胡夏宇 劉玉萍 蘇 旭，3* 楊 萍 王亞男

（1. 青海師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008；2. 青海師范大學(xué)，高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810016；3. 青海師范大學(xué)，青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實驗室，西寧 810008）

苦豆子（Sophora alopecuroides）又名苦甘草、歐苦參，是豆科（Fabaceae）苦參屬（Sophora）的一種多年生草本植物［1］，主要分布于我國西北、華北等地［2］，尤其新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海、山西、寧夏、陜西、河北8 個省區(qū)是其適宜生長區(qū)［3］；此外，俄羅斯、阿富汗、伊朗、土耳其、巴基斯坦和印度北部也有少量分布［1］?？喽棺油ǔＩL于海拔1 000～2 000 m 的荒漠、半荒漠地區(qū)［4］，具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒、耐鹽堿、抗風(fēng)沙等特性，是我國西北荒漠、半荒漠地區(qū)重要的防風(fēng)固沙植物［5］。

研究表明，苦豆子富含蛋白質(zhì)、生物堿、揮發(fā)油及黃酮類化合物［6］，根、莖、葉和種子均可入藥，具有重要的藥用價值［7-8］，亦可作為優(yōu)質(zhì)畜牧業(yè)飼料［8］，同時也是我國西北荒漠草原的一種重要蜜源植物［8-9］。迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于苦豆子的研究主要集中于其生物學(xué)特性［1，10］、耐逆生理［5，11］、遺傳多樣性［11-12］、根際微生物［13］、化學(xué)成分［14］、藥用價值［7-8］、飼用價值［8，15］、種質(zhì)資源［16］以及資源化利用途徑［10，17］等，然而目前對苦豆子染色體形態(tài)與數(shù)目以及核型特征的研究較少［18-21］。

染色體是真核生物遺傳信息的載體，其形態(tài)、數(shù)目和結(jié)構(gòu)是較為穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征，不易受外界環(huán)境變化而改變。染色體核型是細(xì)胞染色體組有絲分裂中期時的表型，如染色體數(shù)目、大小、形態(tài)等特征；染色體核型分析即是從細(xì)胞水平上對染色體的形態(tài)特征進(jìn)行認(rèn)真描述和研究［22］。已有研究表明，通過對植物染色體長度、長短臂比等數(shù)量特征的測量以及對著絲點(diǎn)位置、隨體有無等質(zhì)量特征的判別，可為有效推斷植物物種的系統(tǒng)位置、親緣關(guān)系乃至同一物種不同居群間的系統(tǒng)進(jìn)化提供強(qiáng)有力的細(xì)胞學(xué)證據(jù)［23］，同時對植物種質(zhì)資源保護(hù)及遺傳育種和新品種選育也具有重要指導(dǎo)作用［24］。目前，國內(nèi)外諸多學(xué)者利用植物染色體常規(guī)壓片技術(shù)對豆科植物的染色體核型進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探討，取得了卓著的成效［25-26］。如孔紅等［25］通過對豆科銀砂槐（Ammodendron bifolium）和鹽豆木（Halimodendron halodendron）2 種荒漠植物染色體核型研究，發(fā)現(xiàn)銀砂槐染色體類型為正中部著絲點(diǎn)染色體和中部著絲點(diǎn)染色體2種類型，核型屬1A 型；鹽豆木染色體類型為中部著絲點(diǎn)染色體、近中部著絲點(diǎn)染色體和近端部著絲點(diǎn)染色體3種類型，核型屬2A 型，鹽豆木核型較銀砂槐核型進(jìn)化。楊萍［26］分析甘草屬（Glycyrrhiza）4個物種的核型時，發(fā)現(xiàn)4種甘草的染色體數(shù)目均為2n=2x=16，核型類別為1A 型，光果甘草（G.glabra）最進(jìn)化、甘草（G. uralensis）與脹果甘草（G. inflata）較進(jìn)化且親緣關(guān)系較近、刺果甘草（G.pallidiflora）最原始。有學(xué)者［18，20-21］通過對苦豆子染色體核型的分析表明，苦豆子染色體核型公式為2n=2x=36=26m+8sm+2st，核型類型為2A 型，而朱必才等［19］的研究卻得出不同的結(jié)論。關(guān)于我國西北荒漠地區(qū)的優(yōu)勢物種苦豆子的染色體數(shù)目、形態(tài)以及核型類型的研究至今仍沒有獲得一致結(jié)論，也鮮見從群體水平對苦豆子進(jìn)行染色體核型特征及親緣關(guān)系的報道。據(jù)此，本研究采用常規(guī)染色體壓片技術(shù)，對苦豆子不同居群的染色體數(shù)目和核型特征進(jìn)行綜合分析，系統(tǒng)探討其核型差異及親緣關(guān)系，旨在為今后苦豆子群體遺傳學(xué)、基因組學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)的研究提供細(xì)胞學(xué)方面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

