蘇才美，文 瑤

(廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

三白草(Saururuschinesis(Lour.)Baill)是三白草科多年生草本植物，味甘、辛，性寒，有著清熱解毒、利尿消腫等功效[1]。三白草藥理作用包括抗炎、抗氧化、降血糖及抗腫瘤活性等[2,3]，化學(xué)成分為多糖、揮發(fā)油、木脂素、生物堿和黃酮類化合物等[4]。文獻(xiàn)報(bào)道，三白草提取物均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性[5]。三白草作為中藥材之一，但對(duì)其的研究與其他藥材相比較少，其藥理作用的研究還有待發(fā)展。因此，為了提高三白草多糖的提取率，本文采用微波輔助水提法提取三白草多糖，響應(yīng)面法優(yōu)化其提取條件。多糖粗品經(jīng)DEAE和G-75柱純化獲得三白草多糖。通過α-葡萄糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)估三白草多糖的降血糖能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

三白草：購于安徽省毫州市，4 ℃保藏備用。

G-75、DEAE，匯研生物科技有限公司；阿卡波糖，阿拉??；α-葡萄糖苷酶，源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參考李珊等[6]的方法，配制質(zhì)量濃度為 0.4 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取 10 μL，20 μL，30 μL，40 μL，50 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于ep管中，用蒸餾水分別補(bǔ)足成 100 μL，加5%的苯酚溶液 0.1 mL，加濃硫酸溶液 0.5 mL，測(cè)定吸光度，平行3次。以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.6815X-0.014(R2=0.9979)。

1.2.2 三白草多糖提取及含量測(cè)定

稱取 2 g 三白草，進(jìn)行超聲提取，離心，取濾液，濃縮至 3 mL。調(diào)節(jié)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)至80%，冷藏 12 h，離心，棄上清液，加入Sevag試劑除蛋白，離心，取上層溶液得到粗多糖溶液，苯酚-硫酸法顯色。在最合適波長處測(cè)定吸光度，平行3次。利用下式計(jì)算三白草多糖的提取率。

W=C×V×N/M×100%

(1)

式中：W為三白草多糖的提取率，%；N為稀釋倍數(shù)；C為多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；M為三白草質(zhì)量，mg。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1)最佳液料比的選擇

選擇液料比為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 mL/g，調(diào)節(jié)微波功率至 260 W，微波提取 60 s；

2)最佳微波時(shí)間的選擇

選擇微波時(shí)間為 30 s，60 s，90 s，120 s，150 s，180 s，液料比為上述實(shí)驗(yàn)選出的最佳值，微波功率為 260 W；

3)最佳微波功率的選擇

選擇微波功率為 220 W，340 W，460 W，580 W，700 W，液料比和微波時(shí)間為上述實(shí)驗(yàn)選出的最佳值。

1.2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

綜合單因素實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果，以Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)原理為依據(jù)，采用響應(yīng)面法在三因子三水平上對(duì)三白草多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 普通水提法

稱取 2 g 三白草粉末，以25∶1 mL/g的液料比加入一定量的熱水，提取 90 s，采用苯酚—硫酸法顯色，測(cè)定提取率。

1.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取 2 g 三白草藥材粉末，按照響應(yīng)面優(yōu)化得出的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，離心，收集上清液，經(jīng)過醇沉，除蛋白后，濃縮，取 0.1 mL 于ep管中，苯酚-硫酸法顯色，測(cè)定吸光度，平行3次。

1.2.7 粗多糖的分離純化

參考葛智超等[7]方法，取 15 mL 樣品溶液上樣于DEAE纖維柱。先后用蒸餾水和梯度氯化鈉進(jìn)行洗脫。采用苯酚—硫酸法示蹤，繪制洗脫曲線，不同的峰分開收集。

將上述溶液收集，濃縮干燥得到樣品。取 50 mL 樣品上柱于G-75柱，調(diào)節(jié)流速為 0.5 mL/min，用蒸餾水進(jìn)行水洗。采用苯酚—硫酸法示蹤，繪制洗脫曲線，不同的峰分開收集。

1.2.8 降血糖活性試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)方法[8]，將所有樣品或阿卡波糖(40 μL，0～3200 μg/mL)與α—葡萄糖苷酶(40 μL，0.2 U/mL)于細(xì)胞板中混合并在 37 ℃ 下烘箱孵化 5 min，將PNPG(20 μL，10 mM)加入到混合溶液中繼續(xù)在 37 ℃ 下反應(yīng) 30 min，加入碳酸鈉(100 μL，0.1 mol/L)終止反應(yīng)，在 405 nm 下測(cè)定吸光度，抑制率計(jì)算公式如下：

式中：As為樣品溶液、α-Glucosidase和PNPG混合溶液的吸光度；Ab為樣品溶液和PNPG混合溶液的吸光度；A0為α-Glucosidase和PNPG混合溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比的影響

由圖1可得知，多糖提取率的變化趨勢(shì)。三白草多糖提取率在比值為25∶1 mL/g前，隨著液料比的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。液料比為25∶1 mL/g時(shí)，多糖提取率達(dá)到峰值0.72%，與其他組差異顯著(P<0.05)，隨后再增加液料比多糖提取率反而有下降趨勢(shì)。因此，選用液料比25∶1 mL/g進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 液料比對(duì)三白草多糖提取率的影響

