楊建偉 李宗艷 馮 堯 任書(shū)嫻 胡夢(mèng)露 葉松菩

（西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650224）

石斛屬（Dendrobium）全球約1 000 種，我國(guó)74種2 變種［1］。束花石斛（Dendrobium chrysanthum）在我國(guó)分布于廣西西部、貴州南部、云南南部、西藏東南部等地［1］。隨著人們對(duì)野生石斛資源滅絕性的采挖及對(duì)其生境的破壞，野生資源日漸枯竭。國(guó)家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2021 年第15 號(hào)公告中已經(jīng)將石斛屬所有種列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》，其中，束花石斛被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物［2］。我國(guó)石斛屬資源豐富，花色、花型變異種類多，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。束花石斛花色鮮黃、開(kāi)花數(shù)量多、是鮮有的秋季開(kāi)黃花的石斛種類，具有重要的育種和觀賞價(jià)值［3］。然而，目前其種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用不多，截至2021年底，以該種為親本的雜交登錄品種僅有2個(gè)［4］。

繁育特性是蘭科（Orchidaceae）植物保育的基礎(chǔ)，大部分蘭科植物的繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和［5］。與其他蘭科種類相比，石斛屬植物具有較高的自交不親和性，Johansen［6］對(duì)61個(gè)石斛蘭原種進(jìn)行自花授粉試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)72%的原種自花授粉后不育。石斛蘭自交不親和種的數(shù)量幾乎占到蘭科植物自交不親和物種的一半，近年在石斛自交不親和的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子機(jī)制研究領(lǐng)域取得一些突破。束花石斛的交配系統(tǒng)屬于自交不親和型（SI），Niu 等［7］調(diào)查26 種石斛人工自花和異花授粉結(jié)實(shí)率，并觀察其授粉后花粉管生長(zhǎng)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有4類自交不親和花粉管生長(zhǎng)形態(tài)類型，束花石斛自交后花粉管在花柱頂端就停止了生長(zhǎng)。進(jìn)一步的組學(xué)分析表明，與薔薇科（Rosaceae）、茄科（Solanaceae）和車前科（Plantaginaceae）植物SI 的作用機(jī)制不同，蘭科植物中不存在基于S基因座核酸酶（S-RNase）類型的自交不親和的同源基因，束花石斛配子體自交不親和（GSI）不屬于S-RNase不親和型［8-9］。Nilsson［10］基于蘭科傳粉生物學(xué)研究表明，多數(shù)蘭科植物的結(jié)實(shí)率低下，石斛屬植物在自然情況下結(jié)實(shí)率低［11］，人工栽培下如何精確授粉，提高束花石斛的結(jié)實(shí)率，具有現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)意義和保育價(jià)值。

授粉是否結(jié)實(shí)取決于物種自交親和性、花粉活力、柱頭可授性和環(huán)境條件［12］，準(zhǔn)確掌握物種的花粉活力和柱頭可授性發(fā)育規(guī)律，做到精確授粉是提高授粉結(jié)實(shí)率的關(guān)鍵。有關(guān)蘭科植物花粉和柱頭發(fā)育特點(diǎn)研究，目前集中在有較高觀賞價(jià)值的種類。有報(bào)道表明，球花石斛（D. thyrsiflorum）花粉離體萌發(fā)率為53.3%［13］；玫瑰石斛（D.crepidatum）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、細(xì)莖石斛（D.moniliforme）花粉活力分別可達(dá)80.0%、83.5%、84.0%［14］；其他蘭科材料中，蝴蝶蘭‘天香公主’（Phalaenopsis‘Tianxiang’）花 粉 染 色 率 僅 為33.06%，多花指甲蘭（Aerides rosea）和‘綠肉餅’兜蘭（Paphiopedilum pacific）花粉活力可達(dá)60.0%和59.99%［15-17］。柱頭發(fā)育成熟關(guān)系到花粉的識(shí)別和水合過(guò)程，蘭科植物柱頭的黏液基質(zhì)中含有大量的分泌細(xì)胞，研究表明，成熟柱頭表面含有的過(guò)氧化物酶（POD）、H2O2等影響花粉的識(shí)別過(guò)程［18］。通常對(duì)柱頭成熟度的快速診斷依據(jù)聯(lián)苯胺—過(guò)氧化氫染色確定［19］，對(duì)球花石斛、蝴蝶蘭‘天香公主’、‘綠肉餅’兜蘭檢測(cè)后在開(kāi)花3 d、10～15 d、10～20 d 時(shí)，柱頭過(guò)氧化氫酶活性最大［13，15，17］。目前還沒(méi)有關(guān)于束花石斛花粉活力、柱頭可授性變化規(guī)律的相關(guān)報(bào)道，相關(guān)研究的開(kāi)展，能夠?yàn)槠渚_授粉提供指導(dǎo)。