苦豆子不同居群的成熟種子采自甘肅武威市、寧夏銀川市及內(nèi)蒙古阿拉善盟與鄂爾多斯市。憑證標(biāo)本保存于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（QTPMB），詳細(xì)采樣信息見表1。

表1 試驗材料及來源Table 1 Experimental materials and sources

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)

從苦豆子各參試居群中篩選10 個個體，每個個體中挑選10粒成熟飽滿的種子。將種子放入冰箱于-20 ℃低溫處理24 h。在培養(yǎng)皿底部平鋪雙層濾紙并用蒸餾水濕潤至有水析出時，將低溫處理后的種子均勻放置于培養(yǎng)皿中（同一個體的種子放于1 個培養(yǎng)皿中）。最后，將放有種子的培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，待根長至0.5～1.0 cm時，進(jìn)行取樣。

1.2.2 預(yù)處理

剪下的苦豆子根尖放入預(yù)先用蒸餾水潤濕的2.0 mL 離心管中，保持離心管內(nèi)外濕潤。然后打開管蓋并將其置于盛有N2O 的密封罐中，壓強(qiáng)設(shè)為0.55 MPa，處理130 min。

1.2.3 固定與解離

從密封罐中取出離心管后，迅速加入卡諾氏固定液（V（冰乙酸）∶V（無水乙醇）=1∶3，現(xiàn)配現(xiàn)用）。然后蓋緊管蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，使根尖組織與固定液充分接觸。放入冰箱中于4 ℃固定10 min以上，將固定好的根尖用體積分?jǐn)?shù)45%乙酸解離5 min。

1.2.4 染色與壓片

參照費(fèi)昭雪等［27］的方法，將解離好的根尖置于載玻片中央，用刀片切除多余部分，僅留下根尖頂端分生組織。滴1滴改良石炭酸品紅溶液，染色7～8 min。用蓋玻片將組織蓋壓并用鑷子后端敲擊使組織充分分散。隨后將載玻片懸于酒精燈火焰上微烤，使組織區(qū)域水分迅速蒸發(fā)。用濾紙覆于蓋玻片上，拇指垂直向下按壓，除去蓋玻片與載玻片間的空隙，使細(xì)胞充分分散并與玻片緊密貼合，便于觀察。

1.2.5 觀察與拍照

制作好的染色體裝片置于熒光顯微鏡（Olympus BX53，日本）下觀察，選擇細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色體分散、形態(tài)清晰的染色體拍照。

1.2.6 核型數(shù)據(jù)分析

每個居群選取至少3 張清晰完整的根尖染色體中期分裂圖，參照鄧愛輝等［28］方法確定染色體數(shù)目，利用Adobe Photoshop 2019 軟件統(tǒng)計每個個體的染色體數(shù)目，測量各染色體長、短臂長度［29］，并將這些原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 中，依據(jù)Levan 等［30］方法計算染色體相對長度（RL）、長度比（CLR）、臂比（AR）等參數(shù)，依據(jù)李懋學(xué)等［31］方法進(jìn)行核型分析，依據(jù)Kuo等［32］方法計算相對長度系數(shù)（I.R.L），依據(jù)Arano［33］方法計算核型不對稱系數(shù)（As.K%），依據(jù)Stebbins［34］方法對每個居群的染色體核型進(jìn)行分類。

1.2.7 核型進(jìn)化趨勢和聚類分析

利用Excel 軟件繪制苦豆子核型不對稱性程度散點(diǎn)圖，即核型二維進(jìn)化圖，參照邢世巖等［35］方法進(jìn)行核型進(jìn)化趨勢分析；利用SPSS 26軟件統(tǒng)計苦豆子染色體臂比平均值（MAR）、方差、相對長度方差、染色體長度比（CLR）和正中部著絲粒（M）、中部著絲粒（m）、近中部著絲粒（sm）或近端部著絲粒（st）染色體比例等參數(shù)，依據(jù)李曉莉等［36］方法進(jìn)行聚類分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 苦豆子不同居群染色體數(shù)目和倍性