2.1.2 微波時(shí)間的影響

由圖2可知，多糖提取率的變化趨勢(shì)。當(dāng)微波時(shí)間在30～90 s 的范圍內(nèi)，三白草多糖提取率與微波時(shí)間呈正相關(guān)性，隨其增加而增加，峰值出現(xiàn)在 90 s 時(shí)，提取率為1.02%，與其他組差異顯著(P<0.05)。在峰值后提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選用微波時(shí)間 90 s 為最佳條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 微波時(shí)間對(duì)三白草多糖提取率的影響

2.1.3 微波功率的影響

由圖3可知，多糖提取率的變化趨勢(shì)。當(dāng)微波功率在220～460 W 內(nèi)，微波功率的上升，三白草多糖的提取率也逐漸升高，并在 460 W 處有峰值，此時(shí)的多糖提取率為1.98%，與其他組差異顯著(P<0.05)，隨后微波功率的上升不會(huì)導(dǎo)致提取率繼續(xù)增高，反而有所降低。因此，選用微波功率 460 W 為最佳條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 微波功率對(duì)三白草多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

根據(jù)表1的結(jié)果，采用Design Expert 8.06軟件對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，從而得到三白草多糖提取率(Y)對(duì)液料比(A)，微波時(shí)間(B)和微波功率(C)的回歸方程為：Y=2.38+0.13A+0.038B+0.051C-0.12AB-0.089AC+0.084BC-0.62A2-0.25B3-0.11C2。得到的方差分析結(jié)果如表2所示。

表2 方差分析

由表2看出，該回歸模型的P值為0.0035，因?yàn)镻值<0.05時(shí)，所以認(rèn)為該模型顯著，模型失擬項(xiàng)為0.5328，當(dāng)該項(xiàng)>0.05時(shí)，可認(rèn)為失擬項(xiàng)不顯著。由表2中看出，對(duì)三白草多糖的提取率的影響具有一定的顯著性的是液料比，而時(shí)間與功率則沒有。根據(jù)表2中A、B、C對(duì)應(yīng)的F值可得，液料比>時(shí)間>功率是影響三白草多糖提取率的三個(gè)單因素的影響順序。

表2 方差分析

圖4、圖5、圖6分別為液料比、微波時(shí)間及微波功率中的任意一個(gè)變量為0時(shí)，其它兩個(gè)變量對(duì)三白草多糖提取率的交互作用影響。

圖4 液料比和微波時(shí)間對(duì)三白草多糖提取率的影響

圖5 液料比和微波功率對(duì)三白草多糖提取率的影響

圖6 微波時(shí)間和微波功率對(duì)三白草多糖提取率的影響

由圖4～圖6看出，液料比和微波時(shí)間的響應(yīng)面的曲面最陡，說明相對(duì)于其他兩個(gè)因素的交互作用而言，AB交互作用對(duì)三白草多糖提取率的影響較大。這與方差分析結(jié)果表的數(shù)據(jù)一致。由圖4～圖6可以看出，液料比的等高線最為密集，所以液料比對(duì)三白草多糖提取率的影響最為明顯，其次是微波時(shí)間，微波功率是對(duì)三白草微波提取多糖影響最小的因素。此結(jié)果也與方差分析結(jié)果一致。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過響應(yīng)面軟件對(duì)數(shù)據(jù)的分析優(yōu)化，確定液料比25∶1 mL/g，微波時(shí)間 90 s，微波功率 460 W 為本實(shí)驗(yàn)的最佳優(yōu)化條件參數(shù)，三白草多糖理論提取率可達(dá)到2.57%。在此最佳條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際得到的平均提取率為2.51%，此結(jié)果與響應(yīng)面的回歸方程所得的理論值一致性較高，表明此條件可行性高。與普通水提法的0.9%提取率相比，優(yōu)化效果良好。

2.4 三白草粗多糖的分離純化

由圖7可看出，水洗部分，得到兩個(gè)峰，表明分離得到兩個(gè)組分，記為：SP-1和SP-2。鹽洗部分得到三個(gè)峰，表明分離得到三個(gè)組分，記為：SP-3，SP-4和SP-5。水洗所得到的組分的量較少。對(duì)于鹽洗的組分，選擇量最高的SP-3進(jìn)行下一步的純化。

圖7 三白草多糖DEAE-纖維柱的洗脫曲線

將上述獲得的SP-3經(jīng)過Sephadex G-75層析柱的分離純化，得到如圖8所示的洗脫曲線，可以得出洗脫出來的組分較為單一，證明了SP-3經(jīng)過純化后，得到的是較純多糖。

圖8 三白草多糖Sephadex G-75的洗脫曲線

2.5 三白草多糖降血糖活性

由圖9可看出，當(dāng)SP-3最高抑制率為91.61%，此時(shí)SP-3的質(zhì)量濃度為 3.2 mg/mL，說明該多糖具有明顯抑制α—葡萄糖苷酶的活性。SP-3的IC50值為 0.002 mg/mL，小于阿卡波糖(0.003 mg/mL)，說明三白草多糖的降血糖作用高于陽性藥阿卡波糖。

圖9 三白草多糖體外對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲線

3 結(jié)論

本研究探討了三白草多糖的最佳微波輔助提取工藝參數(shù)及其降血糖活性。結(jié)果表明，三白草多糖的最佳提取條件為液料比 25 mL/g、微波時(shí)間 90 s、微波功率 460 W。在該條件下得到的三白草多糖提取率為2.57%，與普通水提法相比，提取率有所提高。采用DEAE與G-75柱純化得到三白草精多糖。此外，降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三白草IC50值小于阿卡波糖，即三白草多糖對(duì)α—葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為三白草多糖的提取以及日后的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。