本項(xiàng)目通過(guò)開(kāi)展束花石斛開(kāi)花習(xí)性、花粉生活力、柱頭分泌特性、柱頭可授性、人工授粉特性研究，旨在揭示其繁育基礎(chǔ)生物學(xué)特性，為其人工科學(xué)地授粉和雜交提供合理依據(jù)，為其擴(kuò)繁及資源保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

束花石斛引種于云南保山、西雙版納、德宏，種植于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園的蘭花種質(zhì)資源圃（25°4′1″N，102°45′56″E，海拔1 947.42 m，年平均溫度15.6 ℃），生長(zhǎng)狀況良好。試驗(yàn)于2021 年4—11 月開(kāi)展，自然結(jié)實(shí)的束花石斛蒴果材料來(lái)源于保山，果實(shí)成熟后取下稱量質(zhì)量，干燥散粉后收集部分進(jìn)行種子形態(tài)觀察和種子活力測(cè)定，余下在室溫干燥環(huán)境中貯藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 開(kāi)花習(xí)性及花器官特性測(cè)定

束花石斛花期形態(tài)指標(biāo)和觀測(cè)方法參照姜艷等的方法［13］，觀察來(lái)自3 個(gè)種源地的植株開(kāi)花習(xí)性，每個(gè)種源地以20 株為一個(gè)群體，群體花期統(tǒng)計(jì)從群體始花期至末花期的時(shí)長(zhǎng)（見(jiàn)表1）。每種源地隨機(jī)抽取的10 個(gè)束花石斛個(gè)體進(jìn)行形態(tài)觀測(cè)，花數(shù)量性狀指標(biāo)包括中萼片、花瓣、唇瓣高寬、子房長(zhǎng)度、柱頭腔長(zhǎng)寬和花粉塊長(zhǎng)寬。花的質(zhì)量性狀指標(biāo)包括花色、瓣質(zhì)、瓣形、有無(wú)被毛、合蕊柱和藥帽色澤。

表1 束花石斛開(kāi)花期觀測(cè)指標(biāo)及觀察方法Table 1 Observation indexes and methods of anthesis of D.chrysanthum

1.2.2 花粉活力檢測(cè)

采用TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法進(jìn)行束花石斛花粉活力檢測(cè)，根據(jù)束花石斛單花壽命，花粉活力取樣時(shí)間分別定為開(kāi)花第1、2、3、5、7、9、11天，10：00 隨機(jī)采集5 朵同一開(kāi)花時(shí)間的花粉塊作1 個(gè)混合樣本，重復(fù)取樣3 次，將樣本搗碎后進(jìn)行染色觀察，染色參閱李紫薇等的方法［20］，每個(gè)開(kāi)花時(shí)期的花粉制片3 張，每張隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。紅色花粉計(jì)為有活力，不著色或著黃色計(jì)為無(wú)活力。

花粉活力=有活力的花粉/觀察花粉總數(shù)×100%

1.2.3 柱頭可授性檢測(cè)

從開(kāi)花第1 天開(kāi)始連續(xù)觀察記錄5 個(gè)柱頭隨開(kāi)花時(shí)間延長(zhǎng)黏液的分泌情況，在開(kāi)花第1、2、3、5、7、9、11 天，10：00 隨機(jī)采取的5 個(gè)柱頭，進(jìn)行聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫檢測(cè)柱頭可授性，方法參閱姜艷等［13］的方法，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 人工授粉