通過對苦豆子不同居群有絲分裂中期染色體數(shù)目與形態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)苦豆子居群的染色體倍性均為二倍體，數(shù)目為2n=2x=36，參試居群中未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目和形態(tài)變異（見圖1），表明苦豆子染色體數(shù)目和形態(tài)較為穩(wěn)定。

圖1 苦豆子有絲分裂中期染色體Fig.1 Mitotic chromosomes in metaphase of S.alopecuroides

2.2 苦豆子不同居群染色體形態(tài)特征和類型

根據(jù)苦豆子染色體核型參數(shù)，將其36 條染色體進(jìn)行同源染色體配對，共獲得18 對；染色體類型包括m 和sm 兩種，除居群3 具有m 和sm 兩種類型外，其余參試居群僅具有m 類型（見表2）。依據(jù)染色體相對長度系數(shù)及Kuo 等［32］分類標(biāo)準(zhǔn)，苦豆子各參試居群染色體可以被劃分為長染色體L 型（≥1.26）、中長染色體M2型（1.01～1.25）、中短染色體M1型（0.76～1.00）和短染色體S 型（＜0.76）4 種類型；除居群3 無S 型染色體外，其余居群均包含以上4 種類型染色體（見表2）。

表2 苦豆子不同居群染色體參數(shù)Table 2 Chromosome parameters in different populations of S.alopecuroides

續(xù)表2 Continued toble 2

續(xù)表2 Continued toble 2

2.3 苦豆子不同居群染色體核型分析

苦豆子不同居群染色體核型模式圖和核型參數(shù)見圖2 和表3。由表3 可知，苦豆子不同居群的染色體核型類型有1A、3A 和2B 三種，其中居群3為3A 型、居群5 和13 為2B 型、居群17、19 和43 為1A 型；就苦豆子染色體長度比而言，居群13 的長度比最大（2.19），居群3的長度比最?。?.72）；在染色體平均臂比上，居群3 的平均臂比最大（1.37），居群19 的平均臂比最小（1.19）；就核不對稱系數(shù)來說，居群3 的核不對稱系數(shù)最大（57.17%），表明該居群的染色體核型對稱性最差，居群19 的核不對稱系數(shù)最?。?4.30%），表明該居群的染色體核型對稱性最好。因此，這些結(jié)果說明苦豆子各參試居群間的染色體核型差異較為明顯。

表3 苦豆子不同居群核型比較Table 3 Karyotype comparison in different populations of S.alopecuroides

圖2 苦豆子不同居群染色體核型模式Fig.2 Chromosome idiograms in different populations of S.alopecuroides

2.4 苦豆子不同居群染色體核型進(jìn)化趨勢分析

本研究結(jié)果表明，苦豆子染色體核型呈“雙向進(jìn)化趨勢”，即苦豆子有些居群沿染色體平均臂比方向進(jìn)化較快，如居群3（甘肅武威）；另一些居群則沿染色體長度比方向進(jìn)化較快，如居群13（內(nèi)蒙古阿拉善）（見圖3A）。就苦豆子居群的染色體核型總體進(jìn)化趨勢而言，二維圖右上方苦豆子居群通常具有較高的進(jìn)化程度，而左下方苦豆子居群往往進(jìn)化程度較低，因而認(rèn)為苦豆子居群19（內(nèi)蒙古鄂爾多斯）的進(jìn)化程度較低，居群3 的進(jìn)化程度相對較高（見圖3A）。同樣，基于苦豆子居群染色體平均臂比和核型不對稱系數(shù)，發(fā)現(xiàn)苦豆子居群總體沿二維圖右上角方向進(jìn)化，其中居群3的染色體平均臂比和核型不對稱系數(shù)最大，表明進(jìn)化程度較高；而居群19 的染色體平均臂比和核型不對稱系數(shù)最小，說明進(jìn)化程度較低（見圖3B）。因此，本研究認(rèn)為苦豆子居群19的起源較早，進(jìn)化程度較低，而居群3的起源較晚，進(jìn)化程度較高（見圖3）。

圖3 苦豆子不同居群染色體核型進(jìn)化趨勢Fig.3 Evolutionary trend of chromosome karyotypes in different populations of S.alopecuroides

