2）；物質(zhì)2 為地奧司明-6，8-二-C-葡萄糖苷；物質(zhì)7 為根皮素-3'，5'-二-C-葡萄糖苷，對比已有文獻，該物質(zhì)是第1 次在柑橘中報道；物質(zhì)8 為地奧司明-6-C-葡萄糖苷；物質(zhì)17 為刺槐素-8-C-新橙皮苷。

鑒定出4 種黃酮-O-糖苷，即化合物6、11、14、18，分別鑒定為木犀草素-7-O-蕓香糖苷、野漆樹苷、新地奧司明、蘇打其亭C 或B。

鑒定出12 種黃烷酮-O-糖苷，按照出峰順序依次鑒定，物質(zhì)3 為圣草次苷，物質(zhì)4 為新圣草次苷，物質(zhì)5 為芹菜素-7-O-葡萄糖苷，物質(zhì)9 為柚皮蕓香苷，物質(zhì)10 為槲皮素-3-O-鼠李糖苷，物質(zhì)12 為柚皮苷，物質(zhì)13 為橙皮苷，物質(zhì)15 為新橙皮苷，物質(zhì)16 為地奧司明-O-葡萄糖苷，物質(zhì)19 為橙皮素-7-O-鼠李糖苷，物質(zhì)20 為香蜂草苷，物質(zhì)21 為枸橘苷。

共鑒定出32 種PMFs，通過判斷其特征性碎片離子，對比前人文獻中一級質(zhì)譜碎片、二級質(zhì)譜碎片、保留時間、出峰順序等信息，確定質(zhì)譜中物質(zhì)22、27、28、29 為單羥基-四甲氧基黃酮，物質(zhì)23、25、26、52 為單羥基-三甲氧基黃酮，物質(zhì)24為梔子黃素B，物質(zhì)30 為麥黃酮，物質(zhì)31 為三羥基二甲氧基黃酮，物質(zhì)23、25、26、52 為單羥基-五甲氧基黃酮，物質(zhì)33 為5，6，7，3'，4'-五甲氧基異黃酮，物質(zhì)34 為異甜橙黃酮，物質(zhì)38 為甜橙黃酮，物質(zhì)47 為橘皮素，物質(zhì)36 為四甲氧基黃酮，物質(zhì)37、49 為六甲氧基黃酮，物質(zhì)39 為四甲基-O-異黃芩素，物質(zhì)43 為四甲基-O-野黃芩素，物質(zhì)40 為二羥基三甲氧基黃酮，物質(zhì)41 為六-O-甲基棉黃素，物質(zhì)42 為川陳皮素，物質(zhì)44 為5，4'-二羥基-3，7，8，3'-四甲氧基黃酮，物質(zhì)45 為3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮，物質(zhì)46 為單羥基六甲氧基黃酮，物質(zhì)48 為6-O-去甲橘皮素/7-O-去甲橘皮素，物質(zhì)50 為5-羥基-6，7，8，3'，4'-五甲氧基黃酮，物質(zhì)53 為柚皮黃素。

本研究的物質(zhì)鑒定參考文獻[24]～[30]，對比已有文獻，有2 種類黃酮：根皮素-3'，5'-2-C-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖基己糖苷是第1 次在柑橘中報道。其中，根皮素-3'，5'-2-C-葡萄糖苷在蜜樹茶（Cyclopia intermedia）中被報道[31]；槲皮素-3-O-鼠李糖基己糖苷在澳洲蜜蜂（Tetragonula carbonaria）產(chǎn)出的蜂蜜中被報道[32]。

2.3 柑橘果實油胞層類黃酮組分的含量

以23 個柑橘品種果實為試驗材料，采用超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)鑒定其中主要的類黃酮。圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香蜂草苷、枸橘苷、野漆樹苷、麥黃酮、異甜橙黃酮、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素用標準品標定。在鑒定出的類黃酮中，PMFs 的定量以川陳皮素當量表示，其余無標準品的物質(zhì)以新橙皮苷當量表示。

對不同品種柑橘果實油胞層進行UPLC 定量分析發(fā)現(xiàn)，品種間類黃酮含量差異顯著。油胞層中檢測到53 種類黃酮，包括黃酮-C-糖苷類、黃酮-O-糖苷類、黃烷酮-O-糖苷類、PMFs 類；含量較多的組分為圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香蜂草苷和枸橘苷。橫向?qū)Ρ阮慄S酮含量，“代代” 中圣草次苷和新圣草次苷含量最高，分別為444.86 μg/g DW 和229.83 μg/g DW；“夏紅柑” 中柚皮蕓香苷含量最高為1 151.61 μg/g DW；“香拋”中柚皮苷含量最高為5 579.04 μg/g DW；“茂谷柑” 中橙皮苷含量最高為18 528.85 μg/g DW；“夏紅柑”中新橙皮苷含量最高為8 187.22 μg/g DW；“川紅橘” 中香蜂草苷含量最高為607.34 μg/g DW；“光皮金橘” 中枸橘苷含量最高為364.13 μg/g DW。

PMFs 中甜橙黃酮及川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素含量顯著高于其它PMFs 類物質(zhì)，橫向?qū)Ρ萈MFs 含量，“馬水橘” 中異甜橙黃酮含量最高為65.66 μg/g DW；“馬家柚”中甜橙黃酮含量最高為2289.23 μg/gDW；“茶枝柑” 中川陳皮素含量最高為2638.05 μg/g DW；“朱紅橘”中橘皮素含量和5-去甲川陳皮素含量最高，分別為378.74 μg/g DW 和152.23 μg/g DW。

分析油胞層中所含類黃酮種類和含量，將數(shù)據(jù)歸一化處理，做層次聚類分析。如圖5 所示，不同品種柑橘的類黃酮種類和含量差異明顯。橘類（“茶枝柑”“沙糖橘”“朱紅橘”和“川紅橘”）中橙皮苷含量較高，新橙皮苷含量較低，PMFs 種類和含量較多；橙類（“冰糖橙”“錦橙”“桃葉橙”和“廣橙”）中圣草次苷、新圣草次苷和橙皮苷含量較高，PMFs 種類和含量相似；柚類的“香拋”“馬家柚”和“沙田柚”聚為一類，其含有的類黃酮以新圣草次苷、柚皮苷和新橙皮苷為主，“馬家柚” 在柚類中PMFs 含量相對較高；金柑類的“光皮金橘”油胞層中主要類黃酮為根皮素-3'，5'-二-C-葡萄糖苷、圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、香蜂草苷和枸橘苷；“光皮金橘”和“佛手”與其它柑橘品種所含類黃酮含量差異較大。

圖5 23 個品種柑橘果實油胞層類黃酮含量的熱圖分析Fig.5 Heatmap analysis of flavonoids in the flavedo of 23 Citrus cultivars

3 討論

隨著生活水平的提高，果蔬的抗氧化活性成為大眾關(guān)注的熱點之一。錢井[33]測定35 個品種柑橘油胞層的總酚含量在11.52～27.55 mg GAE/g DW 范圍，而本研究所測柑橘油胞層總酚含量在4.38～21.10 mg GAE/g DW 范圍，二者結(jié)果相近。

不同抗氧化評價方法間存在差異，體外抗氧化評價常同時使用3～4 種抗氧化方法驗證。本研究使用APC 指數(shù)綜合評價不同品種柑橘的4 種抗氧化活性，結(jié)果顯示，柑橘果實油胞層抗氧化能力最強的品種為“本地早”，抗氧化能力最弱的品種為“愛媛38”。

采用UPLC-Q-TOF-MS 和UPLC 技術(shù)，對23 個品種柑橘果實油胞層類黃酮進行鑒定，發(fā)現(xiàn)油胞層中類黃酮的種類及含量十分豐富。有研究表明，PMFs 物質(zhì)只在油胞層中被檢測到，造成這種差異的原因可能是油胞層中有豐富的油腺體，便于類黃酮，尤其是PMFs 類化合物的合成、轉(zhuǎn)運和貯藏[34]。

通過分析各品種柑橘油胞層類黃酮物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)柚類中柚皮苷含量高于其它種類柑橘，橙皮苷含量雖極微，但檢測出16.99～445.50 mg/g DW 的新橙皮苷。結(jié)合柚類中廣泛分布的高含量柚皮苷，推測柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷可作為鑒別柚類和其它類柑橘的標志性物質(zhì)。區(qū)別于其它柚類（香拋、沙田柚等），馬家柚油胞層中有多種PMFs，造成這種差異的原因可能是馬家柚油胞層具有許多凸起的油腺體顆粒，便于PMFs 的合成、貯藏和轉(zhuǎn)運。具有橘、柚雜交遺傳背景的夏紅柑也含有高含量的柚皮苷。對橘類和雜柑類柑橘品種進行分析發(fā)現(xiàn)，橙皮苷與新橙皮苷含量呈負相關(guān)。在橘類中橙皮苷含量較高，而新橙皮苷含量極微或檢測不到，推測新橙皮苷與橙皮苷在柑橘中作為標志性物質(zhì)存在或存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。

4 結(jié)論

測定了23 個柑橘品種果實包括單果質(zhì)量、可食率、可溶性固形物在內(nèi)的基本生理指標。比較分析了23 個柑橘品種果實油胞層的抗氧化活性及總酚含量。在23 個柑橘品種油胞層中，共鑒定出53 種類黃酮，包括5 種黃酮-C-糖苷，4 種黃酮-O-糖苷，12 種黃烷酮-O-糖苷和32 種PMFs，這些類黃酮的種類和含量在不同品種間、果實不同部位間均存在差異。以25 種組分為特征性物質(zhì)，將所收集的柑橘品種聚類為橙類、柚類、橘類及雜柑類。

柑橘家族存在較為復(fù)雜的親緣關(guān)系，而果實中所含類黃酮可為柑橘品種進化提供鑒別依據(jù)。由于質(zhì)譜的局限性，無法確定甲氧基及羥基連接的具體位點，后續(xù)研究可通過與核磁共振的碳譜、氫譜聯(lián)用確定物質(zhì)的具體分子結(jié)構(gòu)。另外，進一步收集更多的柑橘種質(zhì)資源，對其類黃酮物質(zhì)進行鑒別與研究，選取相關(guān)性較大的類黃酮繪制品種鑒定圖譜，構(gòu)建信息庫，為柑橘進化的推演和資源的綜合利用提供理論依據(jù)。