在晴天10：00 以后進(jìn)行人工同株異花和自花授粉，分別進(jìn)行去雄套袋、在單花開(kāi)后第4 天進(jìn)行同一植株同花和異花授粉，授后套袋，每個(gè)種群授粉10朵，授粉前后3 d不澆水。授粉后觀察花形態(tài)變化，若成功授粉，個(gè)體2周后花朵形態(tài)正常，唇瓣漸萎蔫，子房膨大。

1.2.5 種實(shí)發(fā)育觀測(cè)

從保山種源地獲得束花石斛成熟蒴果8個(gè)，經(jīng)表面清潔稱量質(zhì)量，在干燥果莢裂開(kāi)后，取等體積種子混合后進(jìn)行測(cè)定。①種子形態(tài)觀測(cè)：隨機(jī)選取30 粒種子，使用目鏡顯微尺測(cè)量種子長(zhǎng)和寬。②種胚發(fā)育程度觀察：制片10張，每張片子隨機(jī)選取5 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)種子數(shù)量和有胚種子數(shù)量，種子成胚率=胚發(fā)育完整的種子數(shù)/觀察種子總數(shù)×100%。③種子活力測(cè)定：TTC 染色檢測(cè)方法和活力判斷方法同上，制片10 張，每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，種子生活力=有活力的種子數(shù)/觀察種子總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 進(jìn)行種子大小的變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析。變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值。對(duì)花粉活力進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），若P＜0.05，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 束花石斛開(kāi)花習(xí)性及花器官特性

在昆明溫室栽培條件下的束花石斛花期為8—10 月，花芽萌動(dòng)期為19 d，現(xiàn)蕾期為23 d；始花期10 月1 日，盛花期10 月13 日，末花期為10 月29日；單花壽命最長(zhǎng)15 d，最短10 d，均值12.4 d；群體花期28 d（見(jiàn)表2）。

表2 束花石斛開(kāi)花期觀測(cè)指標(biāo)結(jié)果Table 2 Charcters observed during flowering period of D.chrysanthum

束花石斛于當(dāng)年生枝條上開(kāi)花，花與葉對(duì)生，1～5 朵單花聚生（見(jiàn)圖1A）?；ǔ术r黃色；花萼和花瓣質(zhì)地較厚，光滑呈蠟質(zhì)；中萼與側(cè)萼大小一致，卵圓形，邊緣全緣，先端鈍圓起兜（見(jiàn)圖1B），萼片高1.9～2.4 cm，寬1.3～1.5 cm（見(jiàn)圖1D）?；ò瓯容嗥源?，卵圓形，形態(tài)與萼片一致，高2.2～2.5 cm，寬1.5～1.8 cm（見(jiàn)圖1D）。唇瓣鮮黃色，扁球形，表面背面被毛，唇瓣邊緣呈流蘇狀，瓣基部有兩個(gè)對(duì)生的紅棕色卵圓形斑塊（見(jiàn)圖1B），唇瓣高1.5～1.8 cm，寬1.9～2.2 cm（見(jiàn)圖1D）。合蕊柱黃色（見(jiàn)圖1C），藥帽淡黃色（見(jiàn)圖1C），子房長(zhǎng)4.5～5.9 cm（圖1C）。柱頭腔長(zhǎng)方形，長(zhǎng)3.13 mm，寬3.02 mm，花粉塊長(zhǎng)2.74 mm，寬2.37 mm，10塊花粉塊重0.012 g（見(jiàn)圖1C）（見(jiàn)表3）。

圖1 束花石斛開(kāi)花枝條和花形態(tài)特征A.開(kāi)花枝條；B.花朵形態(tài)；C.蕊柱結(jié)構(gòu)；D.花瓣及萼片；a.左花瓣；b.中萼片；c.右花瓣；d.左側(cè)萼片；e.唇瓣；f.右側(cè)萼片；g.藥帽；h.花粉塊；i.子房和柱頭Fig.1 Characteristics of flowering branches and flower morphology of D.chrysanthum.A.Flowering stems；B.Flower pattern；C.Column pillar structure；D.Petals and sepals；a.Left petal；b.Middle sepal；c.Right petal；d.Left sepal；e.Labellum；f.Right sepal；g.Medicine cap；h.Pollen mass；i.Ovary and stigma

表3 束花石斛花部各器官大?。ㄆ骄怠罉?biāo)準(zhǔn)誤差）Table 3 Organ size of the D.chrysanthum flower

2.2 束花石斛花粉活力變化

由表4 可知，花粉活力第1～3 天分別為89.9%（見(jiàn)圖2A）、90.4%、89.7%（見(jiàn)圖2B）。第5 天活力下降為76.4%，第7天為60.8%（見(jiàn)圖2C），第9天花粉活力僅有23.7%，第11 天為6.5%（見(jiàn)圖2D）。束花石斛在前3 d 內(nèi)花粉活性一直處于高水平，差異不顯著，從開(kāi)花第5 天開(kāi)始花粉活力依次下降，與前3 d 的差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。由此可知，束花石斛的花粉開(kāi)花前4 d 活性較高，花粉水合后的萌發(fā)率也應(yīng)較高。

圖2 束花石斛花粉TTC染色效果A.開(kāi)花第1天；B.開(kāi)花第3天；C.開(kāi)花第7天；D.開(kāi)花第11天；a.未被染色（無(wú)活力）花粉粒；b.被染色（有活力）花粉粒Fig.2 TTC staining effect of Pollen of D.chrysanthum A.Pollen staining on the first day of flowering；B.Pollen staining on the third day of flowering；C.Pollen staining on the 7th day of flowering；D.Pollen staining on the 11th day of flowering；a.Unstained（inactive）pollen grains；b.The pollen grains are dyed（alive）

2.3 束花石斛柱頭腔成熟特性

束花石斛的柱頭腔的成熟度與分泌物量變化有關(guān)。束花石斛開(kāi)花第2 天以后柱頭開(kāi)始有分沁物（見(jiàn)圖3A），在第4天時(shí)分泌物填滿柱頭腔（見(jiàn)圖3B），在第6 天時(shí)，分沁物量達(dá)到最大，凸出柱頭腔，呈水晶透亮狀（見(jiàn)圖3C）。

采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法對(duì)束花石斛柱頭活性檢測(cè)，根據(jù)圖3所示，束花石斛開(kāi)花1 d的柱頭有少量氣泡，顏色變化甚微（見(jiàn)圖3D）；開(kāi)花3 d 的柱頭有氣泡產(chǎn)生，顏色變化有所增強(qiáng)（圖3E）；開(kāi)花5 d 的柱頭有大量氣泡產(chǎn)生，且顏色變化極其明顯，過(guò)氧化氫酶活性較高（見(jiàn)圖3F）；開(kāi)花7 d以上的柱頭氣泡量變少，且染色變藍(lán)較淺（見(jiàn)圖3G），到開(kāi)花第11 天時(shí)，柱頭已經(jīng)沒(méi)有氣泡，染色也未變藍(lán)（見(jiàn)圖3H）。過(guò)氧化氫酶的活性隨著開(kāi)花時(shí)間呈現(xiàn)由弱變強(qiáng)再變?nèi)醯内厔?shì)，在開(kāi)花4～6 d時(shí)柱頭過(guò)氧化氫酶活性最高，暗示柱頭可授性較強(qiáng)（見(jiàn)表4）。

圖3 束花石斛柱頭腔成熟度隨開(kāi)花時(shí)間變化的情況A.剛開(kāi)始有分泌物的柱頭腔；B.被分泌物填滿的柱頭腔；C.分泌物凸出柱頭腔；D-H分別為開(kāi)花第1、3、5、7、11天經(jīng)聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫染色后的柱頭腔（箭頭指示處）Fig.3 Changes of stigma maturity with flowering time of D.chrysanthum A.Stigma of exudate at the beginning of drug chamber；B.Stigma that fills the chamber with secretions；C.Stigma of exudate protruding from the chamber；D-H were the stigmata stained by benzidine-hydrogen peroxide on the 1，3，5，7 and 11 d of flowering，respectively（Arrow point）

表4 束花石斛花粉活力及柱頭可授性檢測(cè)結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 4 Pollen viability and stigma receptivity of D.chrysanthum

2.4 自花授粉結(jié)實(shí)情況

去雄套袋未見(jiàn)結(jié)實(shí)，束花石斛不存在無(wú)融和生殖。試驗(yàn)中選取花朵開(kāi)放4 d 的花粉和柱頭進(jìn)行人工同株異花和自花授粉，共授粉30 朵?；ǘ涫诜酆蟮? 天開(kāi)始，花瓣逐漸向中間閉合，唇瓣逐漸皺縮，子房及萼片慢慢變黃，在7～10 d內(nèi)全部萎蔫，同株異花和自花授粉結(jié)實(shí)率皆為0。

2.5 束花石斛種子形態(tài)和活力

蒴果發(fā)育成熟后，表皮呈灰綠色，圓柱狀，外部有3 條凸起的棱，果實(shí)質(zhì)量2.02～4.83 g，平均質(zhì)量3.64 g，果實(shí)長(zhǎng)度6.5～7.3 cm（見(jiàn)圖4A）。

束花石斛的種子與大多數(shù)蘭科植物種子一樣，呈粉塵狀，小而多，黃色（見(jiàn)圖4B），整體呈狹長(zhǎng)船形，種子無(wú)胚乳，胚位于種子中央，呈卵狀。種子長(zhǎng)0.628～0.845 mm，均值0.728 mm，變異系數(shù)為7.4%；寬0.082～0.113 mm，均值0.093 mm，變異系數(shù)為8.5%；種子長(zhǎng)寬比為7.798（見(jiàn)表5）。經(jīng)過(guò)顯微觀察，其種子成胚比高達(dá)97.35%，經(jīng)過(guò)TTC染色法鑒定，新鮮的束花石斛種子生活力高達(dá)90.80%，干燥室溫保存6 個(gè)月的束花石斛種子生活力達(dá)73.20%（見(jiàn)表5），說(shuō)明自然狀態(tài)下授粉結(jié)果的束花石斛種子胚發(fā)育良好，生活力強(qiáng)且在室溫狀態(tài)下可維持一定時(shí)間（見(jiàn)圖4）。

圖4 束花石斛果實(shí)、種子形態(tài)及種子活性檢測(cè)結(jié)果A.成熟果實(shí)；B.新鮮的種子；C.物鏡10×倍顯微鏡下的種子；D.TTC染色后的種子；a.無(wú)胚種子；b.有胚種子；c.未被染色（無(wú)活力）種子；d.被染色（有活力）種子Fig.4 Results of fruit and seed morphology and seed activity detection of D.chrysanthum A.Ripe fruit；B.Fresh seeds；C.Seeds under an objective microscope of 10×；D.TTC dyed seeds；a.Embryos；b.Embryos；c.Undyed（inactive）seeds；d.Dyed（active）seeds

表5 束花石斛種子形態(tài)及活力檢測(cè)結(jié)果Table 5 Seed morphology and vigor test results of D.chrysanthum

3 討論

3.1 束花石斛的生物學(xué)特征

研究發(fā)現(xiàn)束花石斛單花壽命最長(zhǎng)只有15 d，平均單花壽命為12.4 d，且其在開(kāi)花第1 天時(shí)花粉活力就已經(jīng)非常高，開(kāi)花以后的前3 d 花粉活力都接近90%，然后隨開(kāi)花時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。其他蘭科植物中，球花石斛、鼓槌石斛單花壽命分別為7～10 d［13］、12 d［21］，屬于花期較短的類型，二者的花粉成熟快，在初開(kāi)時(shí)活力就達(dá)到最大。而兜蘭［15，22］、國(guó)蘭［19］、大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）［19］等花期較長(zhǎng)的種，花粉的活力通常在開(kāi)花中期才能達(dá)到最大，因此推測(cè)蘭科植物花粉發(fā)育規(guī)律與開(kāi)花期的長(zhǎng)短有關(guān)。本試驗(yàn)中采用TTC 檢測(cè)束花石斛的花粉活力與鄧茜玫［23］萌發(fā)法測(cè)得的56.2%差距較大，推測(cè)是由離體萌發(fā)條件所致。蘭科植物屬于濕柱頭，其柱頭的黏液基質(zhì)中含有大量的分泌細(xì)胞，可能與識(shí)別過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)［24］。柱頭發(fā)育成熟關(guān)系到花粉的識(shí)別和水合過(guò)程，研究表明，成熟柱頭表面的過(guò)氧化物酶（SOD、POD、H2O2等）和酯酶的活性達(dá)到最高［25-26］。依據(jù)柱頭分泌規(guī)律可判斷其發(fā)育狀況和可授性，如蝴蝶蘭‘天香公主’開(kāi)花當(dāng)天可看見(jiàn)柱頭分泌黏液，隨著開(kāi)花天數(shù)的增加，柱頭黏性減弱，透明度減弱［15］。束花石斛開(kāi)花后第6天時(shí)黏液分泌量最多，呈水晶透亮狀，與蝴蝶蘭‘天香公主’的分泌規(guī)律不同。目前蘭科植物中已經(jīng)報(bào)道了柱頭黏液分泌特性的不多，本研究以黏液分泌特性與聯(lián)苯胺染色相結(jié)合，從表型上確定束花石斛柱頭可授性，對(duì)束花石斛人工授粉時(shí)機(jī)的選擇提供直觀的指導(dǎo)。

本次試驗(yàn)用的束花石斛由其他地方引入載種，昆明地區(qū)并非束花石斛原產(chǎn)地。云南麻栗坡地區(qū)栽種的長(zhǎng)距石斛（D. longicornu）自交不結(jié)實(shí)而異交結(jié)實(shí)，但在深圳種植則自交和異交均不結(jié)實(shí)。在麻栗坡地區(qū)，長(zhǎng)距石斛自交不親和是因?yàn)榛ǚ酃茉诨ㄖ习氩糠稚L(zhǎng)停止，而深圳地區(qū)的是因?yàn)榛ǚ酃鼙荒铙w包被阻礙花粉管萌發(fā)生長(zhǎng)，膜狀物可能通過(guò)阻礙花粉管的生長(zhǎng)，從而對(duì)不適應(yīng)的環(huán)境產(chǎn)生拮抗［7，27］。Niu 等［7］連續(xù)2 年進(jìn)行束花石斛自花授粉，2015 年自交結(jié)實(shí)率為0，2016年為3%，株內(nèi)自花和異花授粉的結(jié)實(shí)率為零，而兩年異花授粉的結(jié)實(shí)率均為100%。生境的改變可能也會(huì)影響蘭科植物授粉后的結(jié)實(shí)率，束花石斛自交試驗(yàn)中未結(jié)實(shí)可能由樣本生境改變導(dǎo)致。課題組在進(jìn)行束花石斛人工授粉時(shí)因?yàn)闆](méi)有足夠的開(kāi)花樣本支持，加之各種源地植株花期不遇，未進(jìn)行異株之間的授粉。

3.2 束花石斛的繁育系統(tǒng)

蘭科植物雌雄蕊發(fā)育同步性影響其交配系統(tǒng)，對(duì)物種的雌雄蕊發(fā)育狀況進(jìn)行觀測(cè)，有利于其繁育系統(tǒng)的科學(xué)判斷，對(duì)人工雜交授粉期確定也尤為重要。石斛屬的繁育系統(tǒng)多樣，有異交親和、異交和自交都親和、自交親和。異交物種具有雌雄蕊空間異構(gòu)、雌雄蕊異熟、花粉自交不親和等特性［28］。球花石斛在花初開(kāi)時(shí)，花粉活力就達(dá)到最大，而柱頭發(fā)育則要晚于花粉成熟期，研究表明，人工異花授粉時(shí)球花石斛結(jié)實(shí)，同花授粉不能結(jié)實(shí)［13，29］。在報(bào)道的自交結(jié)實(shí)的石斛種類中，重唇石斛（D.hercoglossum）花開(kāi)第5～12天花粉萌發(fā)較高，柱頭在開(kāi)花6～8 d 后成熟，屬于雌雄同熟，但自交結(jié)實(shí)率極低［30］。井岡山地區(qū)產(chǎn)的鐵皮石斛（D.officinale），在開(kāi)花第3天的花粉活力可達(dá)到90%，柱頭可授性同時(shí)達(dá)到最高，人工自交結(jié)實(shí)僅為22%［31］。其他已研究的蘭科植物中，雌雄同熟的長(zhǎng)瓣兜蘭（Paphiopedilum dianthum），人工自花授粉、同株異花授粉和異株授粉皆可結(jié)實(shí)［22］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，束花石斛單花期較短，群體花期較整齊，柱頭發(fā)育稍晚于花粉，雖然在柱頭發(fā)育成熟的階段，花粉還能保持較高活性，但人工株內(nèi)自花和異花授粉卻表現(xiàn)不親和，李樂(lè)興［32］認(rèn)為其配子體的不親和可能與DC-ADK2基因表達(dá)有關(guān)，牛善策［27］研究推測(cè)是花柱特異表達(dá)基因TRINITYDN31133_c0_g1_i2（編碼鋅指蛋白）與花柱特異表達(dá)基因Dch2-RALF的互作結(jié)果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)部分植物激素存在與自交不親和反應(yīng)緊密相關(guān)的濃度變化。

交配方式對(duì)石斛蘭結(jié)實(shí)率會(huì)有影響。目前已報(bào)道的自交和異交皆親和的石斛種有：金釵石斛（D.nobile）、大苞鞘石斛（D.wardianum）、腫節(jié)石斛（D. pendulum）、玫瑰石斛、王亮石斛（D. wangliangii）、長(zhǎng)蘇石斛（D. brymerianum）；球花石斛、兜唇石斛（D. aphyllum）、長(zhǎng)距石斛的交配系統(tǒng)為異交［9，21，33］。王 亮 石 斛 的 自 交 結(jié) 實(shí) 率 高 于 異 交 結(jié)實(shí)［11］。Pang 等［34］發(fā)現(xiàn)夾江石斛（D.jiajiangense）自交亦親和，但人工授粉的種子生活力低于自然結(jié)實(shí)的種子。目前，有學(xué)者從基因選擇和資源投入不同的角度對(duì)植物交配系統(tǒng)形成的機(jī)制進(jìn)行初步闡述。有關(guān)自交親和的生態(tài)機(jī)制，Busch 等［35］從基因流層面總結(jié)分析，自交可減少缺乏有效傳粉者造成的生殖失敗和能量損耗，增加了物種傳播優(yōu)勢(shì)和維持種群數(shù)量。Bartareau［36］以自交不親和的D.monophyllum為例，通過(guò)3 年的試驗(yàn)數(shù)據(jù)研究表明，避免自交親和是在權(quán)衡吸引傳粉者的投入和結(jié)實(shí)成本投資條件下，形成適應(yīng)性進(jìn)化。束花石斛在野生狀態(tài)下能成功結(jié)實(shí)，且種子成胚率和活力都較高，說(shuō)明其在原生環(huán)境下不缺乏傳粉者，具有完善的異交傳粉機(jī)制。

4 結(jié)論

束花石斛的花粉在花初開(kāi)時(shí)就已經(jīng)達(dá)到最大活力，而柱頭發(fā)育要滯后于花粉的發(fā)育，屬于雌蕊后熟的類型，不存在無(wú)融和生殖。人工自花授粉不育，但自然狀況下能正常結(jié)實(shí)，種子發(fā)育良好，胚活力較高。作為育種親本材料，花粉采集的時(shí)間為開(kāi)花后1～3 d，柱頭在開(kāi)花后第5天左右，具有較高的授粉親和力。本研究揭示了束花石斛的開(kāi)花生物學(xué)特性和雌雄蕊異熟特點(diǎn)，其交配系統(tǒng)應(yīng)為自交不親和，為其野生種質(zhì)資源的保育和人工精準(zhǔn)授粉提供科學(xué)依據(jù)。