2.5 苦豆子不同居群染色體核型聚類分析

苦豆子居群染色體核型聚類分析表明，當(dāng)遺傳距離為1 時，苦豆子6 個參試居群聚集為4 個分支，其中居群5（甘肅武威）和13（內(nèi)蒙古阿拉善）聚為C分支，居群19（內(nèi)蒙古鄂爾多斯）和43（內(nèi)蒙古鄂爾多斯）聚為E 分支，居群3（甘肅武威）、17（寧夏銀川）分別聚為D 分支和F 分支；而當(dāng)遺傳距離為11 時，苦豆子6 個參試居群則聚集為2 大分支，居群3、5和13聚為A分支，居群17、19和43聚為B分支（見圖4）。

圖4 苦豆子不同居群染色體核型聚類分析Fig.4 The clustering analysis of chromosome karyotypes in different populations of S.alopecuroides

3 討論

本研究結(jié)果顯示，苦豆子不同居群的染色體數(shù)目均為36 條，2n=2x=36，為二倍體植物，各參試居群染色體均未見隨體存在，這與先前學(xué)者報道的結(jié)果［18-19，21］一致。然而，陳荃等［20］在對2 種豆科荒漠植物駱駝刺（Alhagi sparsifolia）和苦豆子進(jìn)行染色體觀察時，發(fā)現(xiàn)苦豆子的同一根尖材料中存在2n=34、33 的異數(shù)染色體，推測可能是壓片時用力不均導(dǎo)致染色體重疊或散出細(xì)胞外而造成。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)苦豆子居群3的染色體核型公式為2n=2x=36=35m+1sm，而其他5 個居群的核型公式均為2n=2x=36=36m，這與先前朱必才等［19］和牛凱等［21］的研究結(jié)果有所不同，朱必才等［19］研究發(fā)現(xiàn)苦豆子的染色體核型公式為2n=2x=36=8sm+28m，牛凱等［21］認(rèn)為新疆地區(qū)苦豆子的染色體核型公式為2n=2x=36=26m+8sm+2st。據(jù)此，認(rèn)為同一物種為了適應(yīng)不同的生長環(huán)境條件，其在染色體形態(tài)上會發(fā)生變化產(chǎn)生差異，這是染色體形態(tài)多樣化的表現(xiàn)，也是植物適應(yīng)環(huán)境條件長期演化的結(jié)果［37］。因此，苦豆子不同居群染色體形態(tài)差異對其今后引種馴化、遺傳育種和新品種選育具有重要參考價值。

通過對苦豆子6個參試居群染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)苦豆子的染色體類型有m 和sm 兩種，絕大多數(shù)類型為m 型，屬于較對稱性染色體；核型類型有1A、3A 和2B 三種；染色體核不對稱系數(shù)介于54.30%～57.17%，長度比為1.72～2.19，平均臂比為1.10～1.83，6個參試居群的進(jìn)化程度由高到低依次為P03、P43、P13、P05、P17、P19，我們認(rèn)為苦豆子在染色體長度比和平均臂比上存在“雙向進(jìn)化趨勢”。先前研究表明，植物的進(jìn)化程度與其環(huán)境適應(yīng)性和豐產(chǎn)性具有密切關(guān)系［38］，通常表現(xiàn)為植物對環(huán)境的適應(yīng)性越強(qiáng)其進(jìn)化程度越高［39］。因此，我們推測苦豆子所有參試居群中，居群3（甘肅武威）應(yīng)對外界環(huán)境具有最強(qiáng)的適應(yīng)性，可以作為將來苦豆子引種馴化和優(yōu)良新品種選育的重要種質(zhì)資源。此外，研究認(rèn)為植物染色體核型聚類分析可以直觀反映不同物種或同一物種不同居群間的遺傳分化和親緣關(guān)系［40］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離為11時，苦豆子6個參試居群聚集為A和B兩大分支，其中A 分支包括居群3、居群5 和居群13，表明這3 個居群具有較近的親緣關(guān)系；B 分支包括居群17、居群19 和居群43，說明它們彼此間親緣關(guān)系較近。基于苦豆子采樣信息數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)苦豆子不同居群間的親緣關(guān)系與其地理距離遠(yuǎn)近不具有相關(guān)性，其主要與生境相似度有關(guān)，這為今后苦豆子種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用提供了重要理論依據(jù)。總之，本研究從居群水平探討了苦豆子的染色體核型類型、特征、進(jìn)化程度及不同居群間的親緣關(guān)系，為將來更多荒漠植物不同居群的染色體核型研究提供了一個典型